寧夏地區(qū)歐李根癌病病原菌鑒定及防治藥劑篩選1)

趙巖 白田田 顧欣 王新譜 馬文禮 王昊 楊波

(寧夏大學(xué)，銀川，750021) (寧夏農(nóng)墾農(nóng)林牧技術(shù)推廣服務(wù)中心)

The experiment was conducted to identify and screen microbicides against crown gall of Cerasus humilis in Ningxia. The pathogen was isolated using tissue isolation method. The pathogenicity of carrot and sunflower was determined according to robertkoch’s law using carrot and sunflower as indicator plants. The morphological, physiological and biochemical properties were analyzed, and 16S rDNA sequence analysis was used for classification and identification. The toxicity of nine low-toxic microbicides was tested by using the inhibition zone method of filter paper, and the microbicides with strong inhibitory effect on the pathogenic bacteria were screened out, and the control effect was verified with sunflower as the indicator plant. The results showed that ATJ1 strain isolated from the root cancer tissue of C. humilis could obviously proliferate on the inoculation site of carrot disk and sunflower, and was pathogenic. The ATJ1 strain was classified as Agrobacterium tumefaciens biotype I. In the indoor agent screening, tetramycin and ethephon had the best control effect, with 83.80% and 72.55% inhibition at 400×dilution, and EC50 of 5.13 and 985.75 mg/L, respectively. In pot experiments, both tetramycin and ethylicin had strong antibacterial effects on the pathogen ATJ1. No disease occurred at the inoculation site of sunflower, but high concentration of the drug would lead to phytotoxicity. Therefore, low concentrations (≥1 200×dilution) of tetramycin or ethylicin are suitable for the control of Agrobacterium tumefaciens in C. humilis.

歐李(Cerasushumilis(Bge.) Sok.)，薔薇科(Rosaceae)櫻桃屬(Ceraras)多年生落葉灌木，因果實(shí)富含活性鈣，又稱鈣果[1]，為我國特有的果樹資源。歐李的根蘗更新能力強(qiáng)，根系發(fā)達(dá)，具有抗寒耐旱、耐瘠薄、耐鹽堿等特性，果實(shí)色澤鮮艷，風(fēng)味獨(dú)特，營養(yǎng)豐富，具有較高的開發(fā)利用和研究價(jià)值[2-4]。2011年，寧夏香山地區(qū)壓砂地試種歐李成功，全區(qū)多地進(jìn)行引種栽培，種植面積擴(kuò)大至約1 400 hm2。2015年，寧夏多地發(fā)現(xiàn)歐李根癌病。隨著種植年限增加和栽培面積擴(kuò)大，該病害在寧夏呈蔓延趨勢，對當(dāng)?shù)貧W李產(chǎn)業(yè)發(fā)展造成嚴(yán)重威脅。

果樹根癌病是由根癌土壤桿菌引起的土傳植物病害[5]。該菌寄主范圍廣，已知可侵染93科331屬643種植物[6]，涉及核果、漿果、堅(jiān)果類果樹和其他觀賞類植物[7]。病原菌的侵染可誘導(dǎo)植株大量合成生長素和細(xì)胞分裂素，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖，在根頸、側(cè)根部位形成大小不一的冠癭[8-9]。植株患病早期，樹體的地上部無明顯癥狀。隨著冠癭數(shù)量和體積的增加，植株細(xì)根數(shù)量減少，生長遲緩，樹勢逐漸衰弱，直至全株枯死，造成林果業(yè)嚴(yán)重?fù)p失[10-11]。根據(jù)生理生化特征和致病性差異，根癌土壤桿菌被分為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型3種生物型[12-13]。桃、蘋果和櫻桃的根癌病菌為生物Ⅰ型或Ⅱ型，葡萄根癌病菌為生物Ⅲ型[14-17]。歐李根癌病病原菌及其生物型有待確定。

果樹根癌病是典型的土傳病害，主要防治技術(shù)包括選育抗病品種、物理切除、化學(xué)防治和生物防治[18]。其中，選育抗病品種難度高、耗時(shí)長；根癌組織增生發(fā)生在植株根部，對其進(jìn)行物理切除既對植株造成傷害，又無法根治，易導(dǎo)致反復(fù)發(fā)??；化學(xué)防治主要采用蘸根、灌根或涂抹法，常用藥劑有石硫合劑、硫酸銅、波爾多液和三氯異氰尿酸等[19-20]，寧夏歐李栽培區(qū)土壤均為堿性[21]，大量使用石硫合劑和波爾多液等堿性藥劑不利于植物生長，硫酸銅和波爾多液等含銅化合物使用過量易造成環(huán)境污染[22]，三氯異氰尿酸對根癌土壤桿菌具有較強(qiáng)的抑制效果[20]，但是其與銨鹽、氨、尿素混合可生成易爆的三氯化氮，遇有機(jī)物易燃，不適用于大田管理；根癌病的生物防治主要利用農(nóng)用抗生素、生物源殺菌劑或生防菌，如春雷霉素、農(nóng)用鏈霉素、大蒜、生姜、青蒿等的提取物和K84放線菌菌劑等[23-25]，由于生姜和青蒿等的提取物研究多處于試驗(yàn)階段，K84菌劑只能對植株提供短期保護(hù)[26]，因此，防治根癌病仍以化學(xué)殺菌劑、農(nóng)用抗生素和生物源殺菌劑為主。為了兼顧防病效果和環(huán)境保護(hù)，尋找針對歐李根癌病的高效、低毒、無污染的殺菌劑具有重要意義。

為明確寧夏歐李根癌病的病原菌并篩選出高效的防治藥劑，本研究開展歐李根癌病病情調(diào)查和病原菌的分離鑒定，以胡蘿卜和向日葵為指示植物進(jìn)行致病性檢測，并選取4種低毒化學(xué)殺菌劑和4種生物源殺菌劑，經(jīng)室內(nèi)毒力測定和植物藥效試驗(yàn)，篩選能有效防治歐李根癌病的低毒殺菌劑，為該病害的綠色防控提供參考。

1 材料與方法

歐李：2年生，農(nóng)大四號。

致病性檢測材料：胡蘿卜(春紅二號)和向日葵(金谷葵3號)。

MW培養(yǎng)基：甘露醇10.0 g，生物素100.0 μg，KH2PO40.3 g，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的Fe-EDTA 2.0 mL，NaNO35.0 g，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的結(jié)晶紫2.0 mL，NaCl 0.2 g，瓊脂粉15.0 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min，用于病原菌的分離。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)：用于病原菌的活化、保存和殺菌劑的室內(nèi)毒力測定。

NA液體培養(yǎng)基：NA培養(yǎng)基不加瓊脂，用于菌株液體培養(yǎng)。

8種殺菌劑的信息如表1。

表1 試驗(yàn)用殺菌劑信息

歐李根癌病病株采集：2020年6月，在寧夏簡泉(38°50′37″N，106°28′53″E)歐李栽培區(qū)調(diào)查發(fā)病植株，采集全株，觀察并記錄植株病狀和冠癭增生情況，完成病變組織的采集。

病原菌分離：將冠癭縱向剖開，刮取內(nèi)部組織。采用馬德欽等[27]的病原菌組織分離法，將病變組織稀釋液接種到MW培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，挑取不同形態(tài)的菌株進(jìn)行劃線純化，直至獲得純菌株，編號保存。

致病性鑒定：菌株用NA固體培養(yǎng)基置于28 ℃條件下活化48 h，挑取1環(huán)接種于NA液體培養(yǎng)基，搖床設(shè)置28 ℃、150 r/min培養(yǎng)48 h，制備為1 mL含1×108CFU活菌的菌懸液。

選擇新鮮、無損傷的胡蘿卜，清水洗凈，用75%乙醇擦洗后過火干燥，切成圓片放在鋪有水瓊脂的培養(yǎng)皿內(nèi)，靠近根端的一面朝上。采用涂抹法接種，用無菌棉棒蘸取菌懸液均勻涂抹在胡蘿卜盤上。每個(gè)菌株接種5個(gè)盤，以無菌水為對照，置于溫度28 ℃、相對濕度85%、12 h光照/12 h黑暗條件下，培養(yǎng)14 d，觀察并統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況。

選取株高10 cm的健康向日葵，以距地面3 cm的莖桿處為接種部位。先用75%乙醇消毒表面，以無菌接種針圍繞莖桿輕刺4～6針，深度約1 mm，然后用無菌棉棒蘸取菌懸液涂抹針刺部位接種，每個(gè)菌株接種5株植株，以無菌水為對照。用保鮮膜包裹涂抹處以保濕。置于溫度為(28±5)℃、自然光照條件下的溫室培養(yǎng)30 d，觀察接種部位增生情況。測量接種部位和接種部位上下各1 cm處的莖粗，按以下公式計(jì)算接種部位增生厚度。接種部位增生厚度=接種部位莖粗-(上莖粗+下莖粗)/2。

分類鑒定：挑取純化后的菌株接種到MW平板上劃線并置于28 ℃培養(yǎng)48 h，觀察單菌落形態(tài)。在油鏡下觀察菌體形態(tài)，生理生化鑒定參照任欣正等[28]的方法，根癌土壤桿菌生物型的檢測方法參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[29]。

提取病原菌DNA，對其16S rDNA進(jìn)行克隆、電泳和回收，委托南京奧維森基因科技有限公司完成測序。將測序結(jié)果提交至GenBank獲得序列號，并使用BLAST在美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，依據(jù)菌株序列比對信息，對菌株進(jìn)行分子鑒定。在數(shù)據(jù)庫中選取相近種屬基因序列，使用MegaX系統(tǒng)分析軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定菌株的分類地位。

室內(nèi)毒力測定：采用濾紙片抑菌圈法測定8種殺菌劑對病原菌的室內(nèi)毒力。用無菌水制備殺菌劑的400、600、800、1 000、1 200、1 600、2 400倍的稀釋液。將直徑6.0 mm的無菌干燥濾紙片在殺菌劑稀釋液中蘸取2 s。在NA平板上加0.2 mL菌懸液，涂抹均勻，每皿中間放1個(gè)浸藥濾紙片，每處理5個(gè)重復(fù)，以無菌水為對照，先將平皿倒置，于4 ℃培養(yǎng)12 h，使殺菌劑擴(kuò)散和滲透均勻，再轉(zhuǎn)置，于28 ℃培養(yǎng)24 h，觀察是否出現(xiàn)抑菌圈。以十字交叉法測量抑菌圈直徑，計(jì)算不同殺菌劑的抑菌率，公式為：抑菌率=[(處理組抑菌圈直徑-對照組抑菌圈直徑)/處理組抑菌圈直徑]×100%。將不同稀釋倍數(shù)處理的抑菌率轉(zhuǎn)換成幾率值(通過查“死亡百分率與幾率值單位的轉(zhuǎn)換表”，抑菌率相當(dāng)于死亡率)，將其作為因變量(Y)，每個(gè)稀釋度值的對數(shù)值作為自變量(X)，利用最小二乘法建立回歸方程Y=A+BX(A為截矩，B為回歸系數(shù))[30]，獲得供試殺菌劑的半最大效應(yīng)濃度(EC50)值和相關(guān)系數(shù)(R2)。

防治效果盆栽試驗(yàn)：選取抑菌率最高和較高的殺菌劑。按致病性鑒定方法在向日葵莖桿上接種病原菌，2 h后用滅菌脫脂棉蘸取殺菌劑稀釋液涂抹接種部位。以不接種病原菌，只涂抹無菌水為NCK；接種病原菌，再涂抹無菌水為CK。其他處理和培養(yǎng)條件同“致病性鑒定”，每處理5個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)30 d，觀察接種部位組織增生情況。

利用SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 歐李根癌病的田間發(fā)病癥狀

病株的冠癭主要發(fā)生在根基部、主根和側(cè)根上，植株長勢未見明顯異常(圖1A)。冠癭數(shù)量多為1～5個(gè)，偶見6個(gè)。冠癭表面堅(jiān)硬、龜裂，呈黑褐色，外層組織壞死，有輕微腐朽。內(nèi)部呈土黃色和黃色，組織較軟(圖1B)。新生組織呈黃色，表面可見龜裂的新鮮韌皮組織(圖1C)。

A為發(fā)病植株，黃色箭頭指示根部的冠癭；B為冠癭剖面；C為冠癭。

2.2 病原菌分離與致病性測定

從冠癭中分離獲得20株細(xì)菌，分別進(jìn)行致病性鑒定。涂抹無菌水的胡蘿卜盤和向日葵莖桿無明顯增生(圖2A和圖2C)。不同菌株的致病性具有差異，其中ATJ1菌株的致病性最強(qiáng)。接種14 d，胡蘿卜盤上出現(xiàn)乳白色腫瘤狀增生凸起(圖2B)。接種30 d，向日葵莖桿上形成腫瘤狀增生凸起(圖2D)。向日葵莖桿上的瘤體，初生時(shí)呈綠色，表面少量龜裂；成熟瘤體的皮層老化嚴(yán)重，呈黑褐色，表面龜裂更深。

A為接種無菌水的胡蘿卜盤；B為接種ATJ1的胡蘿卜盤；C為接種無菌水的向日葵；D為接種ATJ1的向日葵；黃色箭頭指示接種部位。

2.3 菌株的分類鑒定

ATJ1菌株在MW培養(yǎng)基上置于28 ℃條件下培養(yǎng)48 h。菌落如圖3A，呈灰白色，圓形突起，半透明，邊緣整齊，有光澤。菌體呈短桿狀，如圖3B，大小為(0.8 μm×1.5 μm)～(0.8 μm×3.0 μm)，無莢膜和芽孢。

A為ATJ1在MW培養(yǎng)基上的菌落；B為油鏡下觀察到的ATJ1菌體(1000倍)。

將ATJ1菌株的基因測序結(jié)果登入NCBI，Genbank編號為MW541859，經(jīng)基因序列BLAST比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖4所示，ATJ1與AgrobacteriumtumefaciensIAM 12048(NR_041396.1)菌株位于進(jìn)化樹同一分枝上，相似度100%，確定ATJ1菌株為根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)。

圖4 菌株ATJ1的系統(tǒng)發(fā)育樹

ATJ1菌株的生理生化性質(zhì)和生物型檢測結(jié)果如表2。依據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》檢測根癌土壤桿菌生物型的方法[29]，確定ATJ1菌株為根癌土壤桿菌生物I型菌株。

表2 ATJ1生理生化性質(zhì)檢測結(jié)果

2.4 室內(nèi)毒力測定

濾紙片抑菌試驗(yàn)結(jié)果如表3和表4，8種殺菌劑對病原菌的抑菌效果具有差異。四霉素400～2 400倍稀釋液對病原菌都具有抑菌作用，抑菌圈直徑為51.73～6.45 mm，抑菌率為83.80%～39.21%，效果最好。乙蒜素400～2 400倍稀釋液的抑菌圈直徑為26.43～4.21 mm，抑菌率為72.55%～29.63%。甲基硫菌靈400倍和600倍稀釋液的抑菌圈直徑分別為15.11和5.16 mm，抑菌率為60.18%和34.04%，其他稀釋倍數(shù)無抑菌效果。春雷霉素、喹啉銅、硫酸鏈霉素、噻唑鋅等處理均無抑菌效果。因此，四霉素和乙蒜素對病原菌ATJ1具有較好的抑菌作用。

表3 不同殺菌劑對ATJ1菌株的抑菌圈直徑

表4 不同殺菌劑對ATJ1菌株的抑菌率

根據(jù)毒力回歸方程求得幾率值為5(即抑菌率為50%)時(shí)的質(zhì)量濃度即為ρ(EC50)。由表5可知，四霉素對病原菌ATJ1的ρ(EC50)為5.13 mg/L，乙蒜素的ρ(EC50)為985.75 mg/L。

表5 不同殺菌劑對ATJ1菌株的EC50值

2.5 防治效果盆栽試驗(yàn)

在向日葵莖桿上進(jìn)行四霉素和乙蒜素的防效測定。結(jié)果如表6，所有涂抹四霉素和乙蒜素的部位均未出現(xiàn)組織增生現(xiàn)象。但是2種藥劑400～1 000倍稀釋液對向日葵組織產(chǎn)生藥害，莖稈接種部位收縮、變黑直至干枯。稀釋倍數(shù)1 200～2 400處理未出現(xiàn)藥害，其接種部位和NCK基本一致。說明低質(zhì)量濃度的四霉素和乙蒜素適用于作物上根癌病原菌的防控。

表6 四霉素和乙蒜素的防治效果

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，寧夏栽培區(qū)歐李根癌病致病菌為根癌土壤桿菌生物I型，與櫻桃[31]、梨[32]等果樹根癌病病原菌同種，為該病害的致病機(jī)制研究和科學(xué)防治提供了參考。

果樹根癌病是土傳病害，病原菌可長期在土壤中生存，加之栽培環(huán)境復(fù)雜，導(dǎo)致防治難度較大。針對果樹根癌病已開展部分殺菌劑的篩選。如農(nóng)用硫酸鏈霉素和乙蒜素對葡萄根癌病菌具有顯著的室內(nèi)抑菌效果[19]。四霉素、乙蒜素和農(nóng)用鏈霉素對櫻桃根癌病菌的ρ(EC50)分別為3.03、538.27、1 435.82 mg/L[23]。本研究與前人研究結(jié)果具有差異，室內(nèi)毒力測定結(jié)果顯示，只有四霉素、乙蒜素和高質(zhì)量濃度甲基硫菌靈對歐李根癌病菌具有一定抑菌效果。其中四霉素和乙蒜素的ρ(EC50)分別為5.13和985.75 mg/L，顯著高于櫻桃根癌病的抑菌試驗(yàn)結(jié)果，可能由病原菌不同菌株的生物學(xué)特性差異引起。

四霉素又稱梧寧霉素，屬于大環(huán)內(nèi)酯四烯抗生素，是不吸水鏈霉菌梧州亞種(Streptomycesahygroscopicnwuzhouensisn subsp.)的發(fā)酵代謝物。作為廣譜生物殺菌劑，四霉素對3大類病原真菌(子囊菌、擔(dān)子菌和半知菌)和2大類病原細(xì)菌(革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌)均有極強(qiáng)的抑制作用[33]，已用于小麥赤霉病、白粉病、楊樹潰瘍病、細(xì)菌性角斑病和稻瘟病等的防治[34-35]。但是，四霉素對根癌土壤桿菌的抑菌機(jī)制有待進(jìn)一步研究。乙蒜素是大蒜素衍生物，屬于生物源農(nóng)藥，其抑菌機(jī)制主要是作用于病原菌體內(nèi)含硫基的化合物，導(dǎo)致菌體代謝異常，從而起到抑菌作用[36]。乙蒜素還能增強(qiáng)植物光合作用，調(diào)節(jié)植物生長，促進(jìn)傷口愈合再生，有利于弱苗根系復(fù)壯、老化根系復(fù)蘇，提高作物抗病能力[37]。甲基硫菌靈是一種廣譜性、內(nèi)吸性、低毒殺真菌劑，其高質(zhì)量濃度時(shí)也具有殺細(xì)菌效果，但是機(jī)制未明[38]。本研究中，只有高質(zhì)量濃度甲基硫菌靈對歐李根癌病菌具有一定抑菌作用，其不宜用于根癌病的田間防治。

本研究明確了寧夏栽培區(qū)歐李根癌病致病菌為根癌土壤桿菌生物I型，經(jīng)室內(nèi)毒力測定和盆栽防效試驗(yàn)證明，四霉素和乙蒜素對該病原菌的防治效果較好。建議在歐李移栽前用低質(zhì)量濃度(稀釋倍數(shù)≥1 200倍)乙蒜素或四霉素蘸根處理種苗，防治根癌病的發(fā)生。