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    松郁安神方聯(lián)合阿普唑侖對失眠大鼠基底核多巴胺受體和γ-氨基丁酸受體的影響

    2023-03-24 04:32:36王秀峰張瑜張一帆黃俊山
    世界睡眠醫(yī)學(xué)雜志 2023年11期
    關(guān)鍵詞:中醫(yī)藥療法

    王秀峰 張瑜 張一帆 黃俊山

    摘要?目的:觀察松郁安神方聯(lián)合阿普唑侖對失眠大鼠睡眠狀態(tài)及基底核多巴胺受體和γ-氨基丁酸(GABA)受體的影響。方法:將SPF級雄性SD大鼠分為對照組(8只)和造模組40只,造模組采用腹腔注射對氯苯丙氨酸(PCPA)建立失眠大鼠模型,造模成功后隨機(jī)分為模型組、阿普唑侖低劑量組(0.04 mg/kg)、阿普唑侖高劑量組(0.08 mg/kg)、松郁安神方組(17 g/kg)及松郁安神方聯(lián)合阿普唑侖低劑量組,每組8只,灌胃相應(yīng)藥物,對照組和模型組灌胃等容積生理鹽水,1次/d,連續(xù)7 d。期間觀察各組大鼠一般生理狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,通過Western blotting檢測大鼠基底核多巴胺受體和GABA受體蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果:松郁安神方聯(lián)合阿普唑侖低劑量組大鼠飲食、睡眠等生理活動接近對照組,毛色有光澤,體質(zhì)量較阿普唑侖高劑量組顯著增加(P<0.01),且基底核GABAA受體蛋白表達(dá)量顯著高于阿普唑侖低、高劑量組(P<0.01),多巴胺D2受體(D2DR)蛋白表達(dá)量顯著低于阿普唑侖低、高劑量組(P<0.01)。結(jié)論:松郁安神方能夠通過降低阿普唑侖對失眠大鼠的使用劑量,增強(qiáng)阿普唑侖的鎮(zhèn)靜催眠作用,并降低其不良反應(yīng)。松郁安神方能夠增強(qiáng)阿普唑侖對失眠大鼠基底核GABAA受體蛋白的上調(diào)作用和對D2DR蛋白表達(dá)的抑制作用,其機(jī)制可能與調(diào)控失眠大鼠基底核多巴胺受體和GABA受體信號通路相關(guān)。

    關(guān)鍵詞?松郁安神方;阿普唑侖;多巴胺受體;γ-氨基丁酸受體;腦組織學(xué);醫(yī)用實(shí)驗(yàn)動物學(xué);中醫(yī)藥療法

    Effects of Songyu Anshen Prescription combined with Alprazolam on Dopamine Receptor and Gamma-aminobutyric Acid Receptor in the Basal Nucleus of Insomnia Rats

    WANG Xiufeng,ZHANG Yu,ZHANG Yifan,HUANG Junshan

    (Fujian Academy of Chinese Medical Sciences,F(xiàn)ujian Key Laboratory of Sleep Medicine of Traditional Chinese Medicine,National Inheritance Office of Famous TCM Experts HUANG Jun-shan,F(xiàn)uzhou 350003,China)

    Abstract?Objective:To observe the effects of Songyu Anshen Prescription combined with Alprazolam on sleep state,dopamine receptor and Gamma-aminobutyric acid(GABA) receptor in the basal nucleus of insomnia rats.Methods:SPF male SD rats were divided into control group(8) and modeling group(40).The insomnia rat model was established by intraperitoneal injection of p-chlorophenylalanine(PCPA) in the modeling group.After successful modeling,they were randomly divided into model group,Alprazolam low-dose(0.04 mg/kg),Alprazolam high-dose group(0.08 mg/kg),Songyu Anshen Prescription group(17 g/kg) and Songyu Anshen Prescription combined with Alprazolam low-dose group,with 8 in each group,and the corresponding drugs were gavage,and the control group and model group were gavage with equal volume of normal saline once a day.7 consecutive days.During this period,the general physiological state of rats in each experimental group was observed.After the experiment,the expression of dopamine receptor and GABA receptor proteins in the basal nucleus of rats was detected by Western blotting.Results:Songyu Anshen Prescription combined with Alprazolam low-dose group diet,sleep and other physiological activities close to the normal control group,glossy hair color,body mass significantly increased than Alprazolam high-dose group(P<0.01).Moreover,the expression of GABAA receptor protein in the basal nucleus was significantly higher than that in low-dose and high-dose Alprazolam groups(P<0.01); The expression of Dopamine D2 receptor(D2DR) protein was significantly lower than that of Alprazolam low-dose and high-dose group(P<0.01).Conclusion:Songyu Anshen Prescription can enhance the sedative and hypnotic effect of alprazolam and reduce its adverse reactions by reducing the dosage of alprazolam in insomnia rats.Songyu Anshen Prescription can enhance the up-regulation effect of alpzolam on GABAA receptor protein in the basal nucleus of insomnia rats and inhibit the expression of D2DR protein,its mechanism may be related to the regulation of dopamine receptor and GABA receptor signaling pathways in the basal nucleus of insomnia rats.

    Keywords?Songyu Anshen Prescription; Alprazolam; Dopamine receptor; Gamma-aminobutyric acid receptor; Brain histology; Medical Laboratory Zoology; Traditional Chinese Medicine Therapy

    中圖分類號:R242;R-332;R338.63;R329.4??文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A??doi:10.3969/j.issn.2095-7130.2023.11.072

    睡眠障礙嚴(yán)重影響人們的生產(chǎn)和生活,失眠是其最常見的表現(xiàn)形式。目前,參與睡眠調(diào)控的機(jī)制還不是很清楚,臨床以心理與鎮(zhèn)靜催眠藥治療為主,這些方法對失眠患者具有一定的療效[1]。苯二氮?類藥物如阿普唑侖是臨床上常用的鎮(zhèn)靜催眠藥物,能夠快速發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用。但是,它易產(chǎn)生藥物依賴性,長期使用還會產(chǎn)生成癮性,停藥后會反彈,還對人體產(chǎn)生不良反應(yīng)[2]。松郁安神方[3-6]經(jīng)過長期的臨床實(shí)踐,證明其對改善失眠臨床癥狀和某些實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)行之有效,重視個(gè)體辨證論治,不良反應(yīng)小。但是,其鎮(zhèn)靜催眠的作用不及西藥。探討松郁安神方聯(lián)合阿普唑侖治療失眠,取長補(bǔ)短,發(fā)揮更安全高效的治療失眠的模式,并進(jìn)一步加深其機(jī)制研究,具有重要科學(xué)意義。

    1?材料與方法

    1.1?材料

    1.1.1?動物?無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬祝⊿prague Dawley,SD)大鼠,雄性,體質(zhì)量(250±10)g,由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供(許可證號:SCXK(滬)20017-0005)。飼養(yǎng)于恒溫、恒濕和12 h∶12 h固定明暗節(jié)律的安靜環(huán)境下,自由攝取食物和水。本研究所涉及動物實(shí)驗(yàn)過程遵守動物福利,經(jīng)福建省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物福利倫理委員會批準(zhǔn)(倫理審批號:FJATCM-IAEC2022025)。

    1.1.2?試劑?對氯苯丙氨酸(4-Chloro-DL-phenylalanine,PCPA)(C6506-25G)購于Sigma公司。阿普唑侖片(批號:AZ211119),購于江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司。D2DR Antibody(B-10)(sc-5303)、γ-氨基丁酸A型(GABAA)Rα1-6(E-8)(sc-376282)購于Santa Cruz公司。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(14C10) Rabbit mAb(CST:#2118S);Anti-mouse IgG,HRP-linked Antibody(CST:#7076S);Anti-rabbit IgG,HRP-linked Antibody(CST:#7074S)購于CST公司。

    1.1.3?實(shí)驗(yàn)藥物?松郁安神方藥物組成:甘松10 g、郁金15 g、玫瑰花10 g、生龍骨30 g、珍珠母30 g、首烏藤30 g、丹參15 g、酸棗仁15 g。購于鷺燕(福建)藥業(yè)股份有限公司。藥物一次性煎煮,分裝后-20 ℃保存?zhèn)溆谩4笫笥昧繛槌扇?倍(按體質(zhì)量計(jì)算)劑量,按15 mL/kg灌胃給藥,1次/d,給藥時(shí)間1周[4]。

    1.2?治療方法

    1.2.1?失眠大鼠模型的建立及分組?采用目前較為公認(rèn)的PCPA法造模:PCPA按300 mg/kg溶于弱堿性生理鹽水中,配置成混懸液,以15 mL/kg連續(xù)腹腔注射2 d。大鼠出現(xiàn)晝夜節(jié)律消失,白天夜晚活動不停,睡眠減少直至消失,進(jìn)食及飲水增多,表示造模成功。造模成功后的40只大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、阿普唑侖低劑量組、阿普唑侖高劑量組、松郁安神方聯(lián)合阿普唑侖低劑量組和松郁安神方組,每組8只。對照組8只不造模[3-4]

    1.2.2?給藥方法?松郁安神方組按17 g/kg灌胃給藥,1次/d,1周。阿普唑侖低劑量組、阿普唑侖高劑量組分別按0.04、0.08 mg/kg灌胃給藥,1次/d,1周。松郁安神方聯(lián)合阿普唑侖低劑量組用松郁安神方組和阿普唑侖低劑量組聯(lián)合用藥。對照組和模型組灌胃等容積生理鹽水,1次/d,1周。

    1.2.3?檢測指標(biāo)與方法

    1.2.3.1?實(shí)驗(yàn)動物取材?實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),將稱質(zhì)量后的大鼠,腹腔注射1%戊巴比妥鈉(按45 mg/kg)進(jìn)行麻醉。腹主動脈取血5 mL裝到抗凝管中,離心取上清,分裝EP管中凍存?zhèn)溆?。取血后,剪開頭皮,用血管鉗揭去顱骨和硬腦膜,剪斷雙側(cè)視神經(jīng)后用眼科鑷子迅速取出大鼠的整個(gè)腦組織,用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈,分離所需要的海馬、下丘腦、基底核等組織,分別置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.3.2?Western blotting蛋白檢測?將所取組織按10 mg/100 μL加入Western細(xì)胞裂解液,經(jīng)勻漿、超聲粉碎后12 000 r/min低溫離心5 min,取上清液;采用BCA法定蛋白濃度,95 ℃變性,SDS-PAGE凝膠電泳,濃縮膠80 V,30 min和分離膠120 V,90 min;300 mA轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉60 min;上一抗4 ℃過夜,HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h,ECL顯色,圖像分析。應(yīng)用Image J分析軟件分析上述結(jié)果。

    2?結(jié)果

    2.1?各組大鼠一般情況觀察?實(shí)驗(yàn)期間對大鼠的生理狀態(tài)進(jìn)行觀察,對照組大鼠飲食沒有明顯的變化,體質(zhì)量緩慢增加,睡眠活動正常,毛色有光澤,其他生理狀況正常。模型組大鼠白天活動比對照組增加,睡眠減少,精神狀態(tài)差,煩躁、易激惹,毛色欠光澤。模型組大鼠體質(zhì)量增長與對照組、松郁安神方聯(lián)合阿普唑侖低劑量組和松郁安神方組比較均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與阿普唑侖高劑量組、模型組比較,松郁安神方聯(lián)合阿普唑侖低劑量組、松郁安神方組,大鼠體質(zhì)量均增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01,P<0.05)。見圖1。說明松郁安神方聯(lián)合阿普唑侖低劑量組和松郁安神方組在改善失眠引起的癥狀上整體優(yōu)于單獨(dú)使用阿普唑侖組。

    2.2?各組大鼠基底核GABAA受體蛋白表達(dá)比較???采用Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測GABAA受體蛋白表達(dá)量,結(jié)果顯示,與對照組比較,模型組大鼠基底核GABAA受體蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.01)。與模型組比較,各用藥組大鼠基底核GABAA受體蛋白表達(dá)量均顯著上調(diào)(P<0.01)。與松郁安神方聯(lián)合阿普唑侖低劑量組比較,阿普唑侖低劑量組、阿普唑侖高劑量組和松郁安神方組基底核GABAA受體蛋白表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與阿普唑侖低劑量組相比,阿普唑侖高劑量組、松郁安神方組及松郁安神方聯(lián)合阿普唑侖低劑量組GABAA受體蛋白表達(dá)量均顯著上調(diào)(P<0.01)。見圖2。

    2.3?各組大鼠基底核多巴胺D2受體(D2DR)蛋白表達(dá)比較?采用Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測各組大鼠基底核D2DR蛋白的表達(dá)量,結(jié)果顯示,與對照組比較,模型組大鼠基底核D2DR蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.01)。與模型組比較,各觀察組大鼠基底核D2DR蛋白表達(dá)量均顯著下調(diào)(P<0.01)。與松郁安神方聯(lián)合阿普唑侖低劑量組比較,阿普唑侖低劑量組、阿普唑侖高劑量組和松郁安神方組基底核D2DR蛋白表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與阿普唑侖高劑量組比較,阿普唑侖低劑量組、松郁安神方組基底核D2DR蛋白表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,P<0.05)。阿普唑侖低劑量組基底核D2DR蛋白表達(dá)量與松郁安神方組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖3。

    3?討論

    隨著社會的快速發(fā)展,失眠患者的人數(shù)也在逐年增長。據(jù)統(tǒng)計(jì),中國成年人睡眠障礙發(fā)生率約為40%,高于國外發(fā)達(dá)國家的失眠發(fā)生率[7]。目前,臨床上常用的鎮(zhèn)靜催眠藥物,可以增強(qiáng)神經(jīng)抑制功能,縮短睡眠潛伏期,減少覺醒次數(shù),快速發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用[8]。長期使用該類藥物,會影響睡眠時(shí)相發(fā)生改變,使得快速眼動睡眠時(shí)間減少,淺睡眠比例增多,不能提高睡眠質(zhì)量,甚至還會使得記憶能力下降[9]。這些藥物雖然鎮(zhèn)靜催眠作用強(qiáng),起效快,但是并沒有從根本上解決失眠對患者的困擾,對于失眠患者的生命質(zhì)量提高不足。因此,還不能稱之為理想的失眠治療藥物。

    中醫(yī)藥經(jīng)過長期的臨床實(shí)踐,證明其對改善失眠有效,不良反應(yīng)小。但是,其理論基礎(chǔ)尚未明確,辨證缺乏客觀依據(jù),制約了其發(fā)展和推廣。近幾年,越來越多的學(xué)者開始關(guān)注和進(jìn)行西藥聯(lián)合其他輔助方式治療失眠的研究。比如認(rèn)知療法[10]、中醫(yī)心理[11]、中藥復(fù)方[12-19]等輔助方法聯(lián)合西藥治療失眠取得了很好的臨床療效。聯(lián)合治療效果比單獨(dú)使用西藥鎮(zhèn)靜催眠效果好,并且不良反應(yīng)降低,失眠患者的生命質(zhì)量得到明顯改善。

    本研究通過松郁安神方、阿普唑侖單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用治療失眠大鼠,發(fā)現(xiàn)松郁安神方聯(lián)合阿普唑侖低劑量組的大鼠一般生理狀態(tài)優(yōu)于阿普唑侖低劑量、高劑量單獨(dú)用藥組,大鼠飲食、睡眠等生理活動接近對照組,毛色有光澤,體質(zhì)量較阿普唑侖高劑量組顯著增加(P<0.01)。

    臨床上常用的鎮(zhèn)靜催眠藥物中,作用于GABA通路的藥物仍然占據(jù)主導(dǎo)地位[20],GABA是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。本課題組前期實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn),松郁安神方能夠調(diào)節(jié)失眠大鼠腦組織中GABA的含量,改善睡眠[21]。GABA主要通過與其受體結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)作用。本研究通過Western blotting檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),松郁安神方聯(lián)合阿普唑侖低劑量組的大鼠基底核GABAA受體蛋白表達(dá)量顯著高于阿普唑侖低劑量組、阿普唑侖高劑量組(P<0.01)。說明松郁安神方能夠增強(qiáng)阿普唑侖對失眠大鼠基底核GABAA受體蛋白的上調(diào)作用。

    多巴胺是腦內(nèi)含量最多的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)之一,調(diào)控與覺醒相關(guān)的運(yùn)動、認(rèn)知等多種行為[22]。多巴胺也是通過與其受體結(jié)合發(fā)揮生理功能,研究發(fā)現(xiàn)D2DR是維持覺醒的重要受體[23]?;蚯贸鼶2DR的動物覺醒時(shí)間明顯減少,快速眼動睡眠(REM)和非快速眼動睡眠(NREM)時(shí)間增加[24]。本研究通過Western blotting檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),松郁安神方聯(lián)合阿普唑侖低劑量組的大鼠基底核D2DR蛋白表達(dá)量顯著低于阿普唑侖低劑量組、阿普唑侖高劑量組(P<0.01)。說明松郁安神方能夠增強(qiáng)阿普唑侖對失眠大鼠基底核D2DR蛋白表達(dá)的抑制作用。

    綜上所述,松郁安神方能夠通過降低阿普唑侖對失眠大鼠的使用劑量,增強(qiáng)阿普唑侖的鎮(zhèn)靜催眠作用,降低其不良反應(yīng)。其機(jī)制可能與調(diào)控失眠大鼠基底核多巴胺受體和GABA受體信號通路相關(guān)。

    利益沖突聲明:無。

    參考文獻(xiàn)

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    基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81703843);福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2021J01914);福建省中醫(yī)藥科研項(xiàng)目(2021zyjc05);福建省科技廳省屬公益類科研院所基本科研專項(xiàng)(2022R1003001)作者簡介:王秀峰(1980—),女,博士,助理研究員,研究方向:中醫(yī)藥防治睡眠障礙的基礎(chǔ)研究,E-mail:wxf227108@sina.com通信作者:黃俊山(1958—),男,主任醫(yī)師,教授,研究方向:中醫(yī)藥防治睡眠障礙的基礎(chǔ)研究,E-mail:hjsh0825@163.com

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