狐臭柴中精油GC-MS測定及其抑制肺癌細(xì)胞增殖的研究

李 爽，向 東，崔令軍，周大寨，朱玉昌

狐臭柴中精油GC-MS測定及其抑制肺癌細(xì)胞增殖的研究

李 爽1, 2，向 東1, 2，崔令軍1，周大寨1*，朱玉昌1, 2*

1. 生物資源保護(hù)與利用湖北省重點實驗室（湖北民族大學(xué)），湖北 恩施 445000 2. 湖北民族大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000

研究狐臭柴葉片精油的化學(xué)成分、含量、抗氧化、抑菌及抗腫瘤的能力，為狐臭柴開發(fā)利用提供一定的研究基礎(chǔ)。采用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀鑒定狐臭柴葉片精油的化學(xué)成分；以對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）和2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽（ABTS）自由基的清除能力，結(jié)合總還原力為指標(biāo)評價精油的抗氧化活性；以抑菌圈法探究其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞桿菌、白色念珠菌的抑制作用；采用細(xì)胞增殖/毒性檢測試劑盒法（Cell Counting Kit-8，CCK-8）測定其對人肺癌A549細(xì)胞的抑制作用。狐臭柴葉片精油中共鑒定出72種化合物，約占精油總成分的99.36%，其主要成分為左旋-β-蒎烯（15.27%）、1-辛烯-3-醇（14.46%）、蒎烯（14.29%）、1-石竹烯（6.26%）、α-石竹烯（4.47%）和芳樟醇（3.12%）。抗氧化實驗結(jié)果表明，狐臭柴葉片精油具有較強(qiáng)的總還原力，且對DPPH及ABTS自由基的半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）分別為8.48、3.10 mg/mL。狐臭柴葉片精油對白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞桿菌和大腸桿菌有較強(qiáng)的抑菌作用，最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）分別為30%、30%、30%、40%。狐臭柴葉片精油作用于人肺癌A549細(xì)胞3、4、5 h下的IC50分別為0.11%、0.10%、0.06%。狐臭柴葉片精油中成分豐富，具有較強(qiáng)的抗氧化、抗菌和抗腫瘤活性，在食品、制藥和化妝品行業(yè)具有潛在的應(yīng)用前景。

狐臭柴；精油；1-辛烯-3-醇；蒎烯；抗氧化；抑菌；抗腫瘤

狐臭柴Pamp別名豆腐柴、臭黃荊、臭樹、水白臘等，屬馬鞭草科豆腐柴屬植物，一般生長于山坡林下或林緣，在我國廣泛分布于華東、中南、華南及西南等地，是一種藥食兼用植物[1-2]，貴州地區(qū)將其根與葉入藥，清濕熱、解毒，治月經(jīng)不調(diào)，四川地區(qū)用其皮煮水治牙痛；湖北、湖南等地用其葉制作涼粉食用，名曰“神仙豆腐”。目前，狐臭柴在我國部分地區(qū)已區(qū)域化、規(guī)范化種植[3]，如顏躍躍等[4]研究不同扦插材料來源、扦插時期、不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)及其濃度對狐臭柴扦插成活率的影響，不斷優(yōu)化其扦插繁殖技術(shù)。另外，狐臭柴葉片中果膠、蛋白質(zhì)、多酚及黃酮類化合物含量豐富，李祥棟等[5]通過檸檬酸法提取狐臭柴葉片果膠，響應(yīng)面法得到果膠粗產(chǎn)率、半乳糖醛酸含量和果膠有效提取率分別為36.72%、32.09%和11.78%；陳曄等[6]研究發(fā)現(xiàn)狐臭柴葉片果膠可作為熱穩(wěn)定性增稠劑應(yīng)用于熱食型吞障食品中。陶阿麗等[7]通過優(yōu)化狐臭柴葉片蛋白的閃式提取工藝，其平均提取率達(dá)到葉片蛋白含量的63.06%；楊寧線等[8]測定發(fā)現(xiàn)狐臭柴葉中總酚及總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為30.05 mg/g和6.54 mg/g，通過自由基清除實驗發(fā)現(xiàn)狐臭柴葉片提取物具有良好的抗氧化活性；黃思雨[9]研究發(fā)現(xiàn)狐臭柴葉片細(xì)粉可以改善小鼠潰瘍性結(jié)腸炎癥，具有腸道益生性。狐臭柴葉片是一種集營養(yǎng)、保健和藥用一體的野生資源，作為功能食品開發(fā)或者醫(yī)藥原材料開發(fā)，均有廣闊的發(fā)展前景。

植物精油是一種潛在的新型藥物化合物及食品添加劑的來源[10]。因化學(xué)和結(jié)構(gòu)組成的不同，使得其具有多種生理功能，包括抗氧化[11]、抗菌[12-13]、抗炎[14]、抗腫瘤和驅(qū)蟲[15]等，徐小青等[16]發(fā)現(xiàn)狐臭柴精油中大多成分都具有抑菌作用或抑制害蟲作用；Riabov等[17]發(fā)現(xiàn)塞爾維亞月桂精油對所有受試微生物顯示出更大的抑菌活性，而俄羅斯月桂精油對受試細(xì)菌和酵母都有效，對其他受試真菌沒有任何抑制作用；席祖衛(wèi)等[18]發(fā)現(xiàn)維吉尼亞雪松精油可顯著提高巨噬細(xì)胞相關(guān)炎癥因子的表達(dá)量，且呈劑量相關(guān)性抑制人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞株的增殖。而狐臭柴葉片功能性成分的研究主要集中在果膠、蛋白質(zhì)、多酚及黃酮類化合物的提取與抗氧化活性研究，對狐臭柴葉片精油抗氧化、抗菌及抗腫瘤活性的研究鮮有報道。

本實驗以狐臭柴葉片為原料，采用水蒸氣蒸餾法采集油品，通過氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromate- graphy-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀分析鑒定其化學(xué)成分，同時對其精油的抗氧化、抑菌和抗腫瘤能力進(jìn)行了研究，以期為狐臭柴資源的開發(fā)利用提供一定的研究基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HP7890A/5975C型GC-MS聯(lián)用儀，Cary300型紫外分光光度計（Agilent Technologies公司）；BSA6202S-CW型精密分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，萬分之一）；酶標(biāo)儀（上海光譜儀器有限公司）；SJ-CJ-2FDQ型超凈臺（蘇潔凈化）；SPX-1505H-II型生化培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；JC80D型立式壓力蒸汽滅菌鍋（德強(qiáng)凈化科技有限公司）；BB15型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技有限公司）；熱泵干燥機(jī)（威而信實業(yè)有限公司）。

1.2 材料

狐臭柴鮮葉于2021年9月采摘于湖北省利川市湖北雄展農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司的種植基地，經(jīng)湖北民族大學(xué)林學(xué)園藝學(xué)院易詠梅教授鑒定為狐臭柴Pamp。鮮葉洗凈后于57 ℃烘干揉碎，于4 ℃遮光密封保存。

平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（杭州百思生物技術(shù)有限公司）；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞桿菌、白色念珠菌）廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；人肺癌A549細(xì)胞（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞研究所）；細(xì)胞增殖/毒性檢測試劑盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8）、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶EDTA消化液（生工生物股份有限公司）；抗壞血酸（vitamin C，Vc）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2′-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽[2,2′-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS]、二甲基亞砜（DMSO，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法

2.1 精油提取

將1.0 kg的狐臭柴干葉按照1∶15的料液比裝入水蒸餾及冷凝回收裝置中，加熱沸騰后開始計時，5 h后停止加熱。待提取器靜置分層，收集上層油狀物質(zhì)，下層水層用10 mL的乙醚萃取3次，合并3次濾液，室溫下?lián)]發(fā)多余乙醚，得精油得率為0.29%。取適量精油用無水乙醚溶解，并加入適量無水硫酸鈉干燥，待GC-MS檢測；剩余精油保存在棕色玻璃瓶中，置于4 ℃冰箱中保存。

2.2 精油GC-MS測定

2.2.1 色譜條件 DB-5MS石英毛細(xì)管色譜柱（30 m×320 μm×0.25 μm）；載氣為高純氦氣，載氣體積流量1.0 mL/min；分流比60∶1，進(jìn)樣量1.0 μL；進(jìn)樣口溫度250 ℃；程序升溫：初始溫度60 ℃，保持3 min；8 ℃/min升溫至100 ℃；再以2 ℃/min升溫至150 ℃；10 ℃/min升溫至180 ℃，保持2 min；4 ℃/min升溫至190 ℃；8 ℃/min升溫至280 ℃，保持5 min。

2.2.2 質(zhì)譜條件 溶劑延遲時間為2 min；電離方式為EI，電離能量70 eV，離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度為150 ℃；質(zhì)量掃描范圍為/35～550；采用NIST2014標(biāo)準(zhǔn)譜庫進(jìn)行檢索。

2.3 精油抗氧化活性的測定

2.3.1 總還原能力的測定 參考盧彩會等[19]的方法，用無水乙醇稀釋精油得到質(zhì)量濃度分別為1、2、3、4、5 mg/mL的精油-乙醇溶液。取0.4 mL樣品液和4.0 mL磷鉬試劑（0.6 mol/L硫酸、28 mmol/L磷酸鈉、4 mmol/L鉬酸銨）于干凈試管，搖勻后在95 ℃恒溫加熱90 min，冷卻至室溫后，于紫外分光光度計695 nm波長處測定吸光度（）。用0.4 mL無水乙醇代替樣品液作空白，Vc作為陽性對照，平行操作重復(fù)3次。

2.3.2 清除DPPH自由基能力的測定 參考劉夢潔等[20]的方法，并據(jù)實驗稍加修改。取19.716 mg DPPH于500 mL量瓶中，加無水乙醇定容，得到0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液。1.0 mL不同質(zhì)量濃度（1、2、3、4、5 mg/mL）的精油-乙醇溶液與2.0 mL DPPH溶液混合后，避光反應(yīng)30 min，517 nm下測定吸光值（1）；2.0 mL無水乙醇代替DPPH溶液測得吸光值（2）；1.0 mL乙醇代替樣品液測得吸光值（0）。Vc作為陽性對照，操作同上。平行操作重復(fù)3次。DPPH自由基清除率按公式（1）計算。

DPPH自由基清除率＝1－(1－2)/0（1）

2.3.3 清除ABTS自由基能力的測定 參考劉夢潔等[20]的方法，并據(jù)實驗稍加修改。取7 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液各5.0 mL混合，在室溫避光條件下靜置過夜，將混合液用磷酸緩沖液（pH值為7.4）稀釋至波長在734 nm處吸光度值為（0.70±0.02），即為ABTS測定液。取0.2 mL不同質(zhì)量濃度（1、2、3、4、5 mg/mL）的精油-乙醇溶液與2.0 mL上述ABTS測定液混合后暗處反應(yīng)30 min，734 nm處測定吸光值（1）；2.0 mL無水乙醇代替ABTS溶液測得吸光值（2）；1.0 mL乙醇代替樣品液測得吸光值（0）。Vc作為陽性對照，操作同上。平行操作重復(fù)3次。ABTS自由基清除率按公式（2）計算。

ABTS自由基清除率＝1－(1－2)/0（2）

2.4 精油抑菌活性的測定

2.4.1 菌種活化及菌懸液制備 參考《中國藥典》2020年版[21]，將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞桿菌、白色念珠菌分別接種到胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)24 h，得到一代菌懸液。在無菌操作臺內(nèi)吸取100 μL已活化好的菌種接種到上述培養(yǎng)基中，操作同上，得到二代菌懸液，供實驗使用。

2.4.2 抑菌圈法測定抑菌活性 參考張玉龍等[22]的方法，并據(jù)實驗稍加修改。在無菌操作臺中將熔化并滅菌的培養(yǎng)基倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中，冷卻凝固后，加入菌懸液100 μL，用滾珠涂布均勻。將直徑為9 mm的無菌濾紙片放于培養(yǎng)基上，將狐臭柴精油用DMSO分別配成含精油添加量10%、20%、30%、40%和50%的溶液，用移液槍吸取40 μL溶液，緩慢滴加在濾紙片上，令其完全浸潤且不外溢，以空白平板為陰性對照，以DMSO為陽性對照，37 ℃正置培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑，首次出現(xiàn)抑菌圈所對應(yīng)的狐臭柴葉片精油濃度即為最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），平行重復(fù)3次，取平均值。

2.5 精油對A549細(xì)胞的抑制作用

2.5.1 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇A549細(xì)胞，在超凈工作臺上將其接種于25 mL培養(yǎng)瓶中，加入含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清及青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL的RPMI 1640培養(yǎng)液5 mL，用槍頭小心反復(fù)吹打，使細(xì)胞分散均勻。將培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)箱（溫度為37 ℃、飽和濕度為95%、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%）中培養(yǎng)，每2～3 d換液傳代培養(yǎng)。

2.5.2 CCK-8法測定狐臭柴葉片精油對A549肺癌細(xì)胞的抑制率 參考劉岸等[23]的方法，并據(jù)實驗稍加修改。收集對數(shù)期細(xì)胞，吸棄培養(yǎng)液，用PBS液清洗懸浮死細(xì)胞并棄去，加0.25%的胰酶消化2 min，加RPMI 1640培養(yǎng)液1.0 mL中止消化，小心反復(fù)吹打，制成單層細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×104個/mL。將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔的體積為100 μL，并設(shè)置僅加入RPMI 1640培養(yǎng)液的孔作為陰性對照組（C0），置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸棄孔中液體，分別加入不同濃度的用RPMI 1640培養(yǎng)液混勻的精油混懸液（精油的體積比濃度分別為0.05%、0.10%、0.20%、0.30%和0.40%），作為實驗組（C1）。在加入細(xì)胞懸液的孔中加RPMI 1640培養(yǎng)液100 μL，作為陽性對照組（C2）。在所有組別的周圍孔中加入RPMI 1640培養(yǎng)液100 μL，減少蒸發(fā)對實驗的影響。每個濃度分別設(shè)6個平行孔，置于CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)3、4、5 h。加入10%體積濃度的CCK-8溶液，震蕩2 min，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，在450 nm波長下，利用酶標(biāo)儀測定96孔培養(yǎng)板上各孔的吸光度值（），記錄實驗結(jié)果。抑制率按公式（3）計算。

抑制率＝[(C2－C0)－(C1－C0)]/(C2－C0) （3）

2.6 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SPSS23.0軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析（One-way ANOVA），利用鄧肯式多重比較對差異顯著性進(jìn)行比較分析，＜0.05表示差異顯著；運(yùn)用Origin2021b進(jìn)行作圖分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 精油GC-MS成分分析

使用GC-MS技術(shù)對狐臭柴葉片精油成分進(jìn)行分析，色譜峰信息依據(jù)NIST14標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索和文獻(xiàn)報道的的保留指數(shù)進(jìn)行比對定性，保留匹配度高于80%的化學(xué)成分，采用峰面積歸一化法計算各組分的相對含量，定性結(jié)果及相對含量見表1，總離子流圖見圖1。

表1 狐臭柴葉片精油的化學(xué)成分與相對含量

續(xù)表1

序號tR/min化合物分子式相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)/% 24 9.653-(4-甲基-3-戊烯-1-基)-呋喃C10H14O0.08 25 9.79芳樟醇C10H18O3.12 2610.451-松香酚C10H16O0.23 2710.85匹諾香芹酮C10H14O0.25 2811.41水楊酸甲酯C8H8O30.24 2911.48桃金娘烯醛C10H14O0.16 3011.561-甲基-3-(1-甲基乙烯基)環(huán)己烯C10H170.91 3111.801,1,4,5-四甲基茚滿C13H180.09 3211.99β-環(huán)檸檬醛C10H16O0.36 3312.19橙花醇C10H18O0.16 3412.82香葉醇C10H18O0.46 3513.59乙酸冰片酯C12H20O20.16 3614.274-乙烯基-2-甲氧基苯酚C9H10O20.53 3715.40α-蓽澄茄油烯C15H240.19 3815.53丁香酚C10H12O20.26 3916.34α-可巴烯C15H243.20 4016.44大馬士酮C13H18O0.62 4116.73蓽澄茄油烯C15H240.75 4216.82β-欖香烯C15H240.52 4317.871-石竹烯C15H246.26 4417.99α-紫羅蘭酮C13H20O0.36 4518.47[1S-(1α,4α,7α)]-1,2,3,4,5,6,7,8-八氫化-1,4-二甲基-7-(1-甲基乙烯基)奧C15H240.98 4619.18α-石竹烯C15H244.47 4719.35(+)-香橙烯C15H241.77 4820.031-異丙基-7-甲基-4-亞甲基-1,2,3,4,4a,5,6,8a-八氫萘C15H241.51 4920.19β-紫羅蘭酮C13H20O2.13 5020.76雙環(huán)鍺烯C15H240.87 5121.12(1S,7R,8aS)-1,2,3,5,6,7,8,8a-八氫-1,4-二甲基-7-(1-甲基乙烯基)-天竺葵C15H241.68 5221.87d-卡丁烯C15H241.93 5322.65α-卡拉柯烯C15H200.28 5423.08反式倍半萜C15H26O0.44 5524.17反式-橙花叔醇C15H26O2.02 5624.34芥菜酚C15H24O1.88 5724.43氧化石竹烯C15H24O1.34 5825.63葎草烯C15H24O1.12 5926.541,2,3,4,4a,7-六氫-1,6-二甲基-4-(1-甲基乙基)-萘C15H240.18 6027.52α-蒎烯C15H240.33 6127.87g-古朱烯C15H240.31 6228.88b-紅沒藥醇C15H26O0.35 6331.253,7,11-三甲基-2,6,10-十二烷三烯-1-醇C15H26O0.21 6438.97金合歡基丙酮C18H30O0.16 6539.46棕櫚酸甲酯C17H34O20.21 6639.80鄰苯二甲酸二丁酯C16H22O40.15 6740.73棕櫚酸C16H32O21.66 6843.418,11-十八碳二烯酸甲酯C19H34O20.14 6943.54亞麻酸甲酯C19H32O20.48 7043.87葉綠醇C20H40O0.62 7144.62亞麻酸C18H30O20.72 7249.17三苯基氧化膦C18H15OP0.13

由表1和圖1可知，從狐臭柴葉片精油中共鑒定出72個成分，占精油總量的99.36%。精油含有烯烴、醇、酮、醛、酸、酯類等，以萜類化合物為主，精油中含量較高成分有左旋-β-蒎烯（15.27%）、蒎烯（14.29%）、1-辛烯-3-醇（13.83%）、石竹烯（10.73%）、芳樟醇（3.12%）和亞麻酸（0.72%）等。

3.2 精油的抗氧化作用

由圖2-A可知，狐臭柴葉片精油具有顯著的DPPH自由基清除能力。在1～5 mg/mL內(nèi)，精油對DPPH自由基清除率從10.98%上升至31.45%，表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)。精油質(zhì)量濃度（）與清除率（）間的回歸方程為＝5.105 1＋6.693 8，2＝0.990 8，精油對DPPH自由基清除作用的半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）為8.48 mg/mL。

不同小寫字母表示具有顯著性差異（P＜0.05），下同 A、B、C-總還原能力

由圖2-B可知，精油具有顯著的ABTS自由基清除能力。在1～5 mg/mL，精油對ABTS自由基清除率從27.90%上升至69.31%，表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)。精油質(zhì)量濃度（）與清除率（）間的回歸方程為＝10.305＋18.104，2＝0.995 1，精油對ABTS自由基清除作用的IC50值為3.10 mg/mL。

由圖2-C可知，狐臭柴葉片精油具有較好的總還原能力，在1～5 mg/mL內(nèi)，隨著精油濃度的增加，其還原能力不斷增強(qiáng)，呈明顯的劑量相關(guān)性，且差異顯著。當(dāng)精油質(zhì)量濃度為5 mg/mL時，還原能力值為0.43，但還原能力低于同質(zhì)量濃度的Vc（其為0.59）。

3.3 精油的抑菌作用

表2及圖3為狐臭柴葉片精油在不同體積百分比濃度下作用于4種供試菌種24 h后出現(xiàn)的抑菌圈的直徑大小。在同一濃度下，精油對白色念珠菌的抑制性最強(qiáng)，對大腸桿菌的抑制性較弱，不同菌的抑菌圈直徑呈現(xiàn)出顯著性差異。對于同一種菌，隨著精油濃度的增大，抑菌圈直徑增大，表明抑菌作用增強(qiáng)。白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞桿菌及大腸桿菌的MIC分別為30%、30%、30%和40%。

3.4 精油對A549細(xì)胞的抑制作用

通過CCK-8法測定在不同作用濃度和不同作用時間下的狐臭柴葉片精油對人肺癌A549細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果如表3與圖4所示。由表3及圖4可知，相同作用時間下，隨著狐臭柴葉片精油濃度的加大，對癌細(xì)胞的抑制率逐漸上升，具有顯著的藥物濃度相關(guān)性；相同作用濃度下，不同作用時間的癌細(xì)胞抑制率為5 h＞4 h＞3 h，說明其抑制效果具有時間相關(guān)性；當(dāng)狐臭柴葉片精油濃度達(dá)到0.3% 將藥物濃度的對數(shù)與抑制率進(jìn)行曲線擬合，通過回歸方程計算，不同濃度狐臭柴葉片精油分別作用于人肺癌A549細(xì)胞3、4、5 h的IC50值分別為0.11%、0.10%和0.06%；隨著狐臭柴葉片精油作用于A549細(xì)胞的時間延長，IC50也隨之降低。

表2 狐臭柴葉片精油對細(xì)菌和真菌的抑菌活性及其MIC值()

—表示無抑菌圈；小寫字母表示同一濃度下不同菌種的抑菌圈直徑具有顯著性差異（＜0.05）

—means no bacteriostatic effect; Lowercase letters indicate that the diameter of the inhibition zone of different strains at the same concentration is significantly different (< 0.05)

圖3 狐臭柴葉片精油對不同菌種的抑菌效果

表3 狐臭柴葉片精油對肺癌A549細(xì)胞的抑制率及其IC50值()

4 討論

本實驗采用GC-MS分析了狐臭柴葉片精油的化學(xué)成分，主要成分有蒎烯、1-辛烯-3-醇、石竹烯、芳樟醇等，這與吳永祥等[24]研究的安徽省黃山市豆腐柴葉片精油主要成分差異較大，而與范超敏等[25]研究的四川大竹縣臭黃荊葉精油主要成分類似，是由藥材產(chǎn)地和品種之間的差異大小導(dǎo)致的。已有的文獻(xiàn)顯示這些化學(xué)成分具有良好的藥理活性。其中，蒎烯是天然單萜化合物，研究發(fā)現(xiàn)它具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗炎、抗過敏及改善潰瘍等作用，食品行業(yè)常通過蒎烯來合成紫蘇糖甜味劑[26]，醫(yī)藥方面可應(yīng)用于小兒感冒顆粒[27]、桉檸蒎腸溶軟膠囊[28]等。β-石竹烯，一種雙環(huán)倍半萜型的天然產(chǎn)物，存在于許多具有抗炎、抑菌、抑制哮喘功能的植物提取物中[29]。芳樟醇屬于鏈狀萜烯醇類，具有抗菌、抗齲齒作用，可以用于合成香料、除臭殺蟲等[30]。Rehman等[31]的綜述表明，植物精油具有良好的生物功能，除了單獨組分的作用，更多的是不同組分協(xié)同作用的結(jié)果。

圖4 狐臭柴葉片精油對A549細(xì)胞的抑制作用

采用不同的體外抗氧化試驗得到的植物精油抗氧化活性的機(jī)制不盡相同[32]。研究發(fā)現(xiàn)，植物精油的抗氧化活性歸因于精油中酚類和萜類化合物的含量[33]，萜類化合物的抗氧化活性是通過活性氧的清除機(jī)制和內(nèi)源抗氧化系統(tǒng)的修飾能力表現(xiàn)出來的[34]。通過GC-MS分析，狐臭柴葉片精油中蒎烯、石竹烯等萜類化合物的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)約占50.05%，另外還含有酚、醇及酮類化合物，所以狐臭柴葉片精油在自由基清除率還原能力方面均具有顯著作用。其中ABTS自由基的清除率顯著高于DPPH自由基清除率，可能是精油在溶劑水與醇的溶解性不同引起的[35]。

由于植物精油具有一定的疏水性，植物精油抗菌活性機(jī)制的研究主要集中在對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的破壞方面[36]。狐臭柴葉片精油對白色念珠菌的抑制活性顯著高于其他菌，這可能是由于其萜類化合物能改變細(xì)胞表面的特性，抑制了孢子萌發(fā)，改變了病原菌的正常菌絲形態(tài)進(jìn)而破壞其正常的生命活性[37-38]。而精油對于革蘭氏陽性菌及陰性菌的生長繁殖影響不同，原因是其中的活性抗菌化合物通過疏水鍵和氫鍵與膜蛋白結(jié)合，從而改變膜的通透性[39]。

現(xiàn)代藥理研究證明，萜類化合物對乳腺癌、胃癌、肺癌、肝癌等有明顯的預(yù)防與治療作用[40-41]；亞麻酸等不飽和脂肪酸能改變腫瘤細(xì)胞膜生物特性，影響膜表面活性、受體表達(dá)，干擾或阻滯腫瘤細(xì)胞內(nèi)DNA代謝、信號傳導(dǎo)，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[42]，而狐臭柴葉片精油中含有豐富的萜類化合物及少量的亞麻酸等不飽和脂肪酸，所以可能是萜類化合物及少量不飽和脂肪酸作用于肺癌A549細(xì)胞，從而抑制癌細(xì)胞增殖，體現(xiàn)出狐臭柴葉片精油良好的抗腫瘤活性。

狐臭柴葉片精油中含有豐富的化學(xué)成分，并表現(xiàn)出良好的體外抗氧化、抗菌和抗腫瘤能力。此外，狐臭柴葉片精油中的萜類、醇類、酮類等化合物可能具有調(diào)節(jié)免疫功能，減少脂肪的累積，進(jìn)而保護(hù)心血管系統(tǒng)[43]，以及減少細(xì)菌性胃腸炎的感染和減輕缺血性腦卒中時的神經(jīng)炎癥和細(xì)胞凋亡[44-45]，鑒于這些有效成分廣泛的生物活性及藥理作用，可應(yīng)用于食品保鮮、藥品研制及美容保健的開發(fā)中；但這些有效成分的具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探明，這也指明了狐臭柴葉片精油在未來的研究方向。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Determination of essential oil inby GC-MS and its inhibitory effect on proliferation of lung cancer cells

LI Shuang1, 2, XIANG Dong1, 2, CUI Ling-jun1, ZHOU Da-zhai1, ZHU Yu-chang1, 2

1. Hubei Key Laboratory of Biologic Resources Protection and Utilization (Hubei Minzu University), Enshi 445000, China 2. College of Biological Sciences and Technology, Hubei Minzu University, Enshi 445000, China

To study the chemical composition, content, antioxidant, antibacterial and anti-tumor abilities of the essential oils from the leaves of, so as to provide a certain research basis for the application and development of..The chemical constituents of the essential oil ofleaves were identified by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The antioxidant activity of essential oils was evaluated by DPPH and ABTS free radical scavenging capacity and total reducing capacity of essential oils. The inhibition zone method was used to explore the inhibitory effects of the essential oil on,,and. CCK-8 test was used to determine the inhibitory effect of essential oils on human lung cancer A549 cells.A total of 72 compounds were identified in the essential oil ofleaves, accounting for about 99.36% of the total composition. The main components of essential oils are-β-pinene (15.27%), 1-octen-3-ol (14.46%), pinene (14.29%), 1-caryophyllene (6.26%), α-caryophyllene (4.47%) and linalool (3.12%). The results of antioxidant test showed that essential oils had strong total reducing power, and the IC50of DPPH and ABTS free radicals were 8.48 mg/mL and 3.10 mg/mL, respectively. The essential oil ofleaves had antibacterial effect on,,and, and the minimum inhibitory concentration (MIC) were 30%, 30%, 30% and 40%, respectively. The IC50of the essential oil ofleaves had acted on human lung cancer A549 cells at 3 h, 4 h and 5 h were 0.11%, 0.10% and 0.06%, respectively.The essential oil ofleaves were rich in components and had strong antioxidant, antibacterial and antitumor activities, which will have potential application prospects in the food, pharmaceutical and cosmetic industries.

Pamp; essential oil; 1-octen-3-ol; pinene; antioxidant; antibacterial; antitumor

R286.2

A

0253 - 2670(2023)06 - 1870 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.06.019

2022-08-09

湖北省教育廳項目（Q20131908）；恩施州科技計劃項目（XYJ2020000022）；生物資源保護(hù)與利用湖北省重點實驗室開放基金（PT012015）

李 爽（1996—），女，碩士研究生，研究方向為特色生物資源食品加工與開發(fā)。E-mail: 1820160341@qq.com

周大寨（1976—），男，高級實驗師，研究方向為天然產(chǎn)物的研究與開發(fā)。E-mail: sws0048@163.com

朱玉昌（1980—），女，副教授，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與食物安全。E-mail: zycandly@163.com

[責(zé)任編輯 時圣明]