基于不同加鹽量和腌制時(shí)間對(duì)臘魚肉品質(zhì)的影響

汪曉瑜，趙利，白春清，陳麗麗，袁美蘭，江勇

1. 國家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心（南昌 330013）；2. 江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（南昌 330013）

草魚是我國重要的淡水魚類，其肉質(zhì)鮮嫩，口感醇厚。草魚作為我國淡水魚之首，其產(chǎn)量占我國淡水魚總產(chǎn)量的1/5左右，在2020年達(dá)557.11萬 t[1]。數(shù)十年間，中國淡水魚養(yǎng)殖產(chǎn)量位于全球第一，主要是中國近些年水產(chǎn)動(dòng)物營養(yǎng)與飼料研究水平提升，為淡水魚提供充足飼料[2]。

腌制技術(shù)是魚肉常見發(fā)酵手段之一，腌制魚肉研究更是屢見不鮮。張鶴[3]以大黃魚為研究對(duì)象，采取不同鹽度及溫度下進(jìn)行腌制，并與采用傳統(tǒng)方法腌制得到的大黃魚加以對(duì)照，探究腌魚肉理化指標(biāo)變化規(guī)律。結(jié)果顯示，隨著食鹽用量的增加及溫度升高，樣品的TVB-N值較高。葉路漫[4]以濕腌為試驗(yàn)基礎(chǔ)，研究冷凍金鯧魚在不同腌制溫度、鹽濃度、魚肉風(fēng)干溫度及風(fēng)干時(shí)間下最佳的加工工藝條件。結(jié)果表明，冷凍金鯧魚在腌制溫度10 ℃、腌制鹽濃度8%、風(fēng)干溫度40 ℃、風(fēng)干時(shí)間72 h時(shí)可得最優(yōu)制品。

以草魚肉為研究對(duì)象，考察其在不同鹽濃度（6%，8%和10%）及不同腌制時(shí)間（0，2，4和6 d）時(shí)的水分、總酸含量、色澤、組胺含量、粗蛋白含量、揮發(fā)性鹽基氮及氨基酸態(tài)氮含量、肌原蛋白含量、羰基價(jià)含量、亞硝酸鹽含量及總巰基含量，探究加鹽量及腌制時(shí)間對(duì)臘魚肉理化性質(zhì)的影響，為后續(xù)臘魚肉加工生產(chǎn)提供技術(shù)及理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮草魚、食用鹽（均購自經(jīng)開區(qū)樂買佳超市）。

1.2 試驗(yàn)試劑

鹽酸（西隴科學(xué)股份有限公司）；亞硝酸鈉（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；氯仿（Fluka）；氯化鈉（西隴科學(xué)股份有限公司）；EDTANa2（北京索拉比奧科技有限公司）；三氯乙酸（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；DNPH（上海阿拉丁生化科技有限公司）；鹽酸胍（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙酸乙酯（上海試劑一廠）；磷酸組胺（Shanghai Macklin Biochemical Co.，Ltd.）；正戊醇（北京伊諾凱科技有限公司）；對(duì)硝基苯胺（北京伊諾凱科技有限公司）；氯化鉀（西隴科學(xué)股份有限公司）；硼酸（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；硫酸銅（西隴科學(xué)股份有限公司）；硫酸鉀（西隴化工股份有限公司）；95%乙醇（西隴科學(xué)股份有限公司）；SDS（西隴科學(xué)股份有限公司）；氧化鎂（上海展云化工有限公司）。

1.3 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

WSC-S色差計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；ZF-A1000電子分析天平（福州華志科學(xué)儀器有限公司）；TGL-18M高速冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；U-T6A紫外可見分光光度計(jì)[屹譜儀器制造（上海）有限公司]；SPX-100B-Z恒溫培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；DK-S26恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；Sorvall EVOLUTION RC落地式高速冷凍離心機(jī)（賽默飛世爾科技實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)品）；IKA分散機(jī)（深圳市三莉科技有限公司）；PHS-3C精密pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；LS171色差儀（深圳市林上科技有限公司）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 臘魚的制備

新鮮魚塊制備：選擇質(zhì)量在2~3 kg的新鮮草魚，去腮、去皮、去鱗、去內(nèi)臟、去脊椎骨和頭，清洗后瀝干，切成3 cm×3 cm×2 cm塊狀。

腌魚魚塊制備：將切成塊狀的新鮮魚肉分別添加6%，8%和10%食用鹽，腌制時(shí)間2，4和6 d。腌制后進(jìn)行烘干，烘干過程采用三段式晾干法，第1階段是發(fā)酵階段，即高溫烘干65 ℃下4 h，此階段目的讓魚肉在高溫下充分發(fā)酵，保證臘魚香味形成；第2階段是減速干燥的發(fā)色期和收縮定型期，50 ℃下烘干5 h，此時(shí)臘魚肉顏色逐漸變深，魚肉收縮干結(jié)，為了避免硬殼出現(xiàn)，每隔2 h進(jìn)行翻轉(zhuǎn)；最后階段是干燥階段，在58 ℃下烘干12 h。

1.4.2 臘魚肉水分的測(cè)定

水分測(cè)定采用GB 5009.3—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》中直接干燥法。

1.4.3 臘魚肉總酸的測(cè)定

總酸參照GB/T 12456—2008《食品酸度的測(cè)定》[5]。

1.4.4 臘魚肉白度的測(cè)定

白度（whiteness，W）測(cè)定參考姜啟興等[6]的方法，取魚背部縱切樣品，放入測(cè)色色差計(jì)中測(cè)定樣品的L*、a*、b*值。魚肉白度按式（1）計(jì)算。

式中：W為魚肉白度，L*為亮度，a*為紅度，b*為黃度。

1.4.5 臘魚肉組胺含量的測(cè)定

參考GB 5009.208—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中生物胺的測(cè)定》中第二法分光光度計(jì)法進(jìn)行。

1.4.6 臘魚肉粗蛋白、揮發(fā)性鹽基氮、氨基酸態(tài)氮含量測(cè)定

粗蛋白含量的測(cè)定采用凱氏定氮法，揮發(fā)性鹽基氮含量采用半微量定氮法進(jìn)行，氨基酸態(tài)氮含量采用甲醛滴定法。

1.4.7 臘魚肉肌原蛋白、羰基、總巰基、二硫鍵的含量測(cè)定

肌原蛋白含量測(cè)定：稱取4 g攪碎后的魚肉樣，加入10倍緩沖溶液A混均（緩沖溶液A為0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液，含有0.1 mol/L NaCl、0.001 mol/L EDTANa2，pH 7.0），按1 000 r/min勻漿15 s，4 ℃下以5 000 r/min離心10 min收集下層沉淀。繼續(xù)加入5倍體積緩沖液A，相同條件離心收集沉淀。重復(fù)上述操作2次，沉淀加入緩沖液B（0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液，含有1 mol/L NaCl，pH 7.0），勻漿后冰水浴2 h，上清液即為肌原蛋白，過濾收集上清液。計(jì)算結(jié)果采用雙縮脲法。

羰基含量測(cè)定：參考Oliver等[7]的方法，將提取得到的肌原蛋白液溶于0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH 6.0）中，調(diào)整蛋白液最終質(zhì)量濃度2 mg/mL。取1 mL的2 mg/mL樣液于離心管中，加入1 mL 0.01 mol/L 2, 4-二硝基苯肼，靜置反應(yīng)1 h，加入1 mL 20% TCA溶液，按10 000 r/min離心5 min，棄去上清液，接著用體積比1︰1的1 mL乙酸乙酯-乙醇清洗沉淀3次，加入3 mL 6 mol/L鹽酸胍溶液，37 ℃水浴20 min，除去不溶物質(zhì)。取上清液以10 000 r/min離心3 min，波長370 nm下測(cè)吸光度。

總巰基含量測(cè)定：參考Benjakul等[8]的方法，取1 mL 4 mg/mL肌原蛋白液于10 mL離心管，每支管各加入9 mL的0.2 mol/L Tris-HCl緩沖溶液混勻（緩沖溶液為8 mol/L尿素、2% SDS、10 g EDTA，pH 6.8），空白管用0.6 mol/L的KCl代替，取4 mL混合液加入0.4 mL 0.1% DTNB（0.2 mol/L Tris-HCl，pH 8.0）混勻，40 ℃水浴靜置25 min，在波長412 nm處測(cè)吸光度，吸光系數(shù)按照13 600 L/（mol·cm）計(jì)算，巰基含量（nmol/mg）按式（2）計(jì)算。

式中：A為吸光度；n為稀釋倍數(shù)；ε為摩爾吸光系數(shù)；ρ為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.4.8 臘魚肉亞硝酸鹽含量測(cè)定

參考GB 5009.33—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》中分光光度計(jì)法進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 臘魚肉水分測(cè)定

新鮮草魚肉水分較高，腌制后的魚肉由于烘干及腌制過程中食鹽的滲入，水分總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。由圖1可知，第0~第2天臘魚肉水分下降速率較大，第2~第6天不同鹽濃度下臘魚肉水分基本呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。鹽濃度6%和10%時(shí)，第4天相較于第2天水分上升8%~10%，水分上升幅度較大，第6天相比于第4天水分有小幅上升。鹽濃度8%時(shí)，水分先降低后升高，在第6天時(shí)的水分與鹽濃度10%時(shí)接近。臘魚高溫烘干過程會(huì)導(dǎo)致魚肉蛋白質(zhì)失活變性，蛋白質(zhì)分子持水能力下降，導(dǎo)致更多的水分流失[9]。

2.2 臘魚肉總酸含量測(cè)定

總酸含量表示的是食品中氫離子含量的高低，總酸含量的多少直接影響食品品質(zhì)、風(fēng)味特征及穩(wěn)定性，測(cè)定臘魚肉中總酸度可以衡量其成熟度和新鮮度。由圖2可看出，隨著腌制時(shí)間延長，臘魚肉總酸含量呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)，加鹽量不同其總酸含量也有差異，即加鹽量越高，其總酸含量越低?？偹岷康纳哒f明臘魚肉在發(fā)酵過程中的代謝活動(dòng)使得腌制液總酸度升高。魚肉在食品工業(yè)生產(chǎn)中，總酸含量過高會(huì)影響食品的口感，因此需要嚴(yán)格控制腌制類肉制品發(fā)酵時(shí)間。

圖2 不同鹽濃度下臘魚肉總酸含量隨時(shí)間變化

2.3 臘魚肉色澤測(cè)定

魚肉經(jīng)過宰殺貯藏一段時(shí)間后會(huì)由表面的深紅色逐漸變?yōu)闇\褐色，魚肉色澤相關(guān)指標(biāo)對(duì)魚肉食用及品質(zhì)雖無顯著相關(guān)性，但消費(fèi)者可以通過色澤直觀感受魚肉品質(zhì)，因此色澤是評(píng)價(jià)肉類食品的感官指標(biāo)之一。由表1可看出，隨著加鹽量和腌制時(shí)間的延長，相較于對(duì)照組臘魚，樣品組L*（亮度）值和a*值（紅度）都呈現(xiàn)顯著降低趨勢(shì)（P＜0.05），b*值（黃度）無顯著變化。腌制時(shí)間相同時(shí)，隨著加鹽量增加，L*值（亮度）無顯著影響（P＞0.05），a*值（紅度）和b*（黃度）值隨著鹽濃度的增加而顯著降低（P＜0.05），W（白度）整體呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)（P＜0.05）。

表1 不同加鹽量和腌制時(shí)間下的色澤變化

2.4 臘魚肉組胺含量測(cè)定

水產(chǎn)品發(fā)酵過程產(chǎn)生的各種生物胺中，組胺對(duì)人類健康的影響最大[10]，具有氨基酸脫羧活性的微生物在組胺產(chǎn)生過程中發(fā)揮至關(guān)重要作用[11]。由圖3可知，隨著腌制時(shí)間延長，組胺含量逐漸升高，鹽濃度6%時(shí)組胺含量最高，且組胺含量與鹽濃度大小成反比。第0天時(shí)的組胺含量就形成較大差異，這可能是由于加鹽量的不同對(duì)宰殺后的魚肉組胺產(chǎn)生迅速造成影響，第2~第6天組胺含量仍持續(xù)增加。組胺的形成是由于臘魚在腌制發(fā)酵過程中微生物代謝或者細(xì)菌生長生成的組胺脫羧酶使魚體內(nèi)的組胺酸脫羧生成組胺，其反應(yīng)原理如圖4所示[12]，新鮮魚體由于未進(jìn)行捕獲，不足以提供組胺生成所需的環(huán)境，因此其體內(nèi)的組胺含量可以忽略不計(jì)。

圖3 不同鹽濃度下臘魚肉組胺含量隨時(shí)間變化

圖4 組胺的生成原理

2.5 臘魚肉粗蛋白、揮發(fā)性鹽基氮、氨基酸態(tài)氮含量測(cè)定

魚肉粗蛋白含量豐富，富含各種人體所需的氨基酸，且易被人體消化吸收，新鮮魚肉粗蛋白含量在15%~25%。由圖5可看出，第0天時(shí)不同鹽濃度下的臘魚肉粗蛋白含量無明顯差異，第0天后出現(xiàn)明顯差異。隨著腌制時(shí)間的延長，粗蛋白含量顯著下降，在第4~第6天下降速率最快，且加鹽量越大臘魚肉粗蛋白含量也越高。粗蛋白含量的降低是由于魚肉腌制過程中蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生不同程度變性，有一部分蛋白質(zhì)會(huì)在酶和微生物作用下生成肽類和氨基酸殘基，同時(shí)腌制品鹽濃度過高會(huì)產(chǎn)生較多的亞硝酸鹽不利于人體身體健康，因此在食品加工生產(chǎn)中應(yīng)該嚴(yán)格控制微生物生長。

圖5 不同鹽濃度下臘魚肉粗蛋白含量隨時(shí)間變化

揮發(fā)性鹽基氮是衡量食品腐敗變質(zhì)的重要指標(biāo)，它描述的是食品在微生物、酶等的作用下蛋白質(zhì)降解氧化成氨基酸、肽類等小分子物質(zhì)。揮發(fā)性鹽基氮含量越高說明食品腐敗越嚴(yán)重，新鮮度越低，因此食品工業(yè)中應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格控制其含量。由圖6可看出，不同加鹽量下，隨著腌制時(shí)間延長，揮發(fā)性鹽基氮含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，第0天各加鹽量下臘魚肉的揮發(fā)性鹽基氮含量集中在4.5 mg/100 g左右。第2天開始揮發(fā)性鹽基氮含量緩慢升高，且鹽濃度越高，揮發(fā)性鹽基氮含量也越高。揮發(fā)性鹽基氮含量總趨勢(shì)的升高是由于腌制臘魚肉在腌制過程中蛋白質(zhì)發(fā)生降解作用，生成胺類物質(zhì)及風(fēng)味前體物質(zhì)氨基酸。這也證實(shí)粗蛋白含量降低是由于蛋白質(zhì)發(fā)生降解作用。

圖6 不同鹽濃度下臘魚肉揮發(fā)性鹽基氮含量隨時(shí)間變化

氨基酸態(tài)氮是衡量食品在發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)等的水解程度，它在一定程度上可以反映食品微生物的活躍度。由圖7可看出，隨著腌制時(shí)間增加，氨基酸態(tài)氮含量逐漸升高。3種加鹽量下，0 d時(shí)的氨基酸態(tài)氮含量差異不顯著；隨著時(shí)間延長開始出現(xiàn)顯著差異。第0~第2天氨基酸態(tài)氮含量增速較大，其中加鹽量6%時(shí)的臘魚肉氨基酸態(tài)氮含量最高，從第0天的0.2%增加到第6天的0.32%，說明6%加鹽量下的臘魚肉在0~6 d蛋白質(zhì)水解過程更劇烈，增加鹽濃度抑制了臘魚肉微生物生長。第2~第6天氨基酸態(tài)氮增速減慢。氨基酸在臘魚肉發(fā)酵中起著風(fēng)味前體物質(zhì)作用，而發(fā)酵產(chǎn)生的氨基酸態(tài)氮在臘魚肉發(fā)酵中則會(huì)代謝生成氨基酸等小分子物質(zhì)。氨基酸態(tài)氮的含量除了受到微生物的影響外，很大程度上還受到原料本身的影響[13]。

圖7 不同鹽濃度下臘魚肉氨基酸態(tài)氮含量隨時(shí)間變化

2.6 臘魚肉肌原蛋白、羰基、總巰基及二硫鍵含量測(cè)定

肌原蛋白是一種可溶性蛋白，臘魚肉腌制過程中蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生不同程度降解，臘魚在烘干過程中肌原蛋白會(huì)發(fā)生聚合變形，形成重要的結(jié)構(gòu)，直接影響臘魚肉多汁性、口感等感官性質(zhì)。由圖8可看出，第0天時(shí)3種鹽濃度的肌原蛋白含量差異不顯著，約4.5 g/100 g。隨著腌制時(shí)間延長，不同加鹽量下的臘魚肉肌原蛋白含量都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，加鹽量6%和8%的臘魚肉下降速度較10%加鹽量更快，第6天時(shí)的含量也更低。鹽濃度越高肌原蛋白含量越高。

圖8 不同鹽濃度下臘魚肉肌原蛋白含量隨時(shí)間變化

羰基價(jià)反映的是油脂氧化產(chǎn)物，尤其是酮醛等有害物質(zhì)的含量和油脂酸敗劣變的程度，是食品煎炸油熱裂變的指標(biāo)[14-16]。由圖9可知，隨著腌制時(shí)間延長，臘魚肉羰基價(jià)含量逐漸升高，且隨著加鹽量增多，臘魚肉羰基含量也隨著增加。這表明臘魚肉在烘干過程及發(fā)酵過程中以NaCl作為促氧劑，加快蛋白質(zhì)中羰基化合物的生成。

圖9 不同鹽濃度下臘魚肉羰基含量隨時(shí)間變化

巰基含量是表征蛋白氧化的一個(gè)重要指標(biāo)，由圖10可知，與第0天的對(duì)照組臘魚肉相比，樣品組的總巰基含量顯著降低，隨著腌制時(shí)間的延長臘魚肉總巰基含量逐漸減少，且隨著加鹽量的增加，臘魚肉總巰基也隨之減少（P＜0.05）。第6天時(shí)的總巰基含量相較于第0天均差異顯著（P＜0.05），這可能是由于NaCl對(duì)自由基形成和促氧化因子擴(kuò)散的促進(jìn)作用[17]。臘魚肉在腌制發(fā)酵時(shí)會(huì)發(fā)生蛋白氧化過程，氧化時(shí)蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生交聯(lián)，蛋白質(zhì)中巰基會(huì)隨著氧化條件的增強(qiáng)生成亞砜等氧化產(chǎn)物[18]，這是導(dǎo)致巰基含量降低的原因之一，臘魚肉總巰基含量越高，說明腌制過程中蛋白發(fā)生氧化的程度越低。

圖10 不同鹽濃度下臘魚肉總巰基含量隨時(shí)間變化

2.7 臘魚肉亞硝酸鹽含量測(cè)定

腌制食品中亞硝酸鹽含量超標(biāo)屢見不鮮，攝入亞硝酸鹽含量0.2~0.5 g時(shí)可導(dǎo)致中毒，含量超過3 g時(shí)可致死，因此在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格控制亞硝酸鹽。由圖11可看出，亞硝酸鹽在第0~第2天增加較快，第0天時(shí)不同鹽濃度的臘魚肉亞硝酸鹽含量差異不明顯，約3.2 mg/kg。第2~第4天亞硝酸鹽含量較第0~第2天增速緩慢且趨于平緩，第6天的臘魚肉亞硝酸鹽含量較第4天有小幅降低，這一系列變化是由于臘魚肉在腌制過程中鹽分的浸入，魚肉本身的微生物在初始階段分解亞硝酸鹽較快，后期由于魚肉組織和細(xì)菌內(nèi)的硝酸還原酶的活性減弱，導(dǎo)致硝酸還原減少。

圖11 不同鹽濃度下臘魚肉亞硝酸鹽含量隨時(shí)間變化

3 結(jié)論與討論

通過研究不同腌制時(shí)間（0，2，4和6 d）及不同加鹽量（6%，8%和10%）對(duì)臘魚肉品質(zhì)特性的影響。結(jié)果表明，不同加鹽量下，隨著腌制時(shí)間延長，水分呈現(xiàn)先降低后升高趨勢(shì)，總酸含量逐漸增加，亮度（L*）、紅度（a*）及白度（b*）隨著加鹽量增加逐漸降低，組胺含量逐漸增加，粗蛋白含量逐漸減少，揮發(fā)性鹽基氮及氨基酸態(tài)氮含量逐漸升高，肌原蛋白和總巰基含量逐漸降低，羰基價(jià)含量逐漸升高，亞硝酸鹽含量先增加后減少。結(jié)合各項(xiàng)理化指標(biāo)綜合分析得出，臘魚肉在加鹽量6%、腌制時(shí)間4 d時(shí)品質(zhì)較好。