HPLC法測(cè)定滇產(chǎn)白花蛇舌草及偽品中去乙酰車葉草酸甲酯的研究

赫偉 周成蕾

基金項(xiàng)目：云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目（2019J0259）。

作者簡(jiǎn)介：

赫偉（1988—），女，滿族，碩士，講師，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail：lnhewei@126.com

通信作者：

周成蕾（1986—），男，漢族，碩士，主管中藥師，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail：406731676@qq.com

【摘? 要】

目的：建立高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定滇產(chǎn)白花蛇舌草中去乙酰車葉草酸甲酯的含量，提高白花蛇舌草定性定量的專屬性鑒別。方法：采用Zorbax Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱；流動(dòng)相∶[KG-*3/5]乙腈-水（3.5∶[KG-*3/5]96.5）；檢測(cè)波長(zhǎng)：238 nm；柱溫：25℃；流速：1.0mL/min;進(jìn)樣量：10μL。結(jié)果：白花蛇舌草檢出去乙酰車葉草酸甲酯，其偽品未檢出，乙酰車葉草酸甲酯在3.7683～241.1684μg/mL（r=0.99985）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；平均回收率為94.40%，RSD為2.3%。結(jié)論：建立的方法，可用于白花蛇舌草與偽品的鑒別，為評(píng)價(jià)該藥材質(zhì)量具有借鑒意義。

【關(guān)鍵詞】

滇產(chǎn)；白花蛇舌草；去乙酰車葉草酸甲酯；含量測(cè)定

【中圖分類號(hào)】R284.1??? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號(hào)】1007-8517（2023）24-0033-04

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.24.zgmzmjyyzz202324007

HPLC Determination of the Content of Deacetylated Methyloxalate in Hedyotis diffusa and

tis Counterfeits Produced in Yunnan

HE Wei1? ZHOU Chenglei2*

1.Dehong Vocational College， Dehong 678400， China;2.Dehong Institute for Food and Drug Control， Dehong 678400， China

Abstract：

Objective To determinethe content of deacetylated methyloxalate in Hedyotis diffusa produced in yunnan by HPLC-DAD，to improve qualitative method of Hedyotis diffusa.Methods The Zorbax Eclipse XDB-C18column（4.6 mm×250 mm，5μm）was used for determination ofdeacetylated methyloxalate. Gradient elution with acetonitrile and water was performed（the proportion is? 3.5∶[KG-*3/5]96.5）.The deacetylated methyloxalate was detected at a wavelength of 238 nm;the system operated at 25℃;flow rate was 1mL/min and the injection volume was 10μL.Results The deacetylated methyloxalate was detected in Hedyotis diffusa，but the counterfeit was not detected.The deacetylated methyloxalateshowed good linearity in the ranges of 3.7683-241.1684μg/mL（r=0.99985），and the average recoveries were 94.40%，RSD=2.3%.Conclusion The HPLC method established is a rapid and accuracy，and can be used to distinguish Hedyotis diffusa from counterfeit，andis helpful to tis quality control.

Keywords：

Produced in Yunnan;Hedyotis Diffusa Willd.;Deacetylated Methyloxalate;Assay

白花蛇舌草為茜草科植物白花蛇舌草Hedyotis diffusa Willd.，為云南省各地方少數(shù)民族的常用藥，始載于1971年5月出版的《云南中草藥》［1］，后在《德宏民族藥名錄》［2］《拉祜族民間特色藥用植物》［3］和《哈尼族藥用植物》［4］也有記載，主要有清熱解毒、活血止痛和利尿消腫的功能［5］。在云南地區(qū)常見(jiàn)偽品為同科同屬植物纖花耳草Hedyotis tenelliflora BI.和傘房花耳草Hedyotis corymbosa L.，常作為白花蛇舌草藥材混用。

研究［6］表明白花蛇舌草中主要含有萜類、黃酮類、蒽醌類、苯丙素和香豆素類、揮發(fā)油類、含酸化合物、多糖類及其他類。現(xiàn)代藥理研究［7］表明白花蛇舌草具有抗炎、抗氧化、抗惡性腫瘤等作用，在臨床廣泛運(yùn)用于惡性腫瘤的中藥治療。目前白花蛇舌草藥材收載于2005年版《中國(guó)藥典》附錄里［8］，全國(guó)有25個(gè)省級(jí)中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，23個(gè)省級(jí)中藥飲片炮制（切制）規(guī)范收載白花蛇舌草藥材，云南省暫未收載該藥。本文采集到云南省產(chǎn)地的白花蛇舌草及其偽品纖花耳草、傘房花耳草，共14批樣品（樣品信息見(jiàn)表1），選定對(duì)人體肝癌、結(jié)腸癌細(xì)胞有較好抑制作用的去乙酰車葉草酸甲酯［9-10］作為含量測(cè)定指標(biāo)成分，為白花蛇舌草藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供了研究數(shù)據(jù)。

1? 儀器與材料

1.1? 儀器? Agilent1260型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；101A-2電熱干燥箱（寧波自動(dòng)化儀表廠）；SB-5200D超聲波清洗機(jī)（功率：360 W;頻率：40 KHz；寧波新芝生物科技股份有限公司）；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；BS224S型電子分析天平（萬(wàn)分之一，德國(guó)Sartorius公司）；MS205DU型電子分析天平（十萬(wàn)分之一，瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2? 材料? 去乙酰車葉草酸甲酯對(duì)照品（批號(hào)：C0005304，含量92.9%，北京曼哈格生物科技有限公司）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，ADS-8型大孔吸附樹(shù)脂（鄭州新材料科技有限公司）；白花蛇舌草、纖花耳草藥材和傘房花耳草樣品（信息表見(jiàn)表1）均由經(jīng)中科院昆明植物所楊文光副研究員鑒定。

2? 方法與結(jié)果

2.1? 色譜條件? Zorbax Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm），流動(dòng)相乙腈-水（3.5∶[KG-*3/5]96.5），流速為1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為238 nm，柱溫為25℃。

2.2? 對(duì)照品溶液的制備? 精密稱取去乙酰車葉草酸甲酯對(duì)照品0.01298 g置25mL容量中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度配，作為對(duì)照品貯備液。

2.3? 供試品溶液的制備? 參照2020版《中國(guó)藥典》一部紅花顆粒含量測(cè)定供試品提取方法［11］，取白花蛇舌草及偽品樣品（過(guò)四號(hào)篩）約3 g，精密稱定，置250mL三角燒瓶中，精密加水50mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用水補(bǔ)足失重，搖勻，離心，精密量取濾液10mL，通過(guò)ADS-8型大孔吸附樹(shù)脂柱（內(nèi)徑為1.5 cm，柱高為15 cm），用水100mL洗脫，棄去洗脫液，繼用80%甲醇200mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)铀m量，超聲使溶解，并轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得，將上述兩種溶液分別進(jìn)樣10μL，測(cè)定。如圖1所示。

2.4? 空白樣品液制備? 按缺供試品的陰性樣品，按“2.3供試品溶液的制備”的方法操作，制成空白樣品。

2.5? 樣品水分測(cè)定? 參照2020版《中國(guó)藥典》四部通則0832 第二法［12］進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果測(cè)定值見(jiàn)表2。

2.6? 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及線性關(guān)系考察? 精密吸取去乙酰車葉草酸甲酯對(duì)照品貯備液，加流動(dòng)相逐級(jí)稀釋，分別得到質(zhì)量濃度為3.7683 μg/mL、7.5365 μg/mL、15.0730 μg/mL、30.1461 μg/mL、60.2921 μg/mL、120.5842 μg/mL、241.1684μg/mL的對(duì)照品溶液，進(jìn)樣10μL。以進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)計(jì)算回歸方程為Y=13.90740X+3.89093? （r=0.99985）。結(jié)果表明，去乙酰車葉草酸甲酯在3.7683～241.1684μg/mL線性范圍內(nèi)關(guān)系良好。按照條件進(jìn)行測(cè)定并分別計(jì)算檢出限（LOD，S/N≥3）和定量限（LOQ，S/N≥10），結(jié)果測(cè)定的檢測(cè)限為0.3789μg/mL，定量限為1.2630μg/mL。

2.7? 精密度試驗(yàn)? 精密吸取對(duì)照品30.1461μg/mL10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定，測(cè)得去乙酰車葉草酸甲酯峰面積RSD為0.21%，結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.8? 重復(fù)性試驗(yàn)? 精密稱取同一樣品（編號(hào)S5）6份，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣20μL進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算去乙酰車葉草酸甲酯的含量，結(jié)果RSD為1.08%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.9? 穩(wěn)定性試驗(yàn)? 精密吸取供試品（編號(hào)S5）溶液20μL進(jìn)行測(cè)定，分別于制備后0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h進(jìn)樣，測(cè)定，去乙酰車葉草酸甲酯峰面積RSD為1.58%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.10? 加樣回收率試驗(yàn)? 精密稱取同一樣品（編號(hào)S5）9 份，每份約3 g，精密加入，分別精密加入適量的對(duì)照品，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下分別進(jìn)樣20μL進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為，計(jì)算回收率94.40%，RSD為2.3%，表明該方法加樣回收率試驗(yàn)良好。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.11? 樣品測(cè)定結(jié)果? 精密稱取各地樣品適量，同法制備供試品溶液，進(jìn)樣20μL，注入液相色譜儀，進(jìn)行測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算。結(jié)果見(jiàn)表3。

3? 討論

3.1? 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇? 經(jīng)DAD全波長(zhǎng)掃描，去乙酰車葉草酸甲酯對(duì)照品溶液在238 nm處有最大吸收波長(zhǎng)，因此確定檢測(cè)波長(zhǎng)為238 nm。

3.2? 色譜條件的選取? 在前期研究中，本課題組對(duì)不同流動(dòng)相乙腈-水-冰乙酸（4∶[KG-*3/5]96∶[KG-*3/5]0.2）溶液、乙腈-0.03磷酸溶液（75∶[KG-*3/5]25，V/V）、乙腈-水溶液（80∶[KG-*3/5]20，V/V）、乙腈-水溶液（75∶[KG-*3/5]25，V/V），不同柱溫（20℃、25℃、30℃、35℃）、不同流速（0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min、1.5mL/min）、不同進(jìn)樣量（5μL、10μL、15μL、20μL）、不同色譜柱（Titank C18、Zorbax Eclipse XDB-C18、Shim-pack VP-ODSC18）等色譜條件進(jìn)行了考察，最終確定了“2.1”項(xiàng)下色譜條件。

3.3? 不同大孔樹(shù)脂的考察? 對(duì)D-101、ADS-8及Diaion HP20大孔樹(shù)脂進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)通過(guò)ADS-8大孔吸附樹(shù)脂柱填料洗脫液雜質(zhì)較少，吸附影響較小，故選擇ADS-8大孔吸附樹(shù)脂柱填料。不同洗脫劑比例的考察分別對(duì)50%、60%、70%、80%甲醇做洗脫劑進(jìn)行考察，結(jié)果顯示所收集樣品用80%甲醇做為洗脫劑含量，所以選擇80%即可。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)，白花蛇舌草檢出去乙酰車葉草酸甲酯，纖花耳草及傘房花耳草均未檢出。目前，現(xiàn)行的白花蛇舌草藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是以熊果酸和齊墩果酸作為其含量測(cè)定成分，實(shí)驗(yàn)組在開(kāi)展探索性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)纖花耳草及傘房花耳草均含有較高的熊果酸和齊墩果酸成分，表明專屬性不強(qiáng)。因此可考慮以去乙酰車葉草酸甲酯作為白花蛇舌質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含量測(cè)定指標(biāo)成分，以提高鑒別和含量測(cè)定的專屬性。

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（收稿日期：2023-03-29? 編輯：陶希睿）