蓮霧果醋發(fā)酵菌種的篩選及條件優(yōu)化

方曉純 ，林波，蘭亞龍，鄭鳳錦 ，陳趕林

1. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所（南寧 530007）；2. 廣西果蔬貯藏與加工新技術(shù)重點(diǎn)實驗室（南寧 530007）；3. 陜西易騰達(dá)釀造科技有限公司（寶雞 721013）

蓮霧（Syzygium Samarangense），又名水蒲桃、洋蒲桃、爪哇蒲桃等，在我國臺灣、海南、廣東、廣西、福建、云南等多?。▍^(qū)）有栽培[1]，是海南重要的熱帶水果，有黑金剛、黑珍珠、紅寶石等主要品種。蓮霧果實呈圓錐形，像鈴鐺，果皮有乳白、青綠、粉紅以至深紅色，具有清香氣味，肉質(zhì)細(xì)膩，清甜爽口。近年來諸多學(xué)者對蓮霧進(jìn)行多方面的研究，更加驗證蓮霧具有較高的營養(yǎng)價值和藥用保健等功能[2]。王曉紅[3]測定蓮霧果肉的營養(yǎng)成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蓮霧富含蛋白質(zhì)，糖類，維生素B1、B2、B6、C，鉀、鈉、鈣、磷、鐵、鎂等礦物質(zhì)，給予人們清涼解渴的同時能補(bǔ)充營養(yǎng)，再加上其熱量低，深受消費(fèi)者喜愛。鄧博一等[4]發(fā)現(xiàn)蓮霧果實富含17種氨基酸，包括人體必需的7種氨基酸；其果皮中有大量花色苷和花青素，具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗癌、抗氧化等功效；蓮霧花中含有多酚成分，具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性[5]。蓮霧水分高，果肉組織嬌嫩，呼吸旺盛不耐貯藏，其種植面積逐年增大，逐步打開國內(nèi)水果市場[6]，為避免鮮果滯銷后浪費(fèi)，掌握蓮霧的深加工迫在眉睫。

果醋是利用水果、蔬菜或者發(fā)酵后的果酒[7]為原料，利用微生物或醋酸菌的代謝作用發(fā)酵而成的一種具有促進(jìn)消化、增強(qiáng)免疫、抑菌等功能的健康發(fā)酵食品[8]。李志春等[9]通過高脂小鼠試驗表明，甘蔗醋中含有黃酮和多酚類活性物質(zhì)成分，具有降血脂、提高抗氧化應(yīng)激、減輕體重和臟器腫大等生物功能。另外，因微生物在發(fā)酵成醋的過程中對礦物質(zhì)的需求和利用較少，所以水果中大部分礦物質(zhì)會直接保留在果醋中[10]。近年來我國提倡不同果醋的研究開發(fā)，明顯豐富果醋的種類，技術(shù)研究趨于成熟穩(wěn)定，市場上蘋果醋[11]、葡萄醋[12]、山楂醋[13]等成功的果醋產(chǎn)品為新型果醋的開發(fā)打下堅實基礎(chǔ)[14]。

蓮霧具有豐富的糖質(zhì)資源和水分，是釀醋用的上等原料，蓮霧醋的生產(chǎn)能解決鮮果滯銷和殘次果的有效利用，但針對于蓮霧醋發(fā)酵菌種篩選及工藝優(yōu)化的相關(guān)研究報道鮮為少見。試驗主要選用5種商業(yè)醋酸菌種發(fā)酵蓮霧醋，以醋酸質(zhì)量濃度及感官評分為考察指標(biāo)，篩選出適合蓮霧醋發(fā)酵的醋酸菌種，在此最優(yōu)菌種基礎(chǔ)上進(jìn)行單因素試驗和正交試驗，優(yōu)化蓮霧醋的工藝條件，以期得到色澤明亮、醋味清香的蓮霧果醋，為蓮霧產(chǎn)業(yè)深加工及多元化利用提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蓮霧果酒（廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所研發(fā)制備）；LB活性醋酸菌（簡稱LB，陜西鼎力生物科技有限公司）；滬釀1.01號活性醋酸菌（簡稱滬釀1.01，上海佳民釀造食品有限公司）；帝伯仕果醋菌（簡稱帝伯仕，山東煙臺帝伯仕自釀機(jī)有限公司）；迪發(fā)牌醋酸菌（簡稱迪發(fā)牌，上海迪發(fā)釀造生物制品有限公司）；拉曼德果醋菌（簡稱拉曼德，山東日照隆堡商貿(mào)有限公司）；白砂糖（南寧糖業(yè)股份有限公司）。試驗所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫生物培養(yǎng)箱（Salvis LAB CN118，瑞士Salvis公司）；糖度計[PAL-1，日本ATAGO（愛拓）公司]；電子天平（JA2003型，上海良平儀器儀表有限公司）；pH計（上海雷磁儀器廠）；高壓滅菌鍋（FY-65L，上海申安有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 蓮霧醋釀造工藝流程

1.3.2 蓮霧果酒的制備

將新鮮、干凈的蓮霧果實通過打漿機(jī)打成漿狀，添加果膠酶酶解，加入適量白砂糖調(diào)節(jié)糖度，滅菌后冷卻至室溫，加入活化過的果酒酵母進(jìn)行酒精發(fā)酵，過濾后得到蓮霧果酒，具體制備方法見前期研究[7]。

1.3.3 蓮霧醋發(fā)酵菌種的篩選

選擇已活化LB、滬釀1.01號、帝伯仕、迪發(fā)牌和拉曼德的醋酸菌種，依次發(fā)酵同一批次的蓮霧果酒（底酸含量1.6 g/L，pH 4.01，可溶性固形物5.5%），在初始酒精度6%vol、菌種添加量0.5%、發(fā)酵溫度30 ℃條件下進(jìn)行醋酸發(fā)酵11 d，隔天取樣測定其pH和總酸含量，發(fā)酵結(jié)束后過濾，并進(jìn)行感官評定。以醋酸質(zhì)量濃度（以乙酸計，g/L）及感官評分為考察指標(biāo)，確定適合蓮霧醋發(fā)酵的最佳菌種。

1.3.4 菌種添加量對蓮霧醋發(fā)酵的影響

蓮霧果酒初始酒精度6%vol，加糖量4%，選取優(yōu)化醋酸菌種（迪發(fā)牌醋酸菌），菌種添加量分別為0.2%，0.4%，0.6%，0.8%和1.0%，發(fā)酵溫度30 ℃，進(jìn)行9 d的醋酸發(fā)酵，以總酸含量和殘留酒精度為考察指標(biāo)，分析不同菌種添加量對蓮霧醋發(fā)酵的影響。

1.3.5 初始酒精度對蓮霧醋發(fā)酵的影響

加入無菌水稀釋蓮霧果酒，將酒精度調(diào)配至3%vol，4%vol，5%vol，6%vol和7%vol，在加糖量4%、菌種添加量0.4%、發(fā)酵溫度30 ℃條件下進(jìn)行9 d的醋酸發(fā)酵，以總酸含量和殘留酒精度為考察指標(biāo)，分析不同初始酒精度對蓮霧醋發(fā)酵的影響。

1.3.6 發(fā)酵溫度對蓮霧醋發(fā)酵的影響

蓮霧果酒初始酒精度6%vol，加糖量4%，菌種添加量0.4%，分別在發(fā)酵溫度25，28，31，34和37 ℃條件下進(jìn)行9 d的醋酸發(fā)酵，以總酸含量和酒精殘留量為考察指標(biāo)，分析不同發(fā)酵溫度對蓮霧醋發(fā)酵的影響。

1.3.7 加糖量對蓮霧醋發(fā)酵的影響

蓮霧果酒初始酒精度6%vol，菌種添加量0.4%，發(fā)酵溫度30 ℃，白砂糖添加量分別為2%，3%，4%，5%，6%和7%，進(jìn)行11 d的醋酸發(fā)酵，以總酸含量和殘留酒精度為考察指標(biāo)，分析不同加糖量對蓮霧醋發(fā)酵的影響。

1.3.8 正交試驗設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇菌種添加量、初始酒精度、發(fā)酵溫度和加糖量為自變量，以總酸含量為考察指標(biāo)，進(jìn)行L16(45)正交試驗，考察各因素對蓮霧醋發(fā)酵的影響，正交試驗因素與水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表

1.4 測定方法

總酸測定，采用酸堿滴定法，按GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》操作，總酸含量以醋酸表示；酒精度測定，按GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的酒精計法測定；pH測定，pH計法；微生物檢測，按GB/T 4789.22—2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗調(diào)味品檢驗》中的方法測定。

感官評分由11人組成評定小組，從色澤、香氣、滋味和形態(tài)4個方面對樣品進(jìn)行評分，感官評定標(biāo)準(zhǔn)[15]如表2所示。

表2 感官評定表

1.5 數(shù)據(jù)分析方法

數(shù)據(jù)處理及作圖采用Excel 2019。

2 結(jié)果與分析

2.1 蓮霧醋釀造菌種的篩選

在果醋發(fā)酵過程中，菌種是影響果醋品質(zhì)的重要因素之一，不同醋酸菌發(fā)酵果醋，其風(fēng)味不相同，產(chǎn)酸能力也會有所差別。由圖1和表3可知，5種醋酸菌發(fā)酵蓮霧醋產(chǎn)酸差異較大，其中LB、帝伯仕和拉曼德3個醋酸菌發(fā)酵啟動慢，酸度變化趨勢不明顯，且感官評分也較低。迪發(fā)牌醋酸菌和滬釀1.01號醋酸菌隨著時間的增加總酸含量不斷上升，發(fā)酵至9 d，其總酸含量分別為8.9 g/L和7.0 g/L，感官評分分別為88分和80分。迪發(fā)牌醋酸菌的發(fā)酵液表面長有一層薄的白色醋膜，醋香味明顯，爽口，醋液淺黃色透亮；LB、帝伯仕和拉曼德醋酸菌的發(fā)酵液無醋香味，酒精味明顯，所以評分低，滬釀1.01醋酸菌的發(fā)酵液雖然產(chǎn)酸能力強(qiáng)，但醋香味不夠濃，入口協(xié)調(diào)性不夠，醋體顏色較渾濁。綜合產(chǎn)酸量和感官評價，最終選定適合發(fā)酵蓮霧醋的最佳菌種是迪發(fā)牌醋酸菌，這與樸銀子等[16]在藍(lán)莓果醋發(fā)酵工藝條件優(yōu)化使用的菌種一致，表明該菌種適用于果醋釀造。

圖1 不同菌種發(fā)酵蓮霧醋對總酸含量的影響

表3 不同菌種發(fā)酵后蓮霧醋的感官評分

2.2 影響蓮霧醋醋酸發(fā)酵的因素

2.2.1 菌種添加量對蓮霧醋發(fā)酵的影響

由圖2可知，隨著時間的延長，接種量1.0%發(fā)酵液的發(fā)酵最為顯著，發(fā)酵3 d后其總酸含量達(dá)4.44 g/L，但發(fā)酵5 d后，產(chǎn)酸量逐漸低于接種量0.8%發(fā)酵液的產(chǎn)酸量。接種量0.8%發(fā)酵液的總酸含量隨著時間延長而迅速升高，明顯高于其他添加量發(fā)酵液的總酸含量，發(fā)酵至9 d，接種量0.8%發(fā)酵液的總酸含量最高，達(dá)24.72 g/L，其次是接種量0.6%發(fā)酵液，總酸含量為22.98 g/L。接種量0.2%發(fā)酵液的發(fā)酵啟動最慢，且總酸含量也最低。由圖3可知，菌種添加量越少，發(fā)酵過程不充分，醋酸菌代謝產(chǎn)酸越慢，伴隨酒精殘留量也越高。菌種添加量若越大，醋酸菌菌體細(xì)胞會迅速增殖，導(dǎo)致醋酸菌細(xì)胞提前老化和衰退。菌種添加量的多少直接影響醋酸發(fā)酵的產(chǎn)酸速率[17]。因此發(fā)酵蓮霧醋選擇菌種添加量0.4%~1.0%為宜。

圖2 不同接種量發(fā)酵蓮霧醋對總酸的影響

圖3 不同菌種添加量的酒精殘留量圖

2.2.2 初始酒精度對蓮霧醋發(fā)酵的影響

醋酸菌對酒精具有一定的耐受性，低酒精度下有利于產(chǎn)酸，但初始酒精度較高情況下（10%vol以上）會抑制醋酸菌活性和延滯產(chǎn)酸穩(wěn)定期，產(chǎn)酸量降低[18]，而酒精度過低又易受雜菌污染，因此研究選擇3%vol~7%vol為初始酒精度發(fā)酵蓮霧醋。由圖4可知，不同初始酒精度發(fā)酵蓮霧醋，產(chǎn)酸量有明顯區(qū)別，2 d后醋酸菌進(jìn)入生長期，發(fā)酵啟動最快的是初始酒精度3%vol的發(fā)酵液，發(fā)酵至9 d，其總酸含量最高，為27.0 g/L，其次是4%vol的發(fā)酵液，而初始酒精度6%vol和7%vol的發(fā)酵液產(chǎn)酸較慢，表現(xiàn)為曲線平緩，在發(fā)酵前期，醋酸菌生長繁殖會因酒精度過高而受到抑制，使產(chǎn)酸量降低，還會使發(fā)酵周期延長[19]。由圖5可知，初始酒精度越高，醋酸發(fā)酵后殘留的酒精度越大，其中初始酒精度3%vol的酒精殘留量最小，為0.5%vol，初始酒精度7%vol的酒精殘留量最大，為3.9%vol，酒精殘留量高影響果醋的口感[20]。因此初始酒精度選擇3%vol~5%vol的濃度較適宜。

圖4 不同初始酒精度發(fā)酵蓮霧醋對總酸的影響

2.2.3 溫度對蓮霧醋發(fā)酵的影響

由圖6可知，不同溫度發(fā)酵蓮霧醋總酸含量變化明顯，發(fā)酵前2 d各發(fā)酵液產(chǎn)酸較緩慢，從第3天開始菌種迅速進(jìn)入對數(shù)期，隨著發(fā)酵時間的增加，各發(fā)酵液產(chǎn)酸量不斷增加，其中28 ℃和25 ℃的發(fā)酵液總酸含量上升最明顯。發(fā)酵9 d時，不同溫度發(fā)酵的總酸含量高低依次為28 ℃＞25 ℃＞31 ℃＞34 ℃＞37 ℃。37 ℃發(fā)酵液的總酸含量最低，僅有11.0 g/L，表明此發(fā)酵溫度不適宜醋酸菌產(chǎn)酸，與何宇寧等[21]菠蘿蜜果醋發(fā)酵工藝研究中，發(fā)酵溫度在25~31 ℃產(chǎn)酸量隨著溫度升高而升高，超過31 ℃時，產(chǎn)酸量逐漸下降的現(xiàn)象一致。發(fā)酵溫度過高，不適宜醋酸菌代謝轉(zhuǎn)化酒精，可能是因為高溫抑制乙醇脫氫酶與乙醛脫氫酶活性，降低乙醇氧化成醋酸的速率[22]，而導(dǎo)致酒精殘留量高。由圖7可知，34~37 ℃殘留的酒精含量較大，其次是31 ℃。因此選擇發(fā)酵溫度25~31 ℃為宜。

圖6 不同溫度對發(fā)酵蓮霧醋總酸的影響

圖7 不同發(fā)酵溫度的酒精殘留量圖

2.2.4 加糖量對蓮霧醋發(fā)酵的影響

醋酸菌需要利用發(fā)酵液中的碳源、氮源和其他營養(yǎng)物質(zhì)代謝產(chǎn)酸，雖然乙醇是醋酸菌利用最主要的碳源，但是醋酸菌會利用乙醇進(jìn)行生長繁殖，產(chǎn)物濃度降低[23]，需要在發(fā)酵前添加適量的白砂糖作為碳源補(bǔ)給菌種增殖所需的營養(yǎng)，從而減少對酒精的消耗，促進(jìn)酒精轉(zhuǎn)化率的提高[24]。

由圖8可知，發(fā)酵前4 d，不同加糖量發(fā)酵蓮霧醋的總酸變化均不明顯，總酸增加緩慢，發(fā)酵5 d后加糖量3%和4%的發(fā)酵液總酸逐漸增加，發(fā)酵7 d后，加糖量4%發(fā)酵液的總酸含量迅速增加，發(fā)酵至11 d，其總酸含量達(dá)29.1 g/L，其次是加糖量3%發(fā)酵液，為24.9 g/L；總酸含量最低的是加糖量2%發(fā)酵液，表明加糖量過低，發(fā)酵液里供菌種生長繁殖的營養(yǎng)太少，不利于代謝產(chǎn)酸。發(fā)酵時間延長，可能與白砂糖屬于低聚糖，需要進(jìn)一步降解才能使用有關(guān)[25]。由圖9可知，加糖量2%~4%時，殘留酒精度呈下降趨勢，加糖量4%~7%時，殘留酒精度呈上升趨勢。過高的糖度會產(chǎn)生較大的滲透壓，抑制醋酸菌的正常生長代謝產(chǎn)酸，對發(fā)酵起抑制作用，導(dǎo)致酒精轉(zhuǎn)化率低，殘留酒精多[23]。因此選擇加糖量3%~6%為宜。

圖8 不同加糖量發(fā)酵蓮霧果醋對總酸的影響

2.3 優(yōu)化醋酸發(fā)酵的正交試驗

在對醋酸發(fā)酵條件影響因素分析的基礎(chǔ)上，以迪發(fā)牌醋酸菌發(fā)酵蓮霧果醋工藝中的不同菌種添加量、初始酒精度、發(fā)酵溫度和加糖量這4個關(guān)鍵因數(shù)利用正交設(shè)計軟件助手Ⅱ軟件進(jìn)行L16(45)正交試驗。正交試驗結(jié)果見表4。

表4 優(yōu)化醋酸發(fā)酵工藝條件的正交試驗結(jié)果

如表4所示，由于空白樣的極差值最小，所以試驗結(jié)果較可靠。由極差分析得出，影響蓮霧醋醋酸發(fā)酵的因素大小順序依次為發(fā)酵溫度（RC）＞初始酒精度（RB）＞加糖量（RD）＞菌種添加量（RA），發(fā)酵溫度是影響蓮霧醋總酸含量的主要因素。由表5方差分析結(jié)果可知，發(fā)酵溫度對蓮霧醋產(chǎn)酸影響最大，達(dá)到顯著的程度，而初始酒精度、加糖量對蓮霧醋產(chǎn)酸影響次之，菌種添加量蓮霧醋產(chǎn)酸影響程度不顯著。發(fā)酵工藝最優(yōu)組合為C2D4B1A3，即發(fā)酵溫度28 ℃，加糖量6%，初始酒精度3%vol，菌種添加量0.8%。在此條件下發(fā)酵9 d，總酸含量最高，達(dá)34.1 g/L。

表5 蓮霧醋方差分析結(jié)果

2.4 產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)分析

2.4.1 感官指標(biāo)

外觀與色澤：淺黃色液體，無懸浮沉淀物。香味：具有蓮霧特有的清香，醋酸香氣濃郁，口感協(xié)調(diào)無異味。該果醋感官指標(biāo)符合GB/T 18187—2000《釀造食醋》中要求。

2.4.2 理化指標(biāo)

測得蓮霧醋總酸含量34.1 g/L，符合GB/T 30884—2014《蘋果醋飲料》中總酸要求。

2.4.3 微生物指標(biāo)

菌落總數(shù)≤100 CFU/mL，大腸菌群≤3 CFU/mL，致病菌未檢出。微生物指標(biāo)均符合GB 2719—2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食醋》中的要求。

3 結(jié)論

以海南黑珍珠蓮霧發(fā)酵的蓮霧果酒為原料，對蓮霧果醋發(fā)酵的醋酸菌種進(jìn)行篩選及發(fā)酵進(jìn)行工藝優(yōu)化研究。結(jié)果表明：發(fā)酵蓮霧醋最適醋酸菌種為迪發(fā)牌醋酸菌、菌種添加量0.8%、初始酒精度3%vol、發(fā)酵溫度28 ℃、加糖量6%，在此最優(yōu)條件下靜態(tài)發(fā)酵9 d，總酸含量34.1 g/L，得到的蓮霧醋感官、理化和微生物指標(biāo)均符合國家標(biāo)準(zhǔn)，醋體淺黃透亮，醋味濃郁略帶清香果味，酸甜爽口，風(fēng)味獨(dú)特。