抗磷脂抗體與青壯年缺血性腦卒中相關(guān)性的研究進展

楊 洋，高劉民

腦卒中已成為我國居民死亡的首要病因，發(fā)病率居高不下，其中85%的腦卒中病人為缺血性腦卒中(ischemic stroke，IS)[1]。IS主要的病因包括大動脈粥樣硬化、心源性栓塞和腦小血管疾病[2]，但部分病人病因尚未明確[3]。這種病因不明的IS在45歲以下的青壯年群體更常見[4]，占比為20%～30%[5]。相關(guān)研究報道，卵圓孔未閉合并房間隔動脈瘤、頸動脈夾層可能是青壯年發(fā)生IS的主要原因[4，6]，仍有其他潛在的病因尚未明確。近年來，隨著研究的不斷深入，許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)IS病人外周血清抗磷脂抗體(antiphospholipid antibodies，aPL) 升高，兩者的相關(guān)性研究日益受到重視，現(xiàn)對兩者的相關(guān)性進行綜述。

1 aPL的概述

aPL是血清中以磷脂、磷脂結(jié)合蛋白及其復(fù)合物為靶抗原的一組異質(zhì)性自身抗體[7]。實驗室中，aPL大致分為兩類，一類是通過抗心磷脂抗體或抗2糖蛋白Ⅰ(anti-β2glycoprotein Ⅰ，aβ2GPⅠ) 抗體等固相檢測的抗體，另一類是通過延長磷脂依賴的凝血試驗檢測到的抗體，稱為狼瘡抗凝劑[8]。目前關(guān)于非標(biāo)準(zhǔn)的aPL納入其中，如抗磷脂酰絲氨酸-凝血酶原復(fù)合物抗體、抗β2-糖蛋白Ⅰ結(jié)構(gòu)域1(anti-β2glycoprotein Ⅰ domain-1，aβ2GPⅠ D1) 抗體及抗膜聯(lián)蛋白A5抗體、抗膜聯(lián)蛋白A2抗體、抗蛋白C抗體和抗蛋白S抗體等[9]。aPL持續(xù)存在是抗磷脂綜合征(antiphospholipid syndrome，APS)特征性實驗室指標(biāo)，APS是一種以反復(fù)的血栓形成和妊娠并發(fā)癥為特征的全身性自身免疫性疾病，盡管APS相關(guān)性血栓好發(fā)于靜脈系統(tǒng)，同時涉及動脈系統(tǒng)，神經(jīng)系統(tǒng)是受累嚴(yán)重的部位，IS是常見的臨床特征[10-12]。

aPL主要靶點是β2糖蛋白Ⅰ(β2glycoprotein Ⅰ，β2GPⅠ) ，這是一種與磷脂表面強烈結(jié)合的血漿蛋白，是天然的抗凝物質(zhì)，在結(jié)構(gòu)域Ⅴ與磷脂結(jié)合后構(gòu)象發(fā)生改變，誘導(dǎo)aβ2GPⅠ產(chǎn)生并結(jié)合成復(fù)合物，促進血栓形成[13]。抗凝血酶原是aPL的第二主要抗原靶點。aPL相關(guān)性血栓形成研究中，狼瘡抗凝劑與血栓形成的風(fēng)險相關(guān)[14]。一項檢測非標(biāo)準(zhǔn)aPL的大型回顧性研究表明，aβ2GPⅠ是動脈血栓形成的最佳預(yù)測因子[9]，可能與多數(shù)aPL的靶點均為β2GPⅠ有關(guān)。

2 aPL與青壯年IS的相關(guān)性

多項研究發(fā)現(xiàn)，IS病人血清aPL陽性率升高[15-16]。既往發(fā)生IS的病人中，aPL陽性率高達13.5%[17]。一項對復(fù)發(fā)性腦梗死和首發(fā)性腦梗死病人的研究發(fā)現(xiàn)，aPL與復(fù)發(fā)性腦梗死關(guān)系密切[18]。

雖然aPL陽性可能出現(xiàn)在任何年齡的IS病人中，由于老年人其他血管危險因素的影響，無法判斷老年病人aPL陽性和IS發(fā)病率之間的聯(lián)系[19]。相較而言，aPL陽性與青壯年IS的相關(guān)性相對直觀，有研究表明，45歲以下的中風(fēng)病人中，超過20%的中風(fēng)與APS有關(guān)[20]，aPL陽性的IS病人發(fā)病平均年齡為45.8歲，低于總體IS病人[21]。一項與APS相關(guān)腦卒中系統(tǒng)回顧研究顯示，50歲以下的受試者中出現(xiàn)aPL陽性，使血栓性腦血管事件的發(fā)生風(fēng)險增加5.48倍[22]。

3 aPL引發(fā)IS的機制

原位血栓形成是aPL引起IS的常見致病機制[23]，且aPL可能導(dǎo)致青壯年過早發(fā)生動脈粥樣硬化，從而引發(fā)IS。aPL引起IS的機制基于aPL干擾內(nèi)源性抗凝(破壞膜聯(lián)蛋白A5的抗凝屏障、抑制蛋白C途徑或抑制抗凝血酶)，激活血管細胞(內(nèi)皮細胞、單核細胞、血小板和免疫細胞)，并誘導(dǎo)細胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs) 釋放，增強黏附分子和組織因子表達，同時補體級聯(lián)反應(yīng)激活，參與IS的發(fā)生進展過程，最終在凝血系統(tǒng)和抗纖溶系統(tǒng)共同作用下形成血栓。

根據(jù)APS血栓形成的“二次打擊”模型，潛在的內(nèi)皮損傷和氧化應(yīng)激增加與aPL抗體共同作用才能形成血栓[24]。與氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)的因子，可能在IS中發(fā)揮著重要的作用。來自瓣膜病變的栓塞物可能與另一種病因機制有關(guān)，這解釋了腦血管遠端病變[25]。

3.1 干擾抗凝系統(tǒng)

3.1.1 蛋白C系統(tǒng) 在APS中，aPL干擾蛋白C系統(tǒng)是導(dǎo)致血栓形成的機制之一。蛋白C通過與內(nèi)皮跨膜蛋白、血栓調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合被激活，活化蛋白C(activated proteic C，APC) 與血小板或內(nèi)皮細胞表面的輔因子蛋白S形成復(fù)合物，共同滅活活化凝血因子Ⅴ和Ⅷ發(fā)揮抗凝作用[26]?？沟鞍證抗體既可直接抑制凝血酶/血栓調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物對蛋白C的激活，又抑制APC對活化因子Ⅴ的滅活。β2GPⅠ可直接與APC結(jié)合并使其失活，αβ2GPⅠ通過增強這種結(jié)合抑制其活性。多數(shù)凝血酶原-抗凝血酶原抗體免疫復(fù)合物通過干擾APC對活化因子Ⅴ的失活促進血栓形成[27]。

3.1.2 膜聯(lián)蛋白A5膜聯(lián)蛋白A5是一種存在于內(nèi)皮細胞的鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白，通過與細胞表面的磷脂結(jié)合形成保護性的抗凝血屏障，阻止促凝血復(fù)合物激活[28]。在膜聯(lián)蛋白A5與其抗體相互作用情況下，這一屏障可能受損，導(dǎo)致血栓形成[29]。

3.2 激活血管細胞 內(nèi)皮細胞、血小板和單核細胞是血栓形成的關(guān)鍵效應(yīng)細胞，aPL 證明可激活內(nèi)皮細胞、單核細胞和血小板，導(dǎo)致血栓表型形成[30]。aPL可直接結(jié)合內(nèi)皮細胞膜和單核細胞膜受體，誘導(dǎo)跨膜組織因子蛋白表達，激活內(nèi)皮細胞釋放黏附分子、內(nèi)皮素-1、炎性細胞因子和纖溶抑制劑等，并通過降低組織因子途徑抑制物活性上調(diào)組織因子活性[27]。細胞因子失衡和組織因子上調(diào)可能是aPL相關(guān)性血栓形成的潛在機制。血管細胞通過釋放EVs至細胞外環(huán)境中，通過增加炎癥、凝血和內(nèi)皮功能障礙改變止血平衡，促進血栓形成。

3.2.1 激活內(nèi)皮細胞 正常的血管內(nèi)皮表現(xiàn)為抗血栓表面，aPL與內(nèi)皮細胞表面β2GPⅠ受體結(jié)合介導(dǎo)血管病變，介導(dǎo)的步驟包括彌漫性內(nèi)膜增生、加速動脈粥樣硬化和內(nèi)皮功能障礙。注射到小鼠體內(nèi)的人類aPL在無內(nèi)皮損傷情況下不會促進血栓形成[31]，表明aPL和潛在的內(nèi)皮功能障礙是APS血栓形成的必要“第一次打擊”，但需要炎癥性“第二次打擊”誘發(fā)血栓形成事件。

aPL抗體，特別是抗心磷脂抗體和αβ2GPⅠ通過激活磷酸化磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositol-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt) 途徑及哺乳動物雷帕霉素復(fù)合物靶標(biāo)誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞增殖和內(nèi)膜增生[32-33]。aβ2GPⅠ介導(dǎo)氧化低密度脂蛋白內(nèi)化，與β2GPⅠ復(fù)合成巨噬細胞，形成泡沫細胞，導(dǎo)致過早動脈粥樣硬化病變的發(fā)展。小鼠動脈粥樣硬化模型表明，aβ2GPⅠ可能通過增加非高密度脂蛋白/高密度脂蛋白比值干擾脂質(zhì)代謝，加速動脈粥樣硬化進程，并觀察到aβ2GPⅠ誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化斑塊中可見平滑肌細胞減少，導(dǎo)致斑塊更易破裂[34]。aβ2GPⅠ D1在動脈粥樣硬化病變中驅(qū)動Th1型炎癥反應(yīng)，繼而導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定，最終導(dǎo)致動脈粥樣硬化血栓形成[35]。aPL介導(dǎo)的內(nèi)皮一氧化氮合酶抑制，舒張因子一氧化氮生成和釋放受損，引起內(nèi)皮功能障礙[36]。aβ2GP與β2GPⅠ結(jié)合導(dǎo)致內(nèi)皮細胞活化，且aβ2GPⅠ激活Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)，導(dǎo)致p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase，p38MAPK)磷酸化和核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)激活。NF-κB活性增加可誘導(dǎo)組織因子、血管細胞黏附蛋白-1、細胞間黏附分子-1表達上調(diào)，血栓調(diào)節(jié)蛋白表達下調(diào)，最終形成血栓。

3.2.2 激活單核細胞 單核細胞表面主要β2GPⅠ受體為膜聯(lián)蛋白A2，膜聯(lián)蛋白A2不是跨膜蛋白，不能招募下游信號分子，只能與TLR4形成共受體，在脂筏中被αβ2GP-β2GPⅠ復(fù)合物招募和激活，從而誘導(dǎo)組織因子和炎性細胞因子[腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細胞介素(interleukin，IL)-1和IL-6]在單核細胞中表達[37-38]。單核細胞通過p38MAPK和絲裂原活化蛋白激酶激酶-1(mitogen-activated proteinkinase kinase 1，MEK1)/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)通路激活NF-κB，上調(diào)組織因子表達[39]。aPL與內(nèi)皮蛋白C受體結(jié)合，在細胞表面加載溶二磷脂酸，并觸發(fā)內(nèi)皮蛋白C受體-溶二磷脂酸復(fù)合物與aPL的內(nèi)吞作用，復(fù)合物破壞受抑制的組織因子，從而誘導(dǎo)凝血活化，引發(fā)單核細胞中的自分泌蛋白酶激活受體信號傳導(dǎo)，將酸性鞘磷脂酶轉(zhuǎn)移到細胞表面激活，促使單核細胞的促凝血表型改變[40-41]。

3.2.3 激活血小板 血小板的激活是APS血栓形成中的重要步驟。aPL中aβ2GPⅠ抗體與血小板活化的關(guān)系密切[38]。aPL激活血小板的激活有兩種方式，第一種是aβ2GPⅠ-β2GPⅠ復(fù)合物通過血小板膜糖蛋白Ⅰbα亞基和血小板表達的載脂蛋白E2受體使p38MAPK磷酸化，促使血小板、血栓烷A2、血栓烷B2、P選擇素和血小板因子4(platelet factor 4，PF4)釋放，并活化血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa[42]；第二種是通過PF4與β2GPⅠ結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物PF4-β2GPⅠ-aβ2GPⅠ，通過血小板膜糖蛋白Ⅰbα亞基和載脂蛋白E2受體進一步激活血小板。aβ2GPⅠ-β2GPⅠ復(fù)合物激活PI3K/Akt通路和下游的細胞內(nèi)絲氨酸-蘇氨酸激酶，促進血小板黏附和聚集[27]。Verhenne等[43]在大腦中動脈閉塞的小鼠腦卒中模型中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細胞分泌血管性血友病因子(von willebrand factor，vWF)，活性vWF與血小板膜糖蛋白Ⅰbα亞基結(jié)合，介導(dǎo)血小板黏附。aβ2GPⅠ通過抑制β2GPⅠ與vWF競爭性結(jié)合，增加循環(huán)中活性vWF水平；同時抑制血管性血友病因子裂解酶-13活性，抑制體內(nèi)vWF降解[42]。

3.3 EVs 有研究顯示，由aβ2GPⅠ刺激內(nèi)皮細胞釋放的EVs水平增加了2倍[44]，提示EVs可能參與aPL血栓的形成。在EVs上暴露促凝血劑絲氨酸磷脂和組織因子，使其具有較強的促血栓形成功能[45]，絲氨酸磷脂和組織因子共存時，EVs的促凝血活性增強。

內(nèi)皮細胞、單核細胞、血小板被激活后可釋放EVs[46]，且補體激活可促使EVs釋放[47]。不同來源的EVs在功能上有所差異，內(nèi)皮源性EVs有一個獨特的miRNA圖譜，似乎通過miRNA向Toll樣受體7(Toll-like receptor 7，TLR7)呈遞ssRNA激活內(nèi)皮細胞[48]。內(nèi)皮源性EVs通過誘導(dǎo)單核細胞上組織因子表達，促進單核細胞的促凝狀態(tài)，通過抑制內(nèi)皮細胞一氧化氮產(chǎn)生，引起內(nèi)皮功能障礙。單核細胞源性EVs與內(nèi)皮細胞相互作用，通過減少抗凝分子表達，增加黏附分子表達，通過轉(zhuǎn)導(dǎo)miRNA改變內(nèi)皮細胞的黏附性，誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞炎癥。血小板源性EVs通過直接相互作用或通過miRNA和脂質(zhì)刺激內(nèi)皮細胞和單核細胞，通過miRNA介導(dǎo)增強細胞間黏附因子-1表達，增強白細胞間黏附。血小板源性EVs可影響細胞因子的產(chǎn)生(IL-1β、IL-6、IL-8)。血小板源性EVs通過反饋導(dǎo)致血小板激活和聚集[30，47]，同時觀察到EVs作為一種自分泌/旁分泌信號機制，在單個組織的細胞間傳播促凝表型[38]。

3.4 免疫細胞 在aPL相關(guān)的血栓形成病理機制中，免疫細胞作用常被忽視，特別是嗜中性粒細胞和樹突狀細胞對產(chǎn)生和維持aPL是必要的。已有研究表明，中性粒細胞在活性氧和TLR4參與下活化釋放中性粒細胞外陷阱(neutrophil extracellular traps，NETs)誘導(dǎo)組織因子的表達和凝血酶的生成，這可能是aPL相關(guān)血栓形成的重要因素[13，49-50]，同時NETs中的中性粒細胞絲氨酸蛋白酶抗體可降解組織因子途徑抑制物，加速血栓形成[51]。一項關(guān)于循環(huán)中NETs與APC相互作用的研究發(fā)現(xiàn)，aPL陽性的病人NETs通過促進APC耐藥性參與機體高凝狀態(tài)[52]。Pérez-Sánchez等[53]體外研究發(fā)現(xiàn)，采用aPL-IgG處理中性粒細胞后，miRNA表達降低。這些miRNAs可降低組織因子信使RNA水平及血小板活性[54]。低水平的miRNA表達可能與激活的單核細胞Ⅰ型干擾素信號增強有關(guān)[54-55]。

樹突狀細胞在APS中由內(nèi)皮損傷引發(fā)的aPL持續(xù)產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用[56]，這種機制可能是通過aPL與先天免疫細胞上表達的內(nèi)皮蛋白C受體-溶二磷脂酸復(fù)合物的結(jié)合維持干擾素和TLR7依賴性B1a細胞擴增相關(guān)[40]。

3.5 補體激活 aPL介導(dǎo)的補體激活和凝血途徑之間的交叉作用，共同作用于血栓形成。有研究顯示，發(fā)生IS事件的APS病人血漿補體活化產(chǎn)物水平高于非APS相關(guān)IS病人[27]，表明補體參與aPL相關(guān)的IS發(fā)生。磷脂酰絲氨酸是一種帶負電荷的磷脂，在血小板和內(nèi)皮細胞活化后從細胞膜內(nèi)遷移到外細胞膜[16]，之后通過β2GPⅠ表面受體，如載脂蛋白E2受體、膜聯(lián)蛋白A2或Toll樣受體，與aβ2GPⅠ-β2GPⅠ結(jié)合激活經(jīng)典的補體途徑。Chaturvedi等[57]測量補體的前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，aβ2GPⅠ可能通過凝集素途徑抑制β2GPⅠ對C3/C3b的降解作用，從而激活補體。補體激活生成C5a和膜攻擊復(fù)合物C5b-9，C5a可誘導(dǎo)黏附分子表達及單核細胞、中性粒細胞和血小板活化，導(dǎo)致促炎介質(zhì)釋放，并啟動促黏性和血栓前狀態(tài)。C5b-9在內(nèi)皮的沉積導(dǎo)致內(nèi)皮損傷和促凝血劑改變，包括黏附分子表達、vWF分泌和EVs釋放[58-60]。補體激活通過上調(diào)凝血酶激活纖溶抑制物水平，抑制纖溶反應(yīng)[61]。

3.6 干擾纖溶系統(tǒng) 纖溶是在纖溶酶作用下將富含纖維蛋白的血栓修飾或分解成纖維蛋白原降解產(chǎn)物的過程，特異性纖溶酶原激活物抑制劑在纖溶酶原激活劑水平抑制纖溶系統(tǒng)。

在內(nèi)皮細胞表面上，膜聯(lián)蛋白A2與S100鈣結(jié)合蛋白A10形成異四聚體復(fù)合物，該復(fù)合物作為促纖維蛋白溶解受體，結(jié)合纖溶酶原和組織纖溶酶原激活劑并促進血管纖維蛋白溶解[62]。完整的β2GPⅠ可促進纖溶酶產(chǎn)生?？鼓ぢ?lián)蛋白A2抗體和aβ2GPⅠ通過兩種機制促進血栓形成：首先通過抑制纖溶酶形成，其次通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞活化和組織因子表達，促進凝血和纖維蛋白形成[63-64]。Weiss等[65]建立的小鼠模型發(fā)現(xiàn)，抗膜聯(lián)蛋白A2抗體對血栓形成和纖維蛋白溶解的影響與aβ2GPⅠ不同，表明抗膜聯(lián)蛋白A2抗體是aPL相關(guān)血栓形成的獨立危險因素。

4 小 結(jié)

aPL作為自身免疫系統(tǒng)疾病中常見的一類抗體，是導(dǎo)致青壯年IS的常見原因，aPL通過激活各類血管細胞并誘導(dǎo)EVs釋放，致使細胞因子失衡和組織因子上調(diào)，導(dǎo)致腦血管動脈粥樣硬化和內(nèi)皮功能障礙，最終在補體、凝血和抗纖溶系統(tǒng)的共同作用下形成動脈血栓，從而發(fā)生IS，其中補體系統(tǒng)的激活和相關(guān)免疫通路發(fā)揮著重要作用，是今后發(fā)病機制研究的重點方向。 目前對aPL相關(guān)的IS治療方法，除了控制腦血管事件的傳統(tǒng)高危因素，如高血壓、糖尿病、吸煙、肥胖和高脂血癥等，對初次血栓的預(yù)防應(yīng)采用個體化風(fēng)險分層方法，添加小劑量阿司匹林、羥氯喹和他汀類藥物等個性化方案，在預(yù)防繼發(fā)性血栓形成方面，中等強度的華法林是主要治療策略。隨著對aPL引發(fā)IS機制的進一步探討，尤其是補體系統(tǒng)的激活和相關(guān)免疫通路方面，為預(yù)防和治療aPL相關(guān)IS提供新的治療思路和策略，目前新型療法如靶向B細胞和補體抑制等藥物已用于臨床，仍需更多的前瞻性臨床研究進一步證實。