基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討鴉膽子治療結(jié)直腸癌的作用機(jī)制

趙韋欣，王 晴，王夢(mèng)齊，季安璇，鄭晶瑩，趙淑華

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討鴉膽子治療結(jié)直腸癌的作用機(jī)制

趙韋欣，王 晴，王夢(mèng)齊，季安璇，鄭晶瑩*，趙淑華*

吉林大學(xué)第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科，吉林 長春 130022

采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對(duì)接及體內(nèi)驗(yàn)證，探究鴉膽子治療結(jié)直腸癌的活性成分、關(guān)鍵作用靶點(diǎn)及潛在的分子機(jī)制。從公共數(shù)據(jù)庫中檢索并收集鴉膽子的活性成分和對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)以及結(jié)直腸癌相關(guān)的靶點(diǎn)，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析出鴉膽子治療結(jié)直腸癌的活性成分、成分-疾病的交集靶點(diǎn)以及可能的信號(hào)通路。通過分子對(duì)接預(yù)測(cè)活性成分與靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合能力。通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證鴉膽子活性成分治療結(jié)直腸癌的作用和作用機(jī)制。在滿足篩選條件的15個(gè)成分中共篩出鴉膽子苦醇、木犀草素、鴉膽子苷B、β-谷甾醇4個(gè)鴉膽子生物活性成分及32個(gè)鴉膽子治療結(jié)直腸癌的作用靶點(diǎn)，表皮因子生長受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）及細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）是鴉膽子治療結(jié)直腸癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)，EGFR/磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號(hào)通路可能在鴉膽子治療結(jié)直腸癌中發(fā)揮重要作用。分子對(duì)接結(jié)果表示4個(gè)生物活性成分均可較好結(jié)合，其中鴉膽子苦醇與3個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)的平均結(jié)合能負(fù)值最大，結(jié)合最穩(wěn)定，可能是鴉膽子抗結(jié)直腸癌最有效的活性成分。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，鴉膽子苦醇明顯抑制裸鼠體內(nèi)移植瘤的體積和質(zhì)量（＜0.01），下調(diào)腫瘤組織中EGFR、PI3K和Akt的蛋白表達(dá)水平（＜0.01），下調(diào)與G1/G0期細(xì)胞阻滯相關(guān)的cyclin D1和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（cyclin-dependent kinase 4，CDK4）的表達(dá)（＜0.01），上調(diào)與腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)的cleaved Caspase-3表達(dá)及B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X蛋白（B-cell lymphoma-2 associated X protein，Bax）/B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）值（＜0.01），下調(diào)與遷移和侵襲相關(guān)的蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）、MMP7表達(dá)（＜0.01）；鴉膽子苦醇組裸鼠肝功能、腎功能及血液指標(biāo)均未見顯著性差異。鴉膽子能夠通過多靶點(diǎn)、多通路治療結(jié)直腸癌，其主要活性成分為鴉膽子苦醇，其機(jī)制可能與抑制EGFR/PI3K/Akt信號(hào)通路從而引起G1/G0期阻滯，抑制增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

鴉膽子；鴉膽子苦醇；結(jié)直腸癌；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對(duì)接；木犀草素；鴉膽子苷B；β-谷甾醇；表皮因子生長受體；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；細(xì)胞周期蛋白D1

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，是全球癌癥死亡率的第2大原因[1]。大多數(shù)CRC是散發(fā)的，遺傳及環(huán)境因素是其重要的致病因素[2]?；熓荂RC的關(guān)鍵治療方案之一[3]。傳統(tǒng)中藥制劑作為癌癥化療的輔助治療已經(jīng)在全世界范圍內(nèi)被廣泛接受[4]。大量研究及臨床實(shí)踐向腫瘤的綜合治療不斷拓展，已經(jīng)證明傳統(tǒng)中藥作為輔助療法，與化療或者放療相結(jié)合，可以提高療效、減少不良反應(yīng)[5-7]。

鴉膽子(L.) Merr.是原生于我國東南部及其他熱帶、亞熱帶地區(qū)的苦木科灌木。以鴉膽子果實(shí)為原料生產(chǎn)的中藥抗腫瘤注射液，已廣泛在臨床被用于肺癌、肺癌腦轉(zhuǎn)移和胃腸道腫瘤的輔助治療。臨床研究證明鴉膽子可以增強(qiáng)臨床上晚期非小細(xì)胞肺癌的療效并降低化療的不良反應(yīng)[8-9]。鴉膽子苦醇是鴉膽子的重要活性成分[10]。研究發(fā)現(xiàn)，鴉膽子苦醇對(duì)乳腺癌、鼻咽癌、肺癌和其他惡性腫瘤均有抑制作用[11-14]。鴉膽子果實(shí)的乙醇提取物可能通過上調(diào)p53和抑制核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）抗人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞生長[15]。然而，其潛在機(jī)制尚不清楚。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種結(jié)合計(jì)算機(jī)科學(xué)與醫(yī)學(xué)來闡述藥物對(duì)疾病作用機(jī)制的新興方法，能系統(tǒng)地研究、鑒定中藥配方的生物活性化合物并可視化其多靶點(diǎn)、多途徑的作用機(jī)制，已被廣泛應(yīng)用于預(yù)測(cè)、分析中藥的藥理作用及潛在機(jī)制[4,16-17]。因此，本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度篩選鴉膽子的活性成分及針對(duì)CRC的靶點(diǎn)和信號(hào)通路。分子對(duì)接是研究小分子藥物與靶點(diǎn)蛋白受體之間的相互作用及親和力的模擬計(jì)算方法。分子對(duì)接可以作為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的進(jìn)一步驗(yàn)證，二者互補(bǔ)地用于中藥研究[18]。本研究通過分子對(duì)接模擬鴉膽子已鑒定組分與其可能靶標(biāo)蛋白的分子相互作用并計(jì)算結(jié)合力。鴉膽子苦醇作為被驗(yàn)證的鴉膽子抗腫瘤活性成分[10]，本研究進(jìn)一步在裸鼠荷瘤模型中驗(yàn)證其抗CRC的潛力及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)的效應(yīng)機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

12只SPF級(jí)雌性BALB/c-Nu小鼠，6周齡，體質(zhì)量16～20 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，質(zhì)量合格證編號(hào)No.110322220103372262，質(zhì)量許可證號(hào)SCXK（京）2019-0008，動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（吉）2018-0001。動(dòng)物于相對(duì)濕度45%～55%、溫度（22±1）℃、12 h光暗循環(huán)的環(huán)境下，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)吉林大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)202073）。

1.2 細(xì)胞

HCT116細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.3 藥品與試劑

鴉膽子苦醇（批號(hào)B26016，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、β-環(huán)糊精（批號(hào)T66291）購自上海源葉生物科技有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號(hào)D8418）購自美國Sigma公司；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)P0006C）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；4%～15%連續(xù)梯度聚丙烯酰胺預(yù)制膠（批號(hào)DG101-01）購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；表皮因子生長受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）抗體（批號(hào)AF6043）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）抗體（批號(hào)AF6241）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）抗體（批號(hào)AF6261）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（cyclin-dependent kinase 4，CDK4）抗體（批號(hào)DF6102）、細(xì)胞周期蛋白B1（cyclin B1）抗體（批號(hào)AF6168）、cyclin D1抗體（批號(hào)AF0931）、剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cleaved cystein-asparate protease-3，cleaved Caspase-3）抗體（批號(hào)AF7022）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體（批號(hào)AF6139）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體（批號(hào)AF0120）、蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶7（matrix metalloproteinase 7，MMP7）抗體（批號(hào)AF0218）、MMP2抗體（批號(hào)AF5330）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號(hào)AF7021）、電化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號(hào)KF001）均購自江蘇親科生物研究中心有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗（批號(hào)SA00001-2）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.4 儀器

ChemiScope 6000 Touch型凝膠成像儀（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）；SC-412型4 ℃立式冷藏柜（青島市海爾股份有限公司）；PowerPac3000型電泳儀（美國Bio-Rad公司）；MOV-112F型細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本三洋公司）；V18R型高速冷凍離心機(jī)（瑞士Dynamica公司）；BETS-100型搖床振蕩器（海門市其林貝爾公司）；Hemo 3600V型Shinova血液學(xué)分析儀（上海麥本醫(yī)療科技有限公司）。

2 方法

2.1 鴉膽子的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析及分子對(duì)接

2.1.1 鴉膽子的活性成分及靶點(diǎn) 利用中醫(yī)系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp. php）、中醫(yī)藥資料庫（http://tcm.cmu.edu.tw/）以及文獻(xiàn)檢索的方法收集鴉膽子的主要活性成分，將能在PubChem中檢索對(duì)應(yīng)的CAS號(hào)和SMILES號(hào)的成分進(jìn)行收集。同時(shí)，對(duì)收集的成分進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)信息檢索，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18為篩選條件。

2.1.2 CRC的靶點(diǎn)及交集靶點(diǎn)的獲取 在GeneCards（https://www.genecards.org）中，以“CRC”為檢索詞，物種限定為“Homo sapiens”，對(duì)其進(jìn)行注釋和預(yù)測(cè)。收集相關(guān)性值大于1的靶點(diǎn)作為疾病靶點(diǎn)。在Venn 2.1.0制圖平臺(tái)（https://bioinfogp.cnb. csic.es/tools/venny/index.html）繪制CRC與鴉膽子的交集靶點(diǎn)。

2.1.3 “活性成分-CRC”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過Cytoscape 3.7.2（https://cytoscape.org）可視化“活性成分-CRC”網(wǎng)絡(luò)，連接的節(jié)點(diǎn)越密集，受該成分調(diào)控的靶點(diǎn)越多，表明該成分是鴉膽子抗CRC的重要活性成分。

2.1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選 將CRC靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org）進(jìn)行分析，模式設(shè)置為“多種蛋白”，物種限定為“Homo sapiens”。預(yù)讀數(shù)據(jù)后，其余蛋白的置信度≥0.99，與其余蛋白無聯(lián)系的蛋白被隱藏。然后構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，分?jǐn)?shù)設(shè)置為0.4，剔除不符合得分的靶標(biāo)。利用Barplot繪圖函數(shù)，對(duì)蛋白質(zhì)連接節(jié)點(diǎn)的個(gè)數(shù)進(jìn)行技術(shù)并繪制直方圖，尋找核心靶點(diǎn)。

2.1.5 基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 利用R 3.6.0軟件進(jìn)行GO功能富集分析，從靶細(xì)胞的分子功能、細(xì)胞成分和生物過程確定基因富集的功能，值與富集程度呈正相關(guān)。用R將結(jié)果繪制成相應(yīng)的直方圖和氣泡圖，選取篩選校正后＜0.05的富集結(jié)果。利用KEGG途徑富集分析獲得樞紐靶點(diǎn)作用的途徑。

2.1.6 分子對(duì)接 將小分子藥物的mol2格式的文件導(dǎo)入AutoDockTools（Version 1.5.7），對(duì)小分子藥物進(jìn)行平衡電荷、將非極性氫原子與相對(duì)應(yīng)的碳原子合并等修飾獲得3D結(jié)構(gòu)，然后轉(zhuǎn)化為PDBQT格式的文件。從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/，Protein Data Bank，PDB）獲取EGFR（ID：1M17）、Caspase-3（ID：4QUB）、Cyclin D1（ID：5VZU）的晶體結(jié)構(gòu)。通過AutoDockTools對(duì)受體蛋白進(jìn)行去水、加氫、平衡電荷等預(yù)處理后轉(zhuǎn)化為PDBQT格式的文件。利用AutoDockTools對(duì)小分子藥物和配體蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，將受體和配體的PDBQT文件導(dǎo)入AutoDockTools，構(gòu)建對(duì)接口袋。在大分子上設(shè)置中心，并設(shè)置、和的參數(shù)以保證蛋白質(zhì)完全被覆蓋。將輸出的最大結(jié)合模式數(shù)設(shè)置為20。分子對(duì)接后生成活性位點(diǎn)位置，并計(jì)算結(jié)合能和氫鍵數(shù)。結(jié)合能為負(fù)值說明小分子藥物配體可以與受體靶點(diǎn)蛋白自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能越小說明結(jié)合越穩(wěn)定，結(jié)合能＜?17.782 kJ/mol即為能較好結(jié)合。用OpenBabel將對(duì)接好的文件轉(zhuǎn)換為PDB格式，通過PyMOL（3D，Version 2.2.0）和LigPlot（2D）對(duì)偶聯(lián)模型進(jìn)行可視化，并展示氫鍵，這2種模型都被廣泛應(yīng)用于可視化對(duì)接結(jié)果，包括配體與蛋白質(zhì)主鏈或側(cè)鏈元件之間的對(duì)接位點(diǎn)和氫鍵相互作用模式。

2.2 鴉膽子苦醇治療CRC的作用研究

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HCT116細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2.2 動(dòng)物模型的制備 BALB/c-Nu小鼠右背側(cè)sc 100 μL HCT116細(xì)胞（2×106個(gè)），待腫瘤生長體積為80～100 mm3，小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和鴉膽子苦醇（2 mg/kg）組，每組6只。鴉膽子苦醇溶于1% DMSO和20% β-環(huán)糊精中，給藥組ip藥物，對(duì)照組ip等體積的DMSO和β-環(huán)糊精，每隔1 d給藥1次。每隔1 d記錄腫瘤大小和小鼠體質(zhì)量，當(dāng)腫瘤大小達(dá)到2000 mm3時(shí)，采用頸椎脫位法處死小鼠，收集腫瘤，測(cè)量腫瘤體積和質(zhì)量，采集小鼠眶后靜脈竇全血。

2.2.3 Western blotting檢測(cè)腫瘤組織細(xì)胞周期、侵襲、遷移、增殖及EGFR/PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白表達(dá) 取各組小鼠腫瘤組織，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的預(yù)冷RIPA裂解液提取蛋白，12 000 r/min離心10 min，取上清，采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉30 min，分別加入EGFR（1∶1000）、PI3K（1∶1000）、Akt（1∶1000）、CDK4（1∶1000）、cyclin B1（1∶1000）、cyclin D1（1∶1000）、cleaved Caspase-3（1∶1000）、Bax（1∶2000）、Bcl-2（1∶1000）、MMP7（1∶1500）、MMP2（1∶1000）、GAPDH（1∶20 000）抗體，4 ℃孵育過夜；加入二抗（1∶20 000），室溫孵育1 h。使用電化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，采用成像儀及Image J 2.1軟件分析條帶灰度值。

2.2.4 肝腎功及血常規(guī)指標(biāo)檢測(cè) 采用Shinova血液學(xué)分析儀分析小鼠的肝功能指數(shù)、腎功能指數(shù)和血常規(guī)指標(biāo)，包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-glutamyl transpeptidase，γ-GT）、總膽汁酸（total bile acid，T-BIL）、白蛋白（albumin，ALB）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、肌酐（creatinine，CREA）、尿酸（uric acid，UA）、白細(xì)胞（white blood cell，WBC）、紅細(xì)胞（red blood cell，RBC）、血小板（platelet，PLT）和血紅蛋白（haemoglobin，HGB）。

3 結(jié)果

3.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析及分子對(duì)接

3.1.1 鴉膽子活性成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的獲取 通過TCMSP檢索共獲得67個(gè)活性成分，以O(shè)B≥30%、DL≥0.18作為補(bǔ)充條件篩選，共獲得15個(gè)鴉膽子主要活性成分（表1）。收集活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，去除重復(fù)值后共獲得34個(gè)靶點(diǎn)。

表1 鴉膽子活性成分

3.1.2 CRC相關(guān)的靶點(diǎn)及與藥物交集靶點(diǎn)的獲取 Genecard數(shù)據(jù)庫中檢索到人類CRC相關(guān)的靶點(diǎn)共9410個(gè)，經(jīng)過用Venn 2.1.0得到32個(gè)鴉膽子與CRC的交集靶點(diǎn)（圖1），包括EGFR、Caspase-3、cyclin D1、CDK4、MMP-9和血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）等。

3.1.3 “活性成分-CRC”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過Cytoscape 3.7.2可視化“活性成分-CRC”網(wǎng)絡(luò)（圖2），包含37個(gè)節(jié)點(diǎn)和97個(gè)連接。橢圓節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)，方框節(jié)點(diǎn)表示活性成分，灰色線表示節(jié)點(diǎn)間相互作用。

圖1 鴉膽子活性成分-CRC靶點(diǎn)Venn圖

橢圓節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)，方框節(jié)點(diǎn)表示活性成分，灰色線表示節(jié)點(diǎn)間相互作用

3.1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析 將32個(gè)鴉膽子與CRC交集靶點(diǎn)輸入STRING，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)（圖3），共獲得32個(gè)節(jié)點(diǎn)和152條節(jié)點(diǎn)之間的連線。節(jié)點(diǎn)是鴉膽子與CRC交集靶點(diǎn)編碼的蛋白，節(jié)點(diǎn)的連線越多，表示相互作用越多，靶點(diǎn)的作用越重要。根據(jù)節(jié)點(diǎn)的連線數(shù)量，通過Barplot計(jì)算并統(tǒng)計(jì)前30個(gè)靶點(diǎn)（圖4），前3名為EGFR、Caspase-3和cyclin D1。

3.1.5 GO功能和KEGG通路富集分析 如圖5所示，鴉膽子治療CRC主要涉及細(xì)胞凋亡、自噬、基因表達(dá)負(fù)調(diào)控、蛋白磷酸化以及蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等，主要作用于PI3K/Akt信號(hào)通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號(hào)通路和p53信號(hào)通路等。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)分析

3.1.6 分子對(duì)接 選取PPI網(wǎng)絡(luò)中排名前3名的靶點(diǎn)EGFR、Caspase-3及cyclin D1，分別與鴉膽子治療CRC的4個(gè)關(guān)鍵活性成分進(jìn)行分子對(duì)接（圖6），LigPlot將結(jié)果二維可視化，標(biāo)明氫鍵的個(gè)數(shù)、長度及小分子藥物配體連接的氨基酸殘基（圖7）。一般認(rèn)為，小于?17.782、?20.92或?29.288 kJ/mol的結(jié)合能分別表明配體與受體之間有一定的、好的或較強(qiáng)的結(jié)合活性。結(jié)合能反映了受體和配體之間結(jié)合的可能性。結(jié)合能越低，受體與配體的親和力越高，構(gòu)象越穩(wěn)定。其中，鴉膽子苦醇與EGFR的結(jié)合能最低（?37.530 5 kJ/mol）。與鴉膽子苦醇和木犀草素相比，鴉膽子苷B和β-谷甾醇與3個(gè)靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合能均較高，親和力較低。鴉膽子苦醇與EGFR、Caspase-3及cyclin D1的結(jié)合能分別為?37.530 5、?33.137 3、?30.710 6 kJ/mol，平均結(jié)合能為?33.792 8 kJ/mol。木犀草素與EGFR、Caspase-3及cyclin D1的結(jié)合能為?26.652 1、?30.585 0、?25.689 8 kJ/mol，平均結(jié)合能為?27.642 3 kJ/mol。

圖5 GO功能(A) 和KEGG通路(B) 富集分析(前20)

圖6 鴉膽子苦醇、木犀草素與靶點(diǎn)蛋白EGFR、Caspase-3和cyclin D1的3D分子對(duì)接結(jié)果

圖7 鴉膽子苦醇、木犀草素與靶點(diǎn)蛋白EGFR、Caspase-3和cyclin D1的2D分子對(duì)接結(jié)果

3.2 鴉膽子苦醇抗CRC的作用驗(yàn)證

3.2.1 鴉膽子苦醇對(duì)荷瘤裸鼠模型腫瘤生長的影響 如圖8所示，與對(duì)照組比較，鴉膽子苦醇組裸鼠腫瘤生長速度被明顯抑制（＜0.01），證明了鴉膽子苦醇對(duì)CRC具有明顯的抑制作用。

3.2.2 鴉膽子苦醇對(duì)荷瘤裸鼠模型腫瘤組織細(xì)胞周期、侵襲、遷移、增殖及EGFR/PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 如圖9所示，與對(duì)照組比較，鴉膽子苦醇組腫瘤組織中EGFR、PI3K、Akt、CDK4、cyclin D1、MMP9、MMP7和Bcl-2蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.01），cyclin B1、cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平均明顯升高（＜0.01），Bax/Bcl-2值顯著升高（＜0.01）。

與對(duì)照組比較：**P＜0.01，下圖同

圖9 鴉膽子苦醇對(duì)荷瘤裸鼠模型腫瘤組織EGFR、PI3K、Akt、CDK4、cyclin D1、cyclin B1、MMP9、MMP7、cleaved Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

3.2.3 鴉膽子苦醇對(duì)荷瘤裸鼠生物安全性評(píng)價(jià) 為研究鴉膽子苦醇對(duì)荷瘤裸鼠代謝器官的影響，檢測(cè)對(duì)照組和鴉膽子苦醇組荷瘤裸鼠的肝功能指標(biāo)（ALT、AST、ALB、γ-GT、T-BIL）及腎功能指標(biāo)（BUN、CREA、UA）和血常規(guī)指標(biāo)（WBC、RBC、PLT、HGB），如圖10所示，與對(duì)照組比較，鴉膽子苦醇組荷瘤裸鼠肝、腎功能和血常規(guī)指標(biāo)均無顯著差異。

圖10 鴉膽子苦醇的生物安全性評(píng)估(, n = 3)

4 討論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析鴉膽子的主要活性成分及其抗CRC的潛在機(jī)制，共獲得鴉膽子苦醇、木犀草素、鴉膽子苷B、β-谷甾醇4個(gè)小分子藥物活性成分和EGFR、Caspase-3、cyclin D1等32個(gè)核心靶點(diǎn)。KEGG通路富集分析表明鴉膽子抑制CRC可能與PI3K/Akt通路、TNF信號(hào)通路和p53信號(hào)通路等相關(guān)。在4個(gè)活性成分中，鴉膽子苦醇和木犀草素對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)明顯多于鴉膽子苷B和β-谷甾醇。將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)的核心成分鴉膽子苦醇及木犀草素與關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，2個(gè)核心成分與EGFR、Caspase-3和cyclin D1蛋白的活性結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合能均小于?16.736 kJ/mol，表明核心成分與關(guān)鍵的靶點(diǎn)蛋白之間可以自發(fā)結(jié)合且具有較強(qiáng)的結(jié)合活性。在篩選的4種鴉膽子活性成分中，鴉膽子苦醇和木犀草素均可與EGFR相互作用，EGFR是多種靶向藥物的治療靶點(diǎn)，如吉非替尼和厄洛替尼用于治療非小細(xì)胞肺癌，拉帕替尼用于治療晚期或轉(zhuǎn)移性乳腺癌[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素與EGFR的Lys721、Glu738、Ala731形成3個(gè)氫鍵，鴉膽子苦醇與EGFR的Ile917形成1個(gè)氫鍵。木犀草素和鴉膽子苦醇對(duì)EGFR的親和力表明木犀草素-EGFR、鴉膽子苦醇-EGFR相互作用的有效性。

鴉膽子苦醇是鴉膽子的主要活性成分。已有研究證實(shí)，鴉膽子苦醇可以阻斷PI3K/Akt通路的信號(hào)傳導(dǎo)，抑制胃癌等多種癌癥的發(fā)生發(fā)展[20]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果表明，鴉膽子苦醇可通過EGFR/PI3K/ Akt通路抗CRC。進(jìn)一步通過Western blotting實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了鴉膽子苦醇可以使該級(jí)聯(lián)通路明顯失活從而達(dá)到抑制CRC，驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果。本研究通過構(gòu)建裸鼠移植瘤模型，研究了鴉膽子苦醇對(duì)CRC的治療作用。鴉膽子苦醇明顯抑制荷瘤裸鼠模型體內(nèi)腫瘤的生長，同時(shí)與代謝相關(guān)的肝臟功能和腎臟功能未受到明顯的影響，血常規(guī)指標(biāo)也沒有觀察到顯著差異。表明鴉膽子苦醇具有很好的抑制CRC腫瘤細(xì)胞生長的作用。細(xì)胞周期與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)，主要由G1/G0和G2/M期組成，由cyclin/CDK復(fù)合物和CDK抑制劑協(xié)調(diào)。研究表明，鴉膽子苦醇通過作用于CDK4和cyclin D1調(diào)節(jié)非小細(xì)胞肺癌的G1/G0期，cyclin D1表達(dá)的降低導(dǎo)致G1/G0期細(xì)胞的阻滯[21]，與本研究的結(jié)果一致，表明鴉膽子苦醇能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的G1/G0期阻滯，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是抑制腫瘤發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，受Caspase和Bcl-2家族蛋白的調(diào)控，Bcl-2家族蛋白包括促凋亡效應(yīng)蛋白如Bax和抗凋亡效應(yīng)蛋白如Bcl-2。促凋亡效應(yīng)蛋白在凋亡應(yīng)激源的作用下導(dǎo)致線粒體外膜通透化，釋放細(xì)胞色素C來切割Caspase-3，從而導(dǎo)致不可逆的細(xì)胞凋亡。鴉膽子苦醇可通過上調(diào)cleaved Caspase-3表達(dá)和Bax/Bcl-2值，促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞凋亡[22]，與本研究結(jié)果一致，表明鴉膽子苦醇可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，可能涉及線粒體凋亡途徑。腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤患者死亡的相關(guān)因素。細(xì)胞外基質(zhì)被MMP修飾和降解，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的分離和遷移。本研究發(fā)現(xiàn)，鴉膽子苦醇能夠降低腫瘤組織中MMP7和MMP9的表達(dá)，具有抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移的能力，與鴉膽子苦醇對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞的作用一致[19]。

藥物的積累和清除可能損害器官。因此，通過對(duì)小鼠的血液生化指標(biāo)來評(píng)估鴉膽子苦醇是否具有潛在的毒性作用。結(jié)果顯示，肝、腎功能和血常規(guī)指標(biāo)未見藥物引起的顯著性差異。因此，鴉膽子苦醇是一種安全、有效、有前景的抗腫瘤佐劑。然而，本研究有幾個(gè)局限性：①來自在線數(shù)據(jù)庫的信息是基于審查和預(yù)測(cè)的數(shù)據(jù)，因此，未經(jīng)證實(shí)和未記錄的化合物或靶點(diǎn)可能未被列入本研究中；②目前對(duì)鴉膽子15種化合物的定量測(cè)定研究尚不完全，因此，未來應(yīng)進(jìn)行內(nèi)容確定的研究；③鴉膽子苦醇雖然為鴉膽子抗CRC的最重要的生物活性成分，但不能完全代表鴉膽子，因此，需要進(jìn)一步的研究來探索鴉膽子體內(nèi)外治療CRC的潛在分子機(jī)制。

本研究先通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)闡明了鴉膽子抗CRC最重要的4個(gè)生物活性成分（鴉膽子苦醇、木犀草素、鴉膽子苷B、β-谷甾醇）和3個(gè)重要靶點(diǎn)（EGFR、Caspase-3、cyclin D1），主要作用于EGFR/ PI3K/Akt信號(hào)通路；通過分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證了活性成分與靶點(diǎn)的結(jié)合能力，發(fā)現(xiàn)鴉膽子苦醇是鴉膽子抗CRC的關(guān)鍵成分；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了鴉膽子苦醇抗CRC的作用及分子機(jī)制，為鴉膽子治療CRC提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為從中藥中探究活性成分、核心靶點(diǎn)和潛在機(jī)制提供了方法。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Malki A, ElRuz R A, Gupta I,. Molecular mechanisms of colon cancer progression and metastasis: Recent insights and advancements [J]., 2020, 22(1): 130.

[2] Weitz J, Koch M, Debus J,. Colorectal cancer [J]., 2005, 365(9454): 153-165.

[3] Haraldsdottir S, Einarsdottir H M, Smaradottir A,. Colorectal cancer-review [J]., 2014, 100(2): 75-82.

[4] Jin J Y, Chen B, Zhan X Y,. Network pharmacology and molecular docking study on the mechanism of colorectal cancer treatment using Xiao-Chai-Hu-Tang [J]., 2021, 16(6): e0252508.

[5] Wang Q, Jiao L J, Wang S F,. Maintenance chemotherapy with Chinese herb medicine formulas. with placebo in patients with advanced non-small cell lung cancer after first-line chemotherapy: A multicenter, randomized, double-blind trial [J]., 2018, 9: 1233.

[6] Mao D, Feng L, Huang S Q,. Meta-analysis of Xihuang Pill efficacy when combined with chemotherapy for treatment of breast cancer [J]., 2019, 2019: 1-14.

[7] Liu X D, Tian S, Liu M,. Wogonin inhibits the proliferation and invasion, and induces the apoptosis of HepG2 and Bel7402 HCC cells through NF?κB/Bcl-2, EGFR and EGFR downstream ERK/AKT signaling [J]., 2016, 38(4): 1250-1256.

[8] Ni M W, Liu X K, Meng Z Q,. A bioinformatics investigation into the pharmacological mechanisms of javanica oil emulsion injection in non-small cell lung cancer based on network pharmacology methodologies [J]., 2020, 20(1): 174.

[9] 劉志華, 陳曉燕, 袁磊, 等. 鴉膽子油乳注射液聯(lián)合AP方案治療晚期非小細(xì)胞肺癌的臨床研究[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床, 2022, 37(11): 2551-2555.

[10] Yu X Q, Shang X Y, Huang X X,. Brusatol: A potential anti-tumor quassinoid from[J]., 2020, 12(4): 359-366.

[11] Ren D, Villeneuve N F, Jiang T,. Brusatol enhances the efficacy of chemotherapy by inhibiting the Nrf2-mediated defense mechanism [J]., 2011, 108(4): 1433-1438.

[12] Guo S B, Zhang J L, Wei C R,. Anticancer effects of brusatol in nasopharyngeal carcinoma through suppression of the Akt/mTOR signaling pathway [J]., 2020, 85(6): 1097-1108.

[13] Song Q L, He Z Q, Li B,. Melatonin inhibits oxalate-induced endoplasmic reticulum stress and apoptosis in HK-2 cells by activating the AMPK pathway [J]., 2020, 19(20): 2600-2610.

[14] 鄔琪, 孫薇, 王力玄, 等. 鴉膽子中苦木素類化學(xué)成分及其藥理作用研究進(jìn)展[J]. 中草藥, 2021, 52(20): 6431-6441.

[15] Bagheri E, Hajiaghaalipour F, Nyamathulla S,. The apoptotic effects offruit extract against HT29 cells associated with p53 upregulation and inhibition of NF-κB translocation [J]., 2018, 12: 657-671.

[16] Zhang B Y, Liu G Y, Wang X,. Identification of molecular targets and potential mechanisms of Yinchen Wuling San against head and neck squamous cell carcinoma by network pharmacology and molecular docking [J]., 2022, 13: 914646.

[17] 牛明, 張斯琴, 張博, 等.《網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)評(píng)價(jià)方法指南》解讀 [J]. 中草藥, 2021, 52(14): 4119-4129.

[18] Liu J Q, Liu J, Tong X L,. Network pharmacology prediction and molecular docking-based strategy to discover the potential pharmacological mechanism of Huai Hua San against ulcerative colitis [J]., 2021, 15: 3255-3276.

[19] Zhang H P, Pan J B, Zhang C,. Network understanding of herb medicine via rapid identification of ingredient-target interactions [J]., 2014, 4: 3719.

[20] Chen H, Jiang T, Chen H,. Brusatol reverses lipopolysaccharide-induced epithelial-mesenchymal transformation and induces apoptosis through PI3K/Akt/ NF-κB pathway in human gastric cancer SGC-7901 cells [J]., 2021, 32(4): 394-404.

[21] Xie J H, Lai Z Q, Zheng X H,. Apoptotic activities of brusatol in human non-small cell lung cancer cells: Involvement of ROS-mediated mitochondrial-dependent pathway and inhibition of Nrf2-mediated antioxidant response [J]., 2021, 451: 152680.

[22] Wang T T, Dou Y X, Lin G S,. The anti-hepatocellular carcinoma effect ofoil in ascitic tumor-bearing mice: The detection of brusatol and its role [J]., 2021, 134: 111122.

Mechanism ofin treatment of colorectal cancer based on network pharmacology and molecular docking

ZHAO Wei-xin, WANG Qing, WANG Meng-qi, JI An-xuan, ZHENG Jing-ying, ZHAO Shu-hua

Department of Obstetrics and Gynecology, Second Hospital of Jilin University, Changchun 130022, China

To explore the active components, key targets and potential mechanisms ofin treatment of colorectal cancer by network pharmacology combined with molecular docking andverification.The active components, corresponding targets and colorectal cancer-related targets ofwere retrieved and collected from the public database. The active components, component-disease intersection targets and possible signal pathways ofin treatment of colorectal cancer were analyzed through network pharmacology. Binding ability of active components to target protein was predicted by molecular docking. The effect and mechanism ofactive components in treatment of colorectal cancer were further verified byexperiments.Among the 15 components that met the screening conditions, four bioactive components (brusatol, luteolin, bruceoside B, β-sitosterol) and 32 therapeutic targets ofwere screened. The epidermal growth factor receptor (EGFR), cystein-asparate protease-3 (Caspase-3) and cyclin D1 were the key targets ofin the treatment of colorectal cancer. EGFR/phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (Akt) signaling pathway may played an important role ofin treatment of colorectal cancer. The results of molecular docking showed that all four bioactive components could bind well, and average binding energy of brusatol with three key targets was the most negative and the binding was the most stable, which may be the most effective active component ofagainst colorectal cancer. The results of animal experiments showed that compared with control group, brusatol significantly inhibited the volume and weight of transplanted tumor in nude mice (< 0.01), down-regulated the protein expression levels of EGFR, PI3K and Akt in tumor tissues (< 0.01), down-regulated cyclin D1 and cyclin-dependent kinase 4 (CDK4) expressions (< 0.01), up-regulated the expressions of tumor cell apoptosis related protein such as cleaved Caspase-3 and B-cell lymphoma-2 associated X protein (Bax)/B-cell lymphoma-2 (Bcl-2) (< 0.01), down-regulated the expressions of migration and invasion related proteins such as matrix metalloproteinase 9 (MMP9) and MMP7 (< 0.01); There was no significant difference in liver function, renal function and blood indexes of nude mice in brusatol group.can treat colorectal cancer through multiple targets and channels, and its main active component is bruceol. Its mechanism may be related to inhibiting EGFR/PI3K/Akt signaling pathway, thus causing G1/G0phase block, inhibiting proliferation, invasion and migration, and promoting cell apoptosis.

(L.) Merr.; brusatol; colorectal cancer; network pharmacology; molecular docking; luteolin; bruceoside B; β-sitosterol; epidermal growth factor receptor; cystein-asparate protease-3; cyclin D1

R285.5

A

0253 - 2670(2023)06 - 1850 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.06.017

2022-10-29

吉林省發(fā)展和改革委員會(huì)項(xiàng)目（2014G073）；吉林省直廳局項(xiàng)目（2019SCZT040）；吉林省科技廳基礎(chǔ)處項(xiàng)目（20200201589JC）

趙韋欣，女，碩士，研究方向?yàn)閶D產(chǎn)科學(xué)。Tel: 18438611878 E-mail: zhaoweixinxin@163.com

鄭晶瑩，博士。E-mail: zheng_jy@jlu.edu.cn

趙淑華，女，教授，碩士生導(dǎo)師。E-mail: zhaoshuhua-1966@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]