人參灰葡萄孢對(duì)氯氟醚菌唑敏感基線的建立及抗藥性監(jiān)測(cè)1)

馬新智 盧寶慧 王若谷 陳長(zhǎng)卿 張艷敬 高潔

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)春，130118)

馮志偉 侯萬鵬 孫國剛 李公啟

(吉林參王植保科技有限公司) (集安市人參研究所)

In order to clarify the resistance of ginseng Botrytis cinerea strains to mefentrifluconazole, the sensitivity of B. cinerea to mefentrifluconazole was determined by mycelial growth rate method, and fungicide-resistance of B. cinerea to mefentrifluconazole was monitored with minimum inhibitory concentration method. The range of EC50 values of mefentrifluconazolea gainst the tested B. cinerea strains was from 0.008 4 to 2.795 8 mg/L, and the sensitivity frequency distribution showed a continuous unimodal curve, which was in line with the normal distribution by K-S method. There was no resistant population with significantly decreased sensitivity, and its average EC50 value of 0.174 4 mg/L can be used as the sensitive baseline of B. cinerea to mefentrifluconazole. There were significant differences in the sensitivity of B. cinerea strains from different geographical regions and different years to mefentrifluconazole. Most of the tested strains of B.cinerea were sensitive or low resistantto mefentrifluconazole, only a small number of medium and high resistant strains were found in Fusong County and Ji’an City of Jilin Province, and the resistance frequency was all less than 3.7%.

由灰葡萄孢(Botrytiscinerea)引起的灰霉病是人參生產(chǎn)上的最重要的病害之一，通常發(fā)病株率為15%～30%，嚴(yán)重地塊超過50%，嚴(yán)重影響了人參的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]?；移咸焰呒闹鞣秶鷱V泛，具有變異頻率高、再侵染頻繁、易產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)，屬于高抗藥性風(fēng)險(xiǎn)的致病菌之一[2]?；瘜W(xué)藥劑是防治灰霉病的重要手段，但化學(xué)藥劑的長(zhǎng)期使用易導(dǎo)致灰霉病菌產(chǎn)生抗藥性等問題?？顾幮砸坏┊a(chǎn)生病菌對(duì)藥劑的敏感性下降，防治效果隨之降低。檢測(cè)病原菌抗藥性產(chǎn)生是植物病害防治的重要內(nèi)容[3]。已有研究表明，灰葡萄孢對(duì)腐霉利、嘧霉胺、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、異菌脲、多菌靈、乙霉威等已產(chǎn)生不同程度的抗藥性[4-11]。

氯氟醚菌唑是由巴斯夫公司2016年開發(fā)的異丙醇三唑類殺菌劑，陸續(xù)在北美洲、歐洲和我國獲得登記使用，用于防治多種作物的葉斑病和灰霉病等[12-16]。Li et al.[17]已建立了來自草莓、蕓豆、番茄和黃瓜上的灰葡萄孢病菌對(duì)氯氟醚菌唑的敏感基線，氯氟醚菌唑處理黃瓜灰葡萄孢后可導(dǎo)致菌絲分支增加，麥角甾醇含量降低，細(xì)胞膜通透性發(fā)生變化，在離體情況下，200 mg/L氯氟醚菌唑?qū)S瓜灰霉病的預(yù)防效果可達(dá)100%，治療效果為72.7%，防治效果較好，且證實(shí)氯氟醚菌唑與戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑、腈菌唑、己唑醇、三唑酮、氟哇唑、氯啶菌酯之間無交互抗性。

關(guān)于人參灰葡萄孢對(duì)氯氟醚菌唑抗性情況未見報(bào)道。因此，本研究測(cè)定了來自東北三省的148株人參灰葡萄孢對(duì)氯氟醚菌唑的敏感性，建立了人參灰葡萄孢對(duì)氯氟醚菌唑的敏感基線，比較了不同來源、不同年份的菌株敏感性差異監(jiān)測(cè)了各個(gè)地區(qū)和不同年份獲得的人參灰葡萄孢對(duì)氯氟醚菌唑的抗藥性情況，以期明確人參灰葡萄孢對(duì)氯氟醚菌唑的抗藥性情況，為氯氟醚菌唑防治人參灰霉病科學(xué)使用和灰葡萄孢病菌的抗藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

供試材料：2017—2019年從人參產(chǎn)區(qū)田間發(fā)生灰霉病的植株分離的148株人參灰葡萄孢(Botrytiscinerea)，用于敏感基線的建立；2020—2021年分離獲得的246株灰葡萄孢病菌用于抗藥性監(jiān)測(cè)，所有菌株均經(jīng)過柯赫氏法則驗(yàn)證對(duì)人參有致病性。濾紙片法-20 ℃保存于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病害綜合治理實(shí)驗(yàn)室，使用前在PDA平板培養(yǎng)基上活化。供試藥劑為400 g/L氯氟醚菌唑懸浮劑由巴斯夫歐洲公司提供。

含藥培養(yǎng)基的制備：將400 g/L的氯氟醚菌唑懸浮劑配成10 000 mg/L母液，置于4 ℃冰箱中備用。使用時(shí)用蒸餾水稀釋母液，按設(shè)置濃度加入到馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基中，充分混勻，分別制成質(zhì)量濃度為1 000、100、10、1、0.1、0.01、0.001 mg/L的含藥平板[18]。

藥劑敏感性測(cè)定：參考Yin et al.[19]的方法進(jìn)行測(cè)定。25 ℃條件下，待測(cè)菌株在PDA平板上培養(yǎng)120 h，用無菌打孔器自菌落邊緣打取直徑8 mm的菌餅，菌絲面朝下接種于含藥PDA平板的中心。每個(gè)濃度重復(fù)3次，以不加藥的PDA平板作為對(duì)照。25 ℃下培養(yǎng)120 h，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，取平均值，計(jì)算不同濃度的藥劑對(duì)菌絲的生長(zhǎng)抑制率。

菌絲生長(zhǎng)抑制率=[(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑)]×100%。

人參灰葡萄孢病菌田間抗藥性監(jiān)測(cè)：將2020—2021年分離獲得的246株灰葡萄菌株25 ℃ PDA上活化培養(yǎng)后，置于敏感基線值的5、10、100倍濃度的含藥PDA培養(yǎng)基上，以含等量無菌水的PDA培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，均設(shè)3次重復(fù)，在25 ℃恒溫、無光照、30% RH條件下培養(yǎng)5 d后，測(cè)量菌絲生長(zhǎng)情況，參照推薦的標(biāo)準(zhǔn)[20-21]劃分抗性類型，并計(jì)算其抗性頻率。抗性水平劃分：所有菌株在等量無菌水的PDA培養(yǎng)基均可正常生長(zhǎng)，在所有濃度的含藥PDA培養(yǎng)基上均不能生長(zhǎng)的菌株為敏感菌株；在5倍敏感基線值濃度可以生長(zhǎng)，10倍濃度不能生長(zhǎng)的的菌株為低抗菌株；在5倍、10倍濃度均可以生長(zhǎng)，100倍濃度不能生長(zhǎng)的菌株為中抗菌株；在所有濃度均生長(zhǎng)的為高抗菌株?？剐灶l率=(抗性菌株數(shù)/總菌株數(shù))×100%。

數(shù)據(jù)處理：采用SPSS 16.0和DPS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。根據(jù)野生敏感型病原群體對(duì)藥劑敏感性分布為正態(tài)分布的原理，確認(rèn)病原菌群體EC50敏感性頻率分布是否呈正態(tài)分布或連續(xù)的單峰曲線，如果呈正態(tài)分布或連續(xù)的單峰曲線，可將其群體EC50均值作為病原菌對(duì)藥劑的敏感基線[22]。采用SPSS 16.0軟件中的Duncan氏新復(fù)極差法對(duì)不同地區(qū)、不同年份的平均EC50值進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 人參灰葡萄孢菌株對(duì)氯氟醚菌唑的敏感基線的建立

由表1可知，氯氟醚菌唑?qū)碜詵|北地區(qū)的148株人參灰葡萄孢病菌的EC50值分布在0.008 4～2.795 8 mg/L，平均值為0.174 4 mg/L，所檢測(cè)的菌株對(duì)該藥劑具有較高的敏感性，未發(fā)現(xiàn)抗藥性亞群體。但最大值為最小值的332倍，EC50值跨度范圍比較大，表明群體內(nèi)個(gè)體間對(duì)氯氟醚菌唑的敏感性差異較大。EC50敏感性頻率分布呈現(xiàn)連續(xù)性單峰曲線，通過DPS中的K-S正態(tài)檢驗(yàn)得到P=0.12>0.05，說明人參灰葡萄孢菌株對(duì)氯氟醚菌唑的敏感性頻率符合正態(tài)分布，按照野生型病原群體對(duì)藥劑的敏感性呈正態(tài)分布的原理，本研究中148株灰葡萄孢病菌的EC50平均值0.174 4 mg/L可作為人參灰葡萄孢對(duì)氯氟醚菌唑的敏感基線。

表1 148株人參灰葡萄孢病菌對(duì)氯氟醚菌唑的敏感性頻率分布

2.2 不同地區(qū)來源的灰葡萄孢菌株對(duì)氯氟醚菌唑的敏感性水平

由表2可知，不同地區(qū)來源的人參灰葡萄孢菌株對(duì)氯氟醚菌唑的敏感性存在一定的差異(P<0.05)；較敏感的是來自吉林省的撫松縣和靖宇縣，黑龍江省的尚志縣及遼寧省桓仁縣的菌株，其EC50平均值分別為0.134 1、0.560 7、0.203 1和0.156 5 mg/L，最不敏感的是吉林省安圖縣的菌株，其EC50平均值為0.653 6 mg/L。

表2 氯氟醚菌唑?qū)Σ煌貐^(qū)來源的人參灰霉病菌的EC50值比較

2.3 不同年份的人參灰葡萄孢菌株對(duì)氯氟醚菌唑的敏感性水平

由表3可知，不同年份的人參灰葡萄孢菌株對(duì)氯氟醚菌唑的敏感性存在一定差異。無論從EC50的最小值、最大值，還是平均值，2017年采集的菌株對(duì)氯氟醚菌唑的敏感性高于2018、2019年的菌株。

表3 氯氟醚菌唑?qū)Σ煌瑫r(shí)間分離的人參灰葡萄孢病菌的EC50值

2.4 人參灰葡萄孢菌株對(duì)氯氟醚菌唑的田間抗藥性監(jiān)測(cè)

由表4可知，采用最小抑菌濃度法測(cè)定2020—2021年分離的246株灰葡萄孢病菌對(duì)氯氟醚菌唑的敏感性，231株表現(xiàn)為敏感，平均頻率為94.31%；9株為低抗菌株，抗性頻率為3.66%；4株中抗菌株，抗性頻率為1.63%；2株高抗菌株，抗性頻率為0.81%。

表4 不同地區(qū)人參灰葡萄孢菌株對(duì)氯氟醚菌唑的抗藥性水平及抗性頻率

3 結(jié)論與討論

建立病原菌對(duì)一種殺菌劑的敏感基線及進(jìn)行抗藥性評(píng)價(jià)，有助于優(yōu)化該殺菌劑的使用策略，延長(zhǎng)殺菌劑的使用壽命[23]。雖然氯氟醚菌唑已經(jīng)在其他作物上用于防治灰霉病多年，在防治人參灰霉病上也有應(yīng)用，但人參灰葡萄孢菌株對(duì)其抗藥性水平尚不明確。本研究測(cè)定了采自中國東北地區(qū)人參主產(chǎn)省份的148株人參灰葡萄孢對(duì)氯氟醚菌唑的敏感性，確立了人參灰葡萄孢對(duì)氯氟醚菌唑的敏感基線為0.1744 mg/L，對(duì)2020—2021年采自東北三省的246株灰葡萄孢菌株對(duì)氯氟醚菌唑的抗藥性監(jiān)測(cè)結(jié)果表明人參灰葡萄病菌對(duì)氯氟醚菌唑抗藥性水平和抗性頻率均較低。盡管Li et al.[17]已建立山東省草莓、蕓豆、番茄和黃瓜上灰葡萄孢對(duì)氯氟醚菌唑的敏感基線(0.124 mg/L)，但由于人參灰霉病的用藥與草莓、蕓豆、番茄和黃瓜上的灰霉病用藥頻次有很大不同，因此有必要建立人參灰葡萄孢對(duì)氯氟醚菌唑的敏感基線，這樣更有利于準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)人參灰葡萄孢對(duì)氯氟醚菌唑的抗藥性水平及進(jìn)行抗藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。本研究建立的人參灰葡萄孢對(duì)氯氟醚菌唑的敏感基線值(0.1744 mg/L)高于Li et al.[17]建立的黃瓜等作物灰葡萄孢的敏感基線值(0.124 mg/L)。

Li et al.[17]的研究結(jié)果表明氯氟醚菌唑與苯醚甲環(huán)唑、戊唑醇、腈菌唑之間無交互抗性，而苯醚甲環(huán)唑、戊唑醇、腈菌唑也是人參上常用的殺菌劑，因此一旦人參灰葡萄孢對(duì)這些常用的三唑類殺菌劑產(chǎn)生抗藥性，可以用氯氟醚菌唑替代上述三唑類殺菌劑防治相應(yīng)病害。

本研究表明人參灰葡萄孢對(duì)氯氟醚菌唑尚未產(chǎn)生中、高水平的抗藥性，但發(fā)現(xiàn)不同來源的人參灰葡萄孢菌株對(duì)氯氟醚菌唑的敏感性存在差異，這可能與不同地區(qū)的人參種植年限和灰霉病的發(fā)生歷史、用藥措施以及病菌本身的遺傳差異及群體組成等因素有關(guān)。由于生產(chǎn)中連續(xù)大量使用同類殺菌劑或者其他有交互抗性的殺菌劑，會(huì)使病菌對(duì)殺菌劑的敏感性降低。因此，為了延緩人參灰葡萄孢對(duì)氯氟醚菌唑抗藥性，建議要繼續(xù)定期監(jiān)測(cè)其抗藥性情況，減少作用機(jī)制相同類型殺菌劑的使用頻次，按照推薦最低有效劑量使用，并科學(xué)合理與其他藥劑混用或與負(fù)交互抗藥性的殺菌劑輪換使用，延長(zhǎng)其使用壽命。