亮氨酸對(duì)不同動(dòng)物體外胰腺組織消化酶分泌的比較研究

■張展赫 馬 軒 王夢(mèng)雅，2 李 茹 邵 凱 吳東霖 徐 明*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100）

反芻動(dòng)物和單胃動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率有很大的不同，這是由于在長(zhǎng)久進(jìn)化過(guò)程中采食不同飼料造成的，反芻動(dòng)物的消化生理比單胃動(dòng)物復(fù)雜得多，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)都要首先經(jīng)瘤胃微生物發(fā)酵，而單胃動(dòng)物都是通過(guò)消化液將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分解為小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)后被吸收。由于單胃動(dòng)物體內(nèi)沒(méi)有分泌淀粉酶的腺體，淀粉胃內(nèi)不能被降解，會(huì)直接進(jìn)入小腸，小腸中含有多種消化液（如胰液等）。反芻動(dòng)物攝入的淀粉有15%～25%不經(jīng)過(guò)瘤胃消化，直接進(jìn)入小腸[1]，但是反芻動(dòng)物小腸對(duì)淀粉的消化率有限，僅能消化40%～62%的過(guò)瘤胃淀粉[2]。因此，僅將淀粉消化位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到小腸并不能提高淀粉的利用率，而一些支鏈氨基酸（亮氨酸）可以促進(jìn)胰腺的發(fā)育和胰酶的合成，進(jìn)而可以提高小腸對(duì)淀粉的利用[3]。

胰腺具有內(nèi)分泌和外分泌雙重功能，外分泌功能受到多種因素的影響，如動(dòng)物年齡[4]、日糧[5-6]等。Swason 等[5]發(fā)現(xiàn)真胃灌注酪蛋白可以提高胰腺α-淀粉酶的分泌量。現(xiàn)有研究表明，胰腺消化酶分泌不足會(huì)限制小腸中淀粉的消化[2，8]，因此可以提高胰腺消化酶的分泌來(lái)提升對(duì)淀粉的利用率。前期試驗(yàn)表明，十二指腸灌注亮氨酸可以增加胰腺酶的分泌[9-10]，在對(duì)奶山羊體外胰腺組織培育的研究中也發(fā)現(xiàn)，亮氨酸可以提升α-淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶的分泌[11]。相反，在單胃動(dòng)物，亮氨酸能夠抑制胰腺α-淀粉酶mRNA的表達(dá)，降低了α-淀粉酶的分泌[12-13]。目前關(guān)于亮氨酸對(duì)不同動(dòng)物體外胰腺組織消化酶分泌是否存在種間差異尚無(wú)報(bào)道。

健康養(yǎng)殖是現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展的前提，而科學(xué)的營(yíng)養(yǎng)策略是保障動(dòng)物健康的根本手段[14]，基于此，本試驗(yàn)旨在通過(guò)體外組織培養(yǎng)的方法，研究亮氨酸對(duì)牛、羊、豬、雞胰腺消化酶的分泌是否存在種間差異，為提高小腸淀粉利用率，減少飼料資源浪費(fèi)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)一

亮氨酸濃度對(duì)體外胰腺組織消化酶分泌的影響規(guī)律。

1.1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，亮氨酸濃度設(shè)置為0、2.62、5.24 mg/mL 和10.48 mg/mL，胰腺組織分別來(lái)自西門塔爾牛、大白豬、白羽雞以及小尾寒羊，每種動(dòng)物選取5頭（只）屠宰。

1.1.2 試驗(yàn)方法

選用健康、體況良好的牛5頭，屠宰后，立即取出胰腺，用4 ℃的生理鹽水沖洗，并置于4 ℃鹽水中送去實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行組織剝離，切成2 mm×2 mm（約0.1 g）的小塊，用濾紙吸干水分后稱重，使用Swanson等[15]描述的方法孵育胰腺組織。將組織塊放入含有0、2.62、5.24 mg/mL 和10.48 mg/mL 亮氨酸的Krebs Ringer bicarbonate buffer（KRB）溶液中進(jìn)行組織塊培養(yǎng)，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，并在39 ℃恒溫水浴搖床中以90次/min的振蕩頻率分別培養(yǎng)1 h后，將培養(yǎng)板置于冰上，采集培養(yǎng)液和胰腺組織用于測(cè)定組織釋放酶活和組織內(nèi)酶活（α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶）。將所有培養(yǎng)液的pH調(diào)至7.4。羊、豬、雞的處理與牛一樣，胰腺組織分開(kāi)培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)二

亮氨酸對(duì)牛、羊、豬、雞體外胰腺組織消化酶分泌的交互影響。

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用雙因素交互試驗(yàn)設(shè)計(jì)，亮氨酸濃度為0、5.24 mg/mL，所用胰腺組織與試驗(yàn)一相同。

1.2.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)二動(dòng)物與培養(yǎng)方法同試驗(yàn)一，取牛、羊、豬、雞胰腺組織一起培養(yǎng)。亮氨酸濃度梯度設(shè)置為0、5.24 mg/mL，培養(yǎng)時(shí)間為1 h。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

胰腺組織和培養(yǎng)液樣品主要用于分析α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶活性，其試劑盒均購(gòu)自南京奧青生物技術(shù)有限公司。一個(gè)酶活性單位定義為39 ℃下每分鐘釋放1 μmol產(chǎn)物。

組織釋放（IU/g）=KRB培養(yǎng)液（mL）×酶活性（IU/mL）/組織重量（g）

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

通過(guò)SAS 9.2的GLM程序分析消化酶活性數(shù)據(jù)，試驗(yàn)一使用單因素方差分析（ANOVA）分析培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)亮氨酸對(duì)胰腺消化酶參數(shù)的影響；試驗(yàn)二使用Duncan’s法對(duì)組均值之間的顯著性進(jìn)行多重比較及交互作用分析。P＜0.05時(shí)，表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 亮氨酸濃度對(duì)體外胰腺組織消化酶分泌的影響

2.1.1 亮氨酸濃度對(duì)牛體外胰腺組織和組織釋放中消化酶分泌的影響規(guī)律

由表1 可知，亮氨酸對(duì)胰腺組織中α-淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶活性的影響呈線性增加（P＜0.05），對(duì)脂肪酶的活性沒(méi)有顯著影響（P＞0.05）；亮氨酸對(duì)胰腺組織釋放中α-淀粉酶活性的影響呈線性增加（P＜0.05），線性降低了脂肪酶的活性（P＜0.05），對(duì)胰蛋白酶和糜蛋白酶活性的影響呈二次變化（P＜0.05）。

2.1.2 亮氨酸濃度對(duì)羊體外胰腺組織和組織釋放中消化酶活性的影響規(guī)律

由表2 可知，亮氨酸對(duì)胰腺組織中α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性的影響呈線性增加（P＜0.05）；亮氨酸對(duì)組織釋放中α-淀粉酶和胰蛋白酶活性的影響呈線性增加（P＜0.05），對(duì)脂肪酶和糜蛋白酶活性的影響呈二次曲線變化（P＜0.05）。

表2 亮氨酸濃度對(duì)羊體外胰腺組織和組織釋放中消化酶活性的影響規(guī)律（IU/g）

2.1.3 亮氨酸濃度對(duì)豬體外胰腺組織和組織釋放中消化酶分泌的影響規(guī)律

由表3 可知，亮氨酸對(duì)胰腺組織中脂肪酶活性的影響呈線性增加（P＜0.05），對(duì)α-淀粉酶和糜蛋白酶活性的影響呈二次變化（P＜0.05），但是不影響胰蛋白酶的活性（P＞0.05）；亮氨酸對(duì)胰腺組織中釋放的α-淀粉酶、脂肪酶和糜蛋白酶活性的影響呈線性增加（P＜0.05），對(duì)胰蛋白酶活性的影響呈二次變化（P＜0.05）。

表3 亮氨酸濃度對(duì)豬體外胰腺組織和組織釋放中消化酶活性的影響規(guī)律（IU/g）

2.1.4 亮氨酸濃度對(duì)雞體外胰腺組織和組織釋放中消化酶分泌的影響規(guī)律

由表4 可知，亮氨酸對(duì)胰腺組織中α-淀粉酶、脂肪酶活性的影響呈線性增加（P＜0.05），對(duì)胰蛋白酶活性的影響呈二次變化（P＜0.05），不影響糜蛋白酶的活性（P＞0.05）；亮氨酸對(duì)胰腺組織釋放中α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶活性的影響呈線性增加（P＜0.05）。

表4 亮氨酸濃度對(duì)雞體外胰腺組織和組織釋放中消化酶活性的影響規(guī)律（IU/g）

結(jié)合試驗(yàn)一與先前的研究[16]表明，促進(jìn)胰腺消化酶分泌的最佳濃度為5.24 mg/mL，因此將它們作為試驗(yàn)二的孵育條件。

2.2 亮氨酸對(duì)牛、羊、豬、雞體外胰腺組織消化酶分泌的交互影響

由表5 可知，不同動(dòng)物種類對(duì)胰腺組織中α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的分泌有顯著影響（P＜0.05），亮氨酸對(duì)α-淀粉酶和脂肪酶的分泌有顯著影響（P＜0.05），動(dòng)物種類和亮氨酸濃度對(duì)脂肪酶和糜蛋白酶的活性有交互作用（P＜0.05）；動(dòng)物種類對(duì)培養(yǎng)液中釋放的α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性有顯著影響（P＜0.05），亮氨酸對(duì)α-淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶有顯著影響（P＜0.05），動(dòng)物種類和亮氨酸濃度對(duì)α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性具有交互作用（P＜0.05）。

表5 亮氨酸對(duì)牛、羊、豬、雞體外胰腺組織培養(yǎng)液中消化酶活性的交互作用(IU/g)

3 討論

通過(guò)體外組織培養(yǎng)法對(duì)胰腺組織外分泌功能進(jìn)行評(píng)價(jià)，這種方法可以排除其他因素的作用，從而可以更好的幫助我們研究營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)胰腺分泌功能的影響[15]。與單胃動(dòng)物相比，反芻動(dòng)物的淀粉消化率較低的一個(gè)關(guān)鍵限制因素是胰腺淀粉酶分泌不足[1，5，8，17]。現(xiàn)有研究已經(jīng)證明十二指腸蛋白對(duì)胰腺α-淀粉酶基因表達(dá)和分泌的影響在反芻動(dòng)物和單胃動(dòng)物之間是不同的，單胃動(dòng)物降低[18]，但是反芻動(dòng)物的基因表達(dá)和分泌量是升高的[6，19-20]，目前還沒(méi)有研究比較過(guò)亮氨酸對(duì)不同動(dòng)物胰腺組織外分泌功能的影響，因此，可以推測(cè)亮氨酸對(duì)反芻動(dòng)物胰腺α-淀粉酶的影響與非反芻動(dòng)物不一樣。

本試驗(yàn)結(jié)果表明亮氨酸可以提高牛、羊、豬、雞胰腺組織消化酶的活性。在劉凱[21]的研究中發(fā)現(xiàn)，亮氨酸能夠提高奶山羊體外胰腺組織α-淀粉酶的分泌，在亮氨酸濃度為2.62 mg/mL 和5.24 mg/mL 時(shí)，顯著提高了α-淀粉酶的活性，而10.48 mg/mL 對(duì)α-淀粉酶的活性沒(méi)有影響。十二指腸灌注亮氨酸可以提高山羊α-淀粉酶的活性[22]，對(duì)奶牛α-淀粉酶的合成速率呈先升高后降低的趨勢(shì)[20]，但也有研究表明亮氨酸不影響犢牛α-淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶的活性[23-24]。有研究證明，亮氨酸可以通過(guò)調(diào)節(jié)mTOR信號(hào)通路進(jìn)而影響胰腺消化酶的活性[25]，也可以通過(guò)改變基因表達(dá)調(diào)節(jié)其活性。給豬注射或口服亮氨酸其胰腺、肝臟和骨骼等組織中的蛋白質(zhì)合成會(huì)增加[26-27]。上述試驗(yàn)結(jié)果互不相同，而與本試驗(yàn)結(jié)果也有不同，造成這種的原因可能是由于體內(nèi)和體外的影響因素各有不同，以及不同試驗(yàn)動(dòng)物之間生理狀態(tài)等不同。

本研究的試驗(yàn)結(jié)果表明，雞胰腺組織中的α-淀粉酶低于牛、羊、豬。但豬、雞小腸淀粉消化率較牛和羊更高[2-3]。通過(guò)前人的研究發(fā)現(xiàn)，牛[28]、羊[29]的胰腺消化酶分泌量顯著低于豬[30]和雞[31]。因此，單胃動(dòng)物與反芻動(dòng)物小腸淀粉消化的差異主要不在胰腺組織層面，而是在胰腺器官、體液環(huán)境等的差異，這方面需要進(jìn)一步深入研究。

目前，亮氨酸對(duì)反芻動(dòng)物與非反芻動(dòng)物胰腺消化酶分泌是否存在種間差異方面尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)亮氨酸對(duì)不同動(dòng)物胰腺消化酶的分泌具有交互作用。現(xiàn)有研究已經(jīng)證實(shí)十二指腸蛋白對(duì)單胃動(dòng)物[25]與反芻動(dòng)物[7，19-20]胰腺α-淀粉酶的作用是存在差異的，這與本試驗(yàn)結(jié)果相符。根據(jù)前人的研究結(jié)果，亮氨酸對(duì)mTOR、ISR等信號(hào)通路的調(diào)節(jié)機(jī)制不同導(dǎo)致了不同動(dòng)物之間胰腺消化酶存在種間差異[11，25]，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究表明，亮氨酸能夠線性提升牛、羊、豬、雞體外胰腺組織消化酶的分泌和釋放，且亮氨酸對(duì)不同動(dòng)物體外胰腺組織消化酶的分泌存在種間差異。