HPLC法與GC法測定清眩片中藁本內(nèi)酯含量的比較

彭建彪 龍凱 許春梅 趙遠(yuǎn)翠

基金項目：

作者簡介：

彭建彪（1982—），男，彝族，本科，主管藥師，研究方向為藥物分析。E-mail：745058323@qq.com

通信作者：

【摘? 要】

目的：比較HPLC法與GC法測定清眩片中藁本內(nèi)酯含量的優(yōu)劣，為清眩片中藁本內(nèi)酯含量測定提供參考。方法：以藁本內(nèi)酯為對照品，分別采用HPLC法與GC法對方中川芎進(jìn)行含量測定。HPLC法色譜條件：用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱（依利特 SinoChrom ODS-BP 4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相：甲醇-水（70∶[KG-*3/5]30）；檢測波長：326nm；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃。GC法色譜條件：采用（50%）二苯基-（50%）二甲基聚硅氧烷為固定液的毛細(xì)管柱（HP-50+ 0.50μm，0.32 mm，30 m）；程序升溫，起始溫度為110℃，維持2 min，以7℃/min的速率升溫至180℃，再以10℃/min的速率升溫至220℃，維持5 min；進(jìn)樣口溫度250℃；檢測器（FID）溫度260℃；以氮?dú)鉃檩d氣，流速為5.0mL/min。結(jié)果：HPLC法藁本內(nèi)酯在0.0776～1.5510 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.9999，平均回收率為99.79%（RSD=0.29%，N=6）。GC法藁本內(nèi)酯在0.0078～0.1551 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.9992，平均回收率為105.75%（RSD=1.93%，N=6）。結(jié)論：兩種方法均可以準(zhǔn)確測定清眩片中藁本內(nèi)酯的含量，HPLC法準(zhǔn)確度與精密度都優(yōu)于GC法，可以作為清眩片中藁本內(nèi)酯含量測定的首選方法。GC法具有靈敏度高、分析成本低等優(yōu)勢可以作為清眩片中藁本內(nèi)酯含量測定的備選方法。

【關(guān)鍵詞】? 清眩片；藁本內(nèi)酯；含量測定；HPLC；GC

【中圖分類號】R284.1??? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2023）24-0041-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.24.zgmzmjyyzz202324009

Determination of Ligustilide in Qingxuan Tablet by HPLC and GC

PENG Jianbiao? LONG Kai? XU Chunmei? ZHAO Yuancui

HongHe Prefeture Institute for Food and Drug Control， Mengzi 661199， China

Abstract：

Objective To compare the content of ligustilide in Qingxuan tablets by HPLC and GC， and to provide reference for the content determination of ligustilide in Qingxuan tablets.Methods The content of ligusticum Chuanxiong was determined by HPLC and GC using ligustilide as reference. HPLC chromatographic conditions： silica gel column （SinoChrom ODS-BP 4.6 mm×250 mm， 5μm） was bonded with octadecyl silane. Mobile phase： methanol-water （70∶[KG-*3/5]30）; Detection wavelength： 326 nm; Flow rate ：1.0mL/min， Column temperature： 30℃. GC chromatographic conditions： （50%） diphenyl - （50%） dimethyl polysiloxane as fixed liquid capillary column （HP-50+ 0.50μm， 0.32 mm， 30 m）; The initial temperature was 110℃ for 2 minutes， and the temperature was heated to 180℃ at the rate of 7℃/min， and then heated to 220℃ at the rate of 10℃/min for 5 minutes. Inlet temperature 250℃; Temperature of detector （FID） ： 260℃; Nitrogen was used as carrier gas at a flow rate of 5.0mL/min. Results The ligustilide was linear in the range of 0.0776-1.5510 μg by HPLC. The correlation coefficient R2 was 0.9999. The average recovery was 99.79%（RSD=0.29%，N=6）. The ligustilide showed a good linear relationship in the range of 0.0078-0.1551 μg with the correlation coefficient R2=0.9992. The average recovery was 105.75%（RSD=1.93%，N=6）.Conclusions? Both methods can accurately determine the content of ligustilide in Qingxuan tablets. HPLC method is superior to GC method in accuracy and precision， and can be used as the first choice for the determination of ligustilide in Qingxuan tablets. GC method has the advantages of high sensitivity and low analysis cost and can be used as an alternative method to determine the content of ligustilide in Qingxuan tablets.

Keywords：

Qingxuan Tablets; Ligustilide; Content Determination;HPLC;GC

清眩片為中藥成方制劑，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為2020年版《中國藥典》一部［1］，由川芎、白芷、薄荷、荊芥穗、石膏五味藥制備而成。具有散風(fēng)解熱的功效，用于風(fēng)熱頭暈?zāi)垦?、偏正頭痛、鼻塞牙痛。制劑處方中君藥川芎活血行氣、祛風(fēng)止痛，用于胸痹心痛、胸脅刺痛、跌撲腫痛、月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉痛經(jīng)、癥瘕腹痛、頭痛、風(fēng)濕痹痛［2］。研究［3］表明其主要活性成分藁本內(nèi)酯具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)等多種藥理活性。藁本內(nèi)酯在川芎藥材中的含量也相對較高，而現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)未測定藁本內(nèi)酯不夠全面。為了保證成品轉(zhuǎn)移率；更好地控制清眩片的質(zhì)量，保證臨床用藥的安全有效，將其作為清眩片質(zhì)量控制的主要指標(biāo)之一更為合理。藁本內(nèi)酯為揮發(fā)油，具有揮發(fā)性，沸點(diǎn)168～169℃（800 Pa），采用GC法和采用HPLC法測定藁本內(nèi)酯含量均有文獻(xiàn)報道［4-5］，故采用HPLC法與GC法對清眩片中的藁本內(nèi)酯進(jìn)行定量研究比較。

1? 儀器與試藥

1.1? 儀器? ThermoUltimate3000高效液相色譜儀；ThermoTRACE1310氣相色譜儀；Sartorius BP211D電子天平；北京匯龍HLPT-300H型氫氣發(fā)生器。

1.2? 試藥? 藁本內(nèi)酯對照品（批號：111737-201910，中國食品藥品檢定研究院）；清眩片（批號：210801，云南云河藥業(yè)股份有限公司）；所用試劑甲醇（色譜純，霍尼韋爾貿(mào)易上海有限公司）；甲醇（分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司）；水為超純水。

2? 方法與結(jié)果

2.1? 高效液相色譜法測定藁本內(nèi)酯的含量

2.1.1? 色譜條件? 色譜柱：依利特 SinoChrom ODS-BP 4.6 mm×250 mm，5μm；流動相：甲醇-水（70∶[KG-*3/5]30）；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：326 nm；理論板數(shù)按藁本內(nèi)酯峰計算應(yīng)不低于5000。

2.1.2? 對照品溶液的制備? 取藁本內(nèi)酯對照品適量，精密稱定，置棕色瓶中，加甲醇制成每1 mL含45 μg的溶液，即得。

2.1.3? 供試品溶液的制備? 取本品20片，精密稱定，研細(xì)，取約0.6 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率200 W，頻率53 kHz）30 min，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4? 專屬性試驗? 取按清眩片處方劑量及工藝要求制備缺川芎的陰性樣品0.6 g，按“2.1.3”項下方法制成陰性樣品溶液，分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液與陰性樣品溶液各10μL，注入液相色譜儀，按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果在記錄的色譜圖中，供試品溶液呈現(xiàn)與藁本內(nèi)酯對照品溶液主峰保留時間一致的色譜峰，而陰性樣品溶液未呈現(xiàn)與藁本內(nèi)酯對照品溶液主峰保留時間一致的色譜峰，可見其他原輔料對藁本內(nèi)酯峰無干擾。如圖1～3所示。

2.1.5? 穩(wěn)定性試驗? 取同一份供試品溶液，按上述色譜條件分別在0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、16 h、20 h時進(jìn)樣測定，測得藁本內(nèi)酯峰面積積分值分別為21.2182、21.2983、21.4357、21.4739、21.5216、21.7590、21.2611， RSD 為0.56%，表明供試品溶液在20 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.6? 不同檢測波長? 取清眩片（ 批號210801）供試品溶液，在檢測波長為324 nm、326 nm、328 nm下測定其含量，分別為3.5976 mg/g、3.5879 mg/g、3.5871 mg/g，RSD為0.16%，結(jié)果表明，在檢測波長（326±2） nm范圍變化，對藁本內(nèi)酯含量測定基本沒有影響，結(jié)果穩(wěn)定。

2.1.7? 線性關(guān)系考察? 取藁本內(nèi)酯對照品適量，精密稱定，置棕色瓶中，加甲醇制成每1 mL含藁本內(nèi)酯0.1551 mg的溶液，分別精密量取0.5 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度。按“2.1.1”項下色譜條件測定峰面積，以峰面積積分值Y對進(jìn)樣量X（μg）進(jìn)行回歸處理。結(jié)果藁本內(nèi)酯回歸方程為Y=0.4832X-0.0147（R2=0.9999），表明藁本內(nèi)酯進(jìn)樣量與峰面積在0.0776～1.5510 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.1.8? 重復(fù)性試驗? 取供試品，按“2.1.3”項下方法，分別制備6份供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件測定，藁本內(nèi)酯的平均含量為3.7027 mg/g，RSD為0.46%，結(jié)果表明此方法重復(fù)性良好。

2.1.9? 加樣回收率試驗? 取供試品（批號210801，已知藁本內(nèi)酯含量為3.7027 mg/g）20片，精密稱定，研細(xì)，稱取6份，每份約0.3 g，精密稱定，按1∶[KG-*3/5]1比例加入藁本內(nèi)酯對照品，即精密加入藁本內(nèi)酯對照品溶液（藁本內(nèi)酯濃度0.0217 mg/mL）50 mL。按“2.1.3”項下方法，分別制備6份供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件測定，計算回收率。結(jié)果見表1。

2.2? 氣相色譜法測定藁本內(nèi)酯的含量

2.2.1? 色譜條件? 色譜柱：以（50%）二苯基-（50%）二甲基聚硅氧烷為固定液的毛細(xì)管柱（HP-50+ 0.50μm，0.32 mm，30 m）；程序升溫，起始溫度為110℃，維持2 min，以7℃/min的速率升溫至180℃，再以10℃/min的速率升溫至220℃，維持5 min；進(jìn)樣口溫度250℃；檢測器（FID）；溫度260℃；以氮?dú)鉃檩d氣，流速為5.0mL/min；直接進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1 μL。

2.2.2? 對照品溶液的制備? 取藁本內(nèi)酯對照品適量，精密稱定，置棕色瓶中，加甲醇制成每1 mL含0.15 mg的溶液，即得。

2.2.3? 供試品溶液的制備? 取本品20片，精密稱定，研細(xì)，取約0.6 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率200 W，頻率53 kHz）30 min，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4? 專屬性試驗? 取按清眩片處方劑量及工藝要求制備缺川芎的陰性樣品0.6 g，按“2.2.3”項下方法制成陰性樣品溶液，分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液與陰性樣品溶液各1 μL，注入氣相色譜儀，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果在記錄的色譜圖中，供試品溶液呈現(xiàn)與藁本內(nèi)酯對照品溶液主峰保留時間一致的色譜峰，而陰性樣品溶液未呈現(xiàn)與藁本內(nèi)酯對照品溶液主峰保留時間一致的色譜峰，可見其他原輔料對藁本內(nèi)酯峰無干擾。如圖4～6所示。

2.2.5? 線性關(guān)系考察? 取藁本內(nèi)酯對照品適量，精密稱定，置棕色瓶中，加甲醇制成每1 mL含藁本內(nèi)酯0.1551 mg的溶液，分別精密量取0.5 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度。按“2.2.1”項下色譜條件測定峰面積，以峰面積積分值Y對進(jìn)樣量X（μg）進(jìn)行回歸處理。結(jié)果藁本內(nèi)酯回歸方程為Y=0.0619X-0.3053（R2=0.9992），表明藁本內(nèi)酯進(jìn)樣量與峰面積在0.0078～0.1551 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.2.6? 重復(fù)性試驗? 取供試品，按“2.2.3”項下方法，分別制備6份供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定并計算藁本內(nèi)酯的含量，結(jié)果藁本內(nèi)酯含量的RSD為1.04%，表明此方法重復(fù)性良好。

2.2.7? 加樣回收率試驗? 取供試品20片，精密稱定，研細(xì)，稱取6份，每份約0.6 g，精密稱定，按0.5∶[KG-*3/5]1比例加入藁本內(nèi)酯對照品，即精密加入藁本內(nèi)酯對照品溶液（藁本內(nèi)酯濃度0.0217 mg/mL）50 mL。按“2.2.3”項下方法，分別制備6份供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定，計算回收率。結(jié)果見表2。

2.3? 高效液相色譜法與氣相色譜法測定結(jié)果比較? 對收集到的5家生產(chǎn)企業(yè)各批次清眩片，分別用高效液相色譜法與氣相色譜法測定藁本內(nèi)酯的含量，并對測定結(jié)果進(jìn)行Bland-Altman散點(diǎn)圖評價分析。結(jié)果見表3。

兩種方法含量測定數(shù)據(jù)差值的平均值D=0.012 mg/片，差值的標(biāo)準(zhǔn)差S=0.058052，則95%一致性界限為0.012±1.96×0.058052，即（-0.1018 mg/片，0.1258 mg/片）。可以看出差值所有的點(diǎn)均在95%一致性界限以內(nèi)，因此可以認(rèn)為兩種測定方法的結(jié)果具有較好的一致性。

3? 討論

3.1? 提取方法的確定? 根據(jù)藁本內(nèi)酯的理化特性查閱資料［5］后對清眩片中藁本內(nèi)酯提取方法提取時間考察發(fā)現(xiàn)，乙醇、甲醇、50%甲醇超聲提取效率相差不大，其中甲醇提取效率略高；超聲30 min與超聲30 min以上時間的提取效果無顯著差別。故將提取方法確定為甲醇超聲提取30 min。

3.2? 高效液相色譜條件的選擇? 取藁本內(nèi)酯對照品適量，加70%甲醇制成每1 mL含8 μg的溶液，在190～400 nm 波長處進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果在326 nm波長處有最大吸收，故選擇326 nm作為藁本內(nèi)酯HPLC含量測定波長；在試驗中通過不斷的調(diào)整以甲醇－水（70∶[KG-*3/5]30）洗脫時峰形良好，分離度好，所以以甲醇－水（70∶[KG-*3/5]30）作為流動相；試驗中還分別將柱溫調(diào)至25℃、30℃、35℃，發(fā)現(xiàn)3種柱溫除對保留時間有一定影響外，對峰形和分離度影響甚小，結(jié)合實際環(huán)境條件將柱溫確定為30℃。

3.3? 高效液相色譜法含量限度擬定? 此次試驗對收集到5個廠家生產(chǎn)的清眩片進(jìn)行了藁本內(nèi)酯含量測定，不同廠家所生產(chǎn)清眩片中藁本內(nèi)酯的含量相差較大。取川芎藥材70%乙醇回流提取后測定藁本內(nèi)酯的含量為7.08 mg/g，與文獻(xiàn)報道［6］川芎70%乙醇回流提取兩次（與清眩片制法中川芎的處理方法一致。）藁本內(nèi)酯的含量為6.99 mg/g相互吻合，如果按照6.99 mg/g計算，各廠家清眩片有效成分藁本內(nèi)酯轉(zhuǎn)移率從11%到75%不等。沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)來控制藁本內(nèi)酯含量，各企業(yè)的生產(chǎn)工藝也有所不同，致使清眩片中藁本內(nèi)酯的含量相差較大，導(dǎo)致相同的劑量臨床效果相差較大。為此制定統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，能更好的控制清眩片的質(zhì)量。結(jié)合實際生產(chǎn)過程中的損失，以及樣品數(shù)量有限，暫且將含量限度擬定為每片含川芎以藁本內(nèi)酯計，不得少于0.5 mg。5家企業(yè)生產(chǎn)的7個批次清眩片中藁本內(nèi)酯含量分布在0.30～1.99 mg之間，平均值為0.95 mg。其中1家生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的1批次樣品含量低于擬定限度。

從試驗數(shù)據(jù)可看出HPLC法與GC法專屬性、精密度、線性以及準(zhǔn)確度考察均符合要求［7］，兩種方法具有較好的一致性，均可以準(zhǔn)確測定清眩片中藁本內(nèi)酯的含量，HPLC法準(zhǔn)確度與精密度都優(yōu)于GC法，可以作為清眩片中藁本內(nèi)酯含量測定的首選方法。GC法具有靈敏度高、分析成本低等優(yōu)勢可以作為清眩片中藁本內(nèi)酯含量測定的備選方法。

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（收稿日期：2023-03-31? 編輯：陶希睿）