含淀粉/糊精的香菇制品中粗多糖含量測(cè)定

薄曉菲，朱新成，孫偉，李正紀(jì)，李曉靈

河南省香菇加工工程技術(shù)研究中心，仲景食品股份有限公司（南陽 474500）

多糖是存在于自然界的醛糖或酮糖通過糖苷連接在一起的聚合物，是一切有生命的有機(jī)體必不可少的成分，參與了生命現(xiàn)象中細(xì)胞的各種活動(dòng)，具有多種多樣的生物學(xué)功能[1]。

香菇多糖（Lentinan，簡(jiǎn)稱LNT）是從優(yōu)質(zhì)香菇子實(shí)體中提取的有效活性成分，是香菇的主要有效成分，是一種宿主免疫增強(qiáng)劑[2]。臨床與藥理研究表明，香菇多糖具有抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫功能和刺激干擾素形成等作用[1]。香菇及其制品中因其含有一定量的香菇多糖，因而備受市場(chǎng)青睞。

中華人民共和國農(nóng)業(yè)部于2008年8月28日發(fā)布NY/T 1676《食用菌中粗多糖含量的測(cè)定》[4]，規(guī)范了食用菌及其制品中食用菌粗多糖的檢測(cè)方法。標(biāo)準(zhǔn)明示不適于添加淀粉、糊精的食用菌產(chǎn)品，以及食用菌液體發(fā)酵或固體發(fā)酵產(chǎn)品。

目前，粗多糖的測(cè)定方法主要是堿性酒石酸銅滴定法和比色法（苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法）兩種[5-6]。一般來說，比色法優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、樣品用量少；缺點(diǎn)是做常規(guī)測(cè)定時(shí)用葡萄糖作為對(duì)照品，誤差較大。其中，苯酚-硫酸分光法是粗多糖測(cè)定最常用的方法，該方法的原理是多糖經(jīng)乙醇沉淀分離后，去除其他可溶性糖及雜質(zhì)的干擾，在濃硫酸作用下，先水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛（糠醛）衍生物，與苯酚反應(yīng)生成橙黃色溶液，在490 nm處有特征吸收，其呈色強(qiáng)度與溶液中糖的濃度呈正比，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量[7-8]。

由于加工工藝及配方設(shè)計(jì)的需求，市面在售的食用菌制品，多含有淀粉、糊精等組分。這類食用菌制品中食用菌粗多糖的檢測(cè)無法遵照NY/T 1676《食用菌中粗多糖含量的測(cè)定》實(shí)施，亟需研究建立含淀粉、糊精的食用菌制品中粗多糖含量的檢測(cè)方法，有效填補(bǔ)空白，滿足需求。

1 試驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

香菇制品（仲景食品股份有限公司）；α-淀粉酶（AAL型）、淀粉葡萄糖苷酶（GAL型），寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；葡萄糖（使用前應(yīng)于105 ℃恒溫烘干至恒重，成都普思生物科技股份有限公司）；磷酸鹽緩沖溶液（0.1 nmol/L，pH 6.8，麥克林生物科技有限公司）；硫酸、無水乙醇、苯酚（重蒸餾），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蒸餾水，實(shí)驗(yàn)室制備。

80%苯酚溶液：稱取80 g苯酚于100 mL燒杯中，加水溶解，定容至100 mL后轉(zhuǎn)至棕色瓶中，置4 ℃冰箱中避光貯存。

5%苯酚：吸取5 mL苯酚溶液，溶于75 mL水中，混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。

100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液：稱取0.100 0 g葡萄糖于100 mL燒杯中，加水溶解，定容至1 000 mL，置4 ℃冰箱中貯存。

1.2 儀器與設(shè)備

UV1800紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；ME104E電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；SC-3610低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；MixMax漩渦混勻器（合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

稱取1 g樣品加蒸餾水溶解（稀釋）至3 mL，加入4倍體積無水乙醇（邊加邊攪拌），然后按4 000 r/min離心10 min，棄去上清液，得到沉淀，將沉淀用乙醇溶液沖洗3次，按4 000 r/min離心10 min，棄去上清液，置70 ℃的恒溫水浴鍋上加熱20 min，除去殘余的乙醇，將得到的沉淀加少量蒸餾水溶解，定容至100 mL，此溶液為樣品溶液。

1.3.2 樣品中粗多糖提取工藝流程

工藝流程：樣品溶液→α-淀粉酶處理→淀粉葡萄糖苷酶處理→乙醇沉淀，得到粗多糖。

取2 mL 1.3.1小節(jié)的樣品溶液于具塞試管中，加入α-淀粉酶溶液，恒溫酶解，反應(yīng)結(jié)束后于100 ℃沸水中滅酶，然后加入1 mL淀粉葡萄糖苷酶，恒溫酶解，反應(yīng)結(jié)束后于100 ℃沸水中滅酶，加入10~50 mL無水乙醇（邊加邊攪拌），按4 000 r/min離心10 min，棄去上清液，置70 ℃的恒溫水浴鍋上加熱20 min，除去殘余的乙醇，制得粗多糖。

1.3.3 粗多糖含量測(cè)定

參照NY/T 1676《食用菌中粗多糖含量的測(cè)定》進(jìn)行。

1.3.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖工作溶液置25 mL具塞玻璃試管中，用蒸餾水補(bǔ)至1.0 mL。向試液中加入1.0 mL苯酚溶液，然后快速加入5.0 mL硫酸（與液面垂直加入，勿接觸試管壁，以便與反應(yīng)液充分混合），靜置10 min。使用漩渦混勻器使反應(yīng)液充分混合，然后將試管放置于30 ℃水浴中反應(yīng)20 min，490 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3.2 樣品粗多糖含量測(cè)定

將1.3.2小節(jié)所得粗多糖溶解，制得試液。向試液中加入1.0 mL苯酚溶液，然后快速加入5.0 mL硫酸（與液面垂直加入，勿接觸試管壁，以便與反應(yīng)液充分混合），靜置10 min。使用漩渦混勻器使反應(yīng)液充分混合，然后將試管放置于30 ℃水浴中反應(yīng)20 min，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，同時(shí)做空白試驗(yàn)。根據(jù)葡萄糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，按式（1）計(jì)算粗多糖含量。樣品中多糖含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)w計(jì)（單位g/100 g）。

式中：c1為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上述查得樣品酶解后測(cè)定液中含糖量，μg；V1為樣品定容體積，mL；m為樣品重量，g；V2為酶解時(shí)移取樣品測(cè)定液的體積，mL；0.9為葡萄糖換算為葡聚糖的校正系數(shù)。

1.3.4α-淀粉酶酶解單因素試驗(yàn)

在其他條件相同的條件下，以粗多糖含量為指標(biāo)，分別研究酶用量（0.08，0.12，0.16，0.20，0.24和0.28 U/mL，即加酶量為1%，1.5%，2%，2.5%，3%和3.5%）、酶解溫度（40，50，60，70，80和90 ℃）、酶解時(shí)間（15，20，25，30，35和40 min）3個(gè)單因素對(duì)樣品中粗多糖提取效果的影響。

1.3.5α-淀粉酶酶解正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以粗多糖含量為考察指標(biāo)，用正交試驗(yàn)L9(33)優(yōu)化α-淀粉酶酶解工藝，設(shè)置因素水平如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平

1.3.6 淀粉葡萄糖苷酶酶解單因素試驗(yàn)

稱取50 mg多糖樣品，用蒸餾水定容至100 mL。取8 mL樣品溶液，加入2 mL濃度為0.2 U/mL的α-淀粉酶，溫度60 ℃，酶解35 min后于100 ℃沸水中滅活10 min，冷卻至常溫后在其他條件相同的條件下，以粗多糖含量為指標(biāo)，分別研究淀粉葡萄糖苷酶用量（10，20，30，40，50和60 U/mL）、酶解溫度（40，50，60，70，80和90 ℃）、酶解時(shí)間（20，30，40，50，60和70 min）3個(gè)單因素對(duì)樣品中粗多糖提取效果的影響。

1.3.7 淀粉葡萄糖苷酶酶解正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以粗多糖含量為考察指標(biāo)，用正交試驗(yàn)L9(33)優(yōu)化淀粉葡萄糖苷酶酶解工藝，設(shè)置因素水平如表2所示。

表2 正交試驗(yàn)因素與水平

1.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，進(jìn)行正交試驗(yàn)，以粗多糖含量來確定最佳條件組合。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)，所得回歸方程：y=0.011 5x+ 0.003 2，R2=0.999，結(jié)果表明：在0~102.38 μg/mL范圍內(nèi)，濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系，可信度較高。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 α-淀粉酶酶解單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1α-淀粉酶用量對(duì)試液吸光度的影響

稱取50 mg多糖樣品，用蒸餾水定容至100 mL。取8 mL樣品溶液，控制酶解溫度60 ℃，時(shí)間35 min，研究加入2 mL不同濃度α-淀粉酶酶解后試液的吸光度變化，結(jié)果如圖2所示。

數(shù)據(jù)顯示，隨著酶量的增加，試液的吸光度呈現(xiàn)上升，在達(dá)到峰值后緩慢下降的趨勢(shì)。尤其是在酶量為2.5%（0.2 U/mL）時(shí)，吸光度達(dá)到最高。

2.2.2α-淀粉酶酶解溫度對(duì)試液吸光度的影響

稱取50 mg多糖樣品，用蒸餾水定容至100 mL。取8 mL樣品溶液，在加入2 mL濃度為0.2 U/mL的α-淀粉酶，控制酶解時(shí)間35 min，研究不同溫度酶解后試液的吸光度變化，結(jié)果如圖3所示。

數(shù)據(jù)顯示，酶解溫度為50~70 ℃時(shí)，吸光度較佳，尤其是在酶解溫度為70 ℃時(shí)，吸光度達(dá)到最高，隨之吸光度迅速降低。

2.2.3α-淀粉酶酶解時(shí)間對(duì)試液吸光度的影響

稱取50 mg多糖樣品，用蒸餾水定容至100 mL。取8 mL樣品溶液，在加入2 mL濃度為0.2 U/mL的α-淀粉酶，酶解溫度為70 ℃，研究不同酶解時(shí)間后試液的吸光度變化，結(jié)果如圖4所示。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)試液吸光度的影響

數(shù)據(jù)顯示，酶解時(shí)間為25~35 min時(shí)，吸光度較佳，尤其是在酶解時(shí)間為35 min時(shí)，吸光度達(dá)到最高，隨之吸光度迅速降低。

2.3 α-淀粉酶酶解正交試驗(yàn)結(jié)果

α-淀粉酶酶解正交試驗(yàn)結(jié)果見表3和表4。由直觀分析及方差分析結(jié)果可以看出：RC＞RA＞RB，即酶解時(shí)間對(duì)樣品中粗多糖含量測(cè)定影響最大，其次是酶解溫度和α-淀粉酶用量。方差分析結(jié)果顯示A、B、C三因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響均不顯著，所以由直觀分析得出最優(yōu)條件為A1B1C2，即α-淀粉酶酶解溫度50 ℃、酶量2.0%（0.16 U/mL）、酶解時(shí)間30 min。

表3 α-淀粉酶酶解L9(33)正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 α-淀粉酶酶解L9(33)正交試驗(yàn)方差分析

2.4 淀粉葡萄糖苷酶酶解單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 淀粉葡萄糖苷酶用量對(duì)試液吸光度的影響

稱取50 mg多糖樣品，用蒸餾水定容至100 mL。取8 mL樣品溶液，加入2 mL濃度為0.2 U/mL的α-淀粉酶，溫度60 ℃，酶解35 min后于100 ℃沸水中滅活10 min，冷卻至常溫后控制酶解溫度50 ℃，時(shí)間40 min，研究加入1 mL不同濃度淀粉葡萄糖苷酶酶解后試液的吸光度變化，結(jié)果如圖5所示。

圖5 淀粉葡萄糖苷酶用量對(duì)試液吸光度的影響

結(jié)果顯示，在酶量為30 U/mL時(shí)，吸光度達(dá)到最高，且再添加酶量效果略下降。

2.4.2 淀粉葡萄糖苷酶酶解溫度對(duì)試液吸光度的影響

稱取50 mg多糖樣品，用蒸餾水定容至100 mL。取8 mL樣品溶液，加入2 mL濃度為0.2 U/mL的α-淀粉酶，溫度60 ℃，酶解35 min后于100 ℃沸水中滅活10 min，冷卻至常溫，加入1 mL濃度為30 U/mL的淀粉葡萄糖苷酶酶解時(shí)間40 min，研究不同酶解溫度條件下試液吸光度變化，結(jié)果如圖6所示。數(shù)據(jù)顯示，酶解溫度為60 ℃時(shí)，試液吸光度達(dá)到最高，隨之吸光度迅速降低。

2.4.3 淀粉葡萄糖苷酶酶解時(shí)間對(duì)試液吸光度的影響

稱取50 mg多糖樣品，用蒸餾水定容至100 mL。取8 mL樣品溶液，加入2 mL濃度為0.2 U/mL的α-淀粉酶，溫度60 ℃，酶解35 min后于100 ℃沸水中滅活10 min，冷卻至常溫后加入1 mL濃度為30 U/mL的淀粉葡萄糖苷酶在60 ℃下酶解，研究不同酶解時(shí)間條件下試液的吸光度變化，結(jié)果如圖7所示。數(shù)據(jù)顯示，酶解時(shí)間40 min時(shí)，吸光度達(dá)到最高，隨之吸光度迅速降低。

圖7 酶解時(shí)間對(duì)試液吸光度的影響

2.5 淀粉葡萄糖苷酶酶解正交試驗(yàn)結(jié)果

淀粉葡萄糖苷酶酶解正交試驗(yàn)結(jié)果見表5和表6。由直觀分析及方差分析結(jié)果可以看出：RC＞RA＞RB，即酶解時(shí)間對(duì)樣品中粗多糖含量測(cè)定影響最大，其次是酶解溫度和淀粉葡萄糖苷酶用量。方差分析結(jié)果顯示A、B、C三因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響均不顯著，所以由直觀分析得出最優(yōu)條件為A2B3C1，即淀粉葡萄糖苷酶酶解溫度60 ℃、酶量40 U/mL、酶解時(shí)間30 min。

表5 淀粉葡萄糖苷酶L9(33)正交試驗(yàn)結(jié)果

表6 淀粉葡萄糖苷酶L9(33)正交試驗(yàn)方差分析

2.6 精密度試驗(yàn)結(jié)果

分別稱取樣品6份，每份稱取1 g樣品，按照供試品溶液的制備方法，測(cè)定吸光度，結(jié)果見表7。吸光度的SRSD小于3%，精密度好。

表7 精密度試驗(yàn)

3 結(jié)論

試驗(yàn)研究了含淀粉/糊精的香菇制品中粗多糖含量測(cè)定方法，通過正交試驗(yàn)得到粗多糖最優(yōu)提取工藝參數(shù)。最優(yōu)工藝參數(shù)：α-淀粉酶酶解溫度50 ℃、酶量2.0%（0.16 U/mL）、酶解時(shí)間30 min；淀粉葡萄糖苷酶酶解溫度60 ℃、酶量40 U/mL、酶解時(shí)間30 min。

在0~102.38 μg/mL范圍內(nèi)，葡萄糖濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程：y=0.011 5x+ 0.003 2，R2=0.999，可信度較高。精密度試驗(yàn)表明[6次平行測(cè)定吸光度，SRSD=1.2%（＜3%）]：檢測(cè)方法精密度好。

研究建立的含淀粉/糊精的香菇制品中粗多糖含量測(cè)定方法是可行的。樣品采用乙醇進(jìn)行第一次沉淀，可將樣品中的葡萄糖溶解去除，采用α-淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶將樣品中添加的淀粉和糊精酶解成葡萄糖經(jīng)乙醇二次沉淀去除，避免其對(duì)香菇制品中粗多糖檢測(cè)的干擾，可滿足含淀粉、糊精組分的香菇制品中粗多糖含量檢測(cè)需求。