褐藻寡糖及其鋅絡合物對暗紋東方鲀消化能力、血清生化指標及腸道菌群的影響

■張夢婷 李兆新 邢麗紅 段 蕊 張俊杰 鄭旭穎 朱盼盼 王學江

（1.中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島 266071；2.江蘇海洋大學，江蘇連云港 222005；3.五洲豐農(nóng)業(yè)科技有限公司，山東煙臺 264000）

暗紋東方鲀（Takifugu Obscurus），習稱河鲀，是一種洄游性魚類[1]，與鰣魚、刀魚并稱“長江三鮮”[2]。河鲀?nèi)馕峨槊溃瑺I養(yǎng)、藥用價值高[3]，深受消費者喜愛[4]。人工養(yǎng)殖技術日漸成熟，經(jīng)過合理馴食，可攝食人工配合飼料[5]。河鲀養(yǎng)殖業(yè)從沿海擴展到內(nèi)地，成為出口、提高漁民收入的重要經(jīng)濟魚類[6]。然而，人工養(yǎng)殖過程中易爆發(fā)細菌性疾病，產(chǎn)生寄生蟲，易導致死亡率上升、生長緩慢。

寡糖又稱低聚糖，是糖苷鍵聚合2～10 個單糖形成的，分為普通寡糖和功能性寡糖[7]。功能性寡糖具有抗菌、抗炎、抗病毒、提高機體免疫功能、降血壓血脂等多種功效，且能有效刺激腸道蠕動，促進腸道健康[8]。褐藻寡糖（Alginate oligosaccharide, AOS）是褐藻酸鈉降解產(chǎn)生的由甘露糖醛酸（M）和古洛糖醛酸（G）構成的一類陰離子寡糖[9-10]。褐藻酸鈉，又稱褐藻膠，存在于褐藻類植物細胞壁中[11]。褐藻寡糖安全無毒、穩(wěn)定，有助于植物生長、抗氧化等生物活性，還具有抗病毒、保護神經(jīng)等生理藥理功能[12]。在動物養(yǎng)殖中，褐藻寡糖具有生長調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)、抑菌作用。褐藻寡糖鋅為褐藻寡糖與金屬鋅的絡合物，鋅可提高免疫力，保證胃腸道菌群平衡、肝臟代謝，維持肝臟中產(chǎn)生的免疫因子的正常生長發(fā)育，維持機體免疫系統(tǒng)，提高抵抗力[13]。寡糖與鋅絡合可有效增強抗菌活性[14]。

本實驗在暗紋東方鲀飼料中分別添加褐藻寡糖、褐藻寡糖鋅，進行60 d 的養(yǎng)殖實驗，探究褐藻寡糖及其鋅絡合物對暗紋東方鲀的生長性能、腸道菌群、血清指標及消化酶活性的影響，為進一步研究功能性寡糖和拓寬其在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的應用、為開發(fā)天然經(jīng)濟的暗紋東方鲀綠色專用飼料添加劑提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以魚粉、小麥粉、豆粕等為原料，飼料原料經(jīng)粉碎過40 目篩，混合均勻后用顆粒飼料壓制機（合肥市穗聯(lián)機械有限公司）加工、烘干成顆粒飼料備用，配成基礎飼料，飼料配方及營養(yǎng)水平見表1。褐藻寡糖、褐藻寡糖鋅由山東省煙臺市五州豐農(nóng)業(yè)有限公司提供，褐藻寡糖由海帶（Laminaria japonica）細胞壁中海藻酸鈉經(jīng)酶降解制得，純度≥95%，聚合度2～7（具體指標見表2）。褐藻寡糖鋅是由褐藻寡糖與七水合硫酸鋅[鋅離子（Zn2＋）主要與藻酸原料中的羧基絡合]，參考GB 5009.14—2017 中火焰原子吸收光譜法測得鋅含量6.5%，以上均為該公司技術提供。由江蘇南通龍洋水產(chǎn)有限公司海安基地提供試驗暗紋東方鲀，試驗所用暗紋東方鲀初始體重為（38.6±1.2）g，體長（9.50±0.05）cm。

表1 基礎飼料成分配方及營養(yǎng)水平(%)

表2 褐藻寡糖的基礎指標

1.2 實驗儀器與試劑

KJELTEC2300全自動凱式定氮儀（瑞典福斯特卡托公司）；Sotex2055 全自動脂肪測定儀（瑞典福斯特卡托公司）；B180馬弗爐（Nabertherm公司）；UV-1780紫外分光光度計（島津公司（日本））；B-260恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠）；SpectraMax i3x 多功能酶標儀（美谷分子儀器有限公司）；IS-RDS3疊加式恒溫振蕩器（Crystal（美國））；SPX智能生化培養(yǎng)箱（寧波江南儀器廠）。

硫酸（分析純，南京化學試劑有限公司）；鹽酸（分析純，南京化學試劑有限公司）；無水乙醚（分析純，生工生物工程有限公司）；無水乙醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；氯化鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；Gene JET 膠回收試劑盒（Thermo Scientific 公司）；NEB Next?UltraTM DNA Library Prep S0it for Illumina 建庫試劑盒（New England Bolabs 公司）；Phusion High-Fidelity PCR Master Mixwith GC Buffer緩沖液（New England Bolabs公司）。

1.3 實驗設計

養(yǎng)殖實驗在位于江蘇省南通市海安市的中洋河豚莊園養(yǎng)殖基地進行。正式試驗前，挑選350尾健康無傷的暗紋東方鲀，暫養(yǎng)7 d，使之逐漸適應環(huán)境和配合飼料。正式實驗挑選270尾規(guī)格均一、體表無傷的暗紋東方鲀，隨機分3組（A、B、C組），每組3個平行養(yǎng)殖桶，每桶30尾，養(yǎng)殖桶直徑1.5 m，高0.8 m。A組為對照組，飼喂基礎日糧，B 組為添加0.23%褐藻寡糖組，C 組為添加0.23%褐藻寡糖鋅組（褐藻寡糖鋅含量為6.5%，根據(jù)暗紋東方鲀飼料中鋅含量為147.96 mg/kg計算[15]，褐藻寡糖鋅的添加量為0.23%）。養(yǎng)殖實驗為60 d，試驗結(jié)束，禁食24 h，計數(shù)稱重、取樣。

1.4 養(yǎng)殖管理

實驗期間，每天投喂兩次(8：00和16：00)，日投喂量為體質(zhì)量的3%～4%。實驗期間投喂量根據(jù)暗紋東方鲀體質(zhì)量和攝食情況適當加以調(diào)整。實驗期間養(yǎng)殖用水為地下水，水溫保持在（24±1）℃；每2天換水1/3，24 h連續(xù)充氣。養(yǎng)殖用水各項指標見表3。

表3 養(yǎng)殖用水指標

1.5 取樣與測定方法

1.5.1 生長活性評價

養(yǎng)殖試驗開始前、結(jié)束后，對每桶暗紋東方鲀魚體進行稱重，測定每桶暗紋東方鲀魚的體重和尾數(shù)，計算特定生長率、增重率。

式中：m1——試驗魚初重量（g）；

m2——試驗魚末重量（g）；

t——養(yǎng)殖時間（d）。

1.5.2 組織營養(yǎng)成分測定

養(yǎng)殖結(jié)束，禁食24 h，每桶取6尾魚，取肌肉冷凍保存，經(jīng)勻漿后參考GB5009.6—2016、GB5009.5—2016測定組織中粗脂肪、粗蛋白含量。

1.5.3 血清生化指標

養(yǎng)殖結(jié)束，禁食24 h，每桶取6尾魚，紗布擦干水分，一次性注射器尾靜脈采血，血樣于0～4 ℃的冰箱中靜置8 h待分層，4 000 r/min、4 ℃離心10 min，提取血清，-80 ℃冰箱中保存。超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、酸性磷酸酶（Acid phosphatase，ACP）、溶菌酶（Lysozyme，LZM)、過氧化物酶（Peroxidase，POD）酶活性均采用南京建成生物工程研究所有限公司試劑盒測定。

1.5.4 消化酶活性

養(yǎng)殖結(jié)束，禁食24 h，每桶取6 尾魚，取腸道，剝離附著的腸系膜，用去離子水清洗腸道內(nèi)容物。按1∶9 量取一定量的生理鹽水在冰水浴條件下勻漿，3 000 r/min離心10 min，吸取上清液以備用來分析其消化酶的活性。α-淀粉酶（α-Amylase，AMS）、脂肪酶（Lipase，LPS）、胃蛋白酶（Pepsint）、纖維素酶（Cellulase）酶活性均采用南京建成生物工程研究所有限公司試劑盒測定。

1.5.5 腸道微生物菌群

養(yǎng)殖結(jié)束，禁食24 h，每桶取1尾魚，取腸道，剝離附著的腸系膜，用去離子水清洗腸道內(nèi)容物，于-80 ℃保存。針對細菌的16S rRNA 基因V3～V4 區(qū)域的細菌進行擴增，利用引物341F 和806R，引物序列為，341F：5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3'，806R：5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'，擴增產(chǎn)物經(jīng)純化，通過高通量測序來分析腸道微生物群的多樣性[16]。

PCR擴增采用30 μL反應體系：2×Phusion Master Mix 15 μL，3 μL Primer，1 ng/μL g DNA 10 μL，2 μL H2O。反應程序：98 ℃預變性1 min；30 個循環(huán)包括（98 ℃10 s；50 ℃30 s；72 ℃30 s）；72 ℃，5min。

采用SDS 方法對樣本的基因組DNA 進行提取，根據(jù)PCR 產(chǎn)物濃度進行等濃度混樣，充分混勻后使用1×TAE 濃度2%的瓊脂糖電泳純化PCR 產(chǎn)物，使用Gene JET 膠回收試劑盒（Thermo Scientific）膠回收PCR 產(chǎn) 物，使 用NEB Next?UltraTM DNA Library Prep Kit for Illumina 建庫試劑盒（New England Bolabs）進行文庫的構建，構建好的文庫經(jīng)過Qubit 定量和文庫檢測，合格后使用Mi Seq 進行上機測序（北京諾禾致源科技股份有限公司）。

1.6 統(tǒng)計分析方法

實驗數(shù)據(jù)利用EXCEL 2010整理，采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，差異顯著水平為P＜0.05。統(tǒng)計數(shù)據(jù)以“平均值±標準差（X±SD）”的形式表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 生長活性評價

已有研究表明，水產(chǎn)動物飼料中添加功能性寡糖可提高營養(yǎng)吸收率，具有抑制病原菌、增殖有益菌、維持腸道健康的作用，從而促進生長[17]。寡糖影響蛋白質(zhì)的合成，調(diào)節(jié)代謝水平，達到促生長效果[18]。本實驗中經(jīng)過60 d的養(yǎng)殖，每組增加率、特定生長率均為：褐藻寡糖組＞基礎飼料組＞褐藻寡糖鋅組。與基礎飼料相比，添加0.23%褐藻寡糖組的增重率、特定生長率分別為43.44%、0.64%，高于對照組。說明褐藻寡糖有一定的促生長效果。而添加0.23%褐藻寡糖鋅組的增重率、特定生長率分別為37.02%、0.56%，低于對照組，均無顯著性差異。

閻桂玲等[19]發(fā)現(xiàn)褐藻寡糖對肉雞的促生長效果不顯著?；羝杂畹萚20]向大菱鲆日糧中補充褐藻寡糖（200、500、2 000 mg/kg 和5 000 mg/kg），發(fā)現(xiàn)生長差異不顯著（P＞0.05）。張藝等[21]的試驗也顯示，殼寡糖并不能顯著影響大菱鲆生長。寡糖增加了腸道上皮與營養(yǎng)分子之間的接觸面積，以增強營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，營養(yǎng)物質(zhì)可用性的改善將使能量有效轉(zhuǎn)移，能夠增強非特異性免疫力并促進生長。導致生長差異的因素極多，如魚體大小、環(huán)境等，水環(huán)境的pH、溶解氧、氨氮及養(yǎng)殖規(guī)模等都是潛在的作用因子。同時寡糖通過增加有益菌，抑制大腸桿菌、乳酸桿菌等埃希式桿菌屬的生長，調(diào)節(jié)腸道微生物狀態(tài)，促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，起到促生長效果[22]。而本實驗中褐藻寡糖對暗紋東方鲀的促生長效果不顯著，可能是飼料中寡糖水平過低，達不到引起變化的劑量[18]。而褐藻寡糖鋅對暗紋東方鲀的生長并無積極作用，其中鋅元素對魚類的作用機制待進一步考究。

2.2 組織營養(yǎng)成分測定

寡糖不被胃腸道消化，可被有益菌利用，調(diào)整腸道狀態(tài)，升高營養(yǎng)物質(zhì)的利用率。蛋白質(zhì)、脂肪等含量是評價魚肉品質(zhì)的重要指標，肉質(zhì)食用的體驗占據(jù)消費者對其評價的主要部分。對照組暗紋東方鲀肌肉粗蛋白含量為19.09%，飼料中添加0.23%褐藻寡糖對暗紋東方鲀肌肉蛋白含量無顯著影響（P＞0.05），可提高暗紋東方鲀魚肌肉中粗蛋白含量。對照組暗紋東方鲀肌肉粗脂肪含量為2.78%，飼料中添加0.23%褐藻寡糖鋅對暗紋東方鲀肌肉脂肪含量無顯著影響（P＞0.05），均降低暗紋東方鲀魚肌肉中脂肪含量。蔡勝昌等[23]發(fā)現(xiàn)殼寡糖對大菱鲆體成分無明顯效果，與本研究結(jié)果相似。

表4 生長指標(n=3)

表5 肌肉組織成分（%）

2.3 血清生化指標

研究顯示，功能性寡糖具有調(diào)節(jié)動物血清中生化指標、刺激非特異性免疫的功能[24]。魚類的血液是反應魚類代謝狀況、營養(yǎng)的重要部分，測定血液中相關免疫酶活性可有效評估魚類的生理健康狀況。超氧化物歧化酶能消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，催化過氧陰離子發(fā)生歧化反應，可以抗衰老、抗腫瘤、調(diào)節(jié)人體內(nèi)分泌系統(tǒng)，提高免疫力[25]。本試驗中褐藻寡糖組、褐藻寡糖鋅組的超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶活性與對照組相比無顯著性差異（P＞0.05）。過氧化物酶具有消除過氧化氫和酚類、胺類、醛類、苯類毒性的雙重作用，使毒性物質(zhì)失活，減少毒害[26]。本實驗中褐藻寡糖組、褐藻寡糖鋅組的過氧化物酶活性顯著低于對照組（P＜0.05）。溶菌酶分解致病菌細胞中多糖類，令細胞壁破裂，細菌細胞溶解，是免疫防御機制的重要部分，具有消炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等作用[27]。本實驗中與對照組相比，褐藻寡糖組、褐藻寡糖鋅組血清溶菌酶活性分別提高了201.761、51.235 U/mL，且存在顯著性差異（P＜0.05），褐藻寡糖在魚類血清特異性免疫能力方面研究較少。蘇鵬[28]在紅鰭東方鲀飼料中添加褐藻寡糖（0%、0.05%、0.1%、0.2%）飼養(yǎng)56 d 后，部分試驗組血清中LZM、POD、SOD 活性得到顯著提高（P＜0.05）。Miandare等[29]研究發(fā)現(xiàn)，0.5%，1%和2%低聚半乳糖均顯著升高銀鯽LZM活性（P＜0.05）。Ji等[30]在幼年中華絨螯蟹飼料中添加不同梯度甘露聚糖（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.6%），發(fā)現(xiàn)與對照組相比，喂食0.1%和0.3%甘露聚糖中華絨螯蟹腸道中的LZM 活性更高。這與本試驗結(jié)果相似。

2.4 消化酶活性

消化酶可催化分解食物，魚類消化酶的研究一直是魚類消化生理的重要研究內(nèi)容。消化酶活性的提高，可以促進魚類對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，從而提高魚的生長發(fā)育水平[31]。魚類腸道消化酶活性對生長至關重要，魚類消化酶活性高低受多種因素影響，飼料添加劑是影響魚類消化酶活性的其中因素之一[32-33]。

表6 褐藻寡糖及其鋅絡合物對暗紋東方鲀血清生化指標的影響

功能性寡糖可提高動物腸道消化酶活性，從而促進營養(yǎng)的消化吸收，進而促進生長。張詩雨等[34]研究表明，在飼料中添加不同含量的殼寡糖可不同程度提高腸道脂肪酶、胰蛋白酶活性及肝胰腺淀粉酶、脂肪酶活性。蘇鵬[28]在紅鰭東方鲀飼料中添加褐藻寡糖（0%、0.05%、0.1%和0.2%），發(fā)現(xiàn)紅鰭東方鲀腸道淀粉酶活性無顯著影響（P＞0.05），蛋白酶和脂肪酶活性增高，且差異顯著（P＜0.05）。本實驗發(fā)現(xiàn)，飼料中添加0.23%褐藻寡糖、褐藻寡糖鋅均可以提高河鲀腸道中的胃蛋白酶和纖維素酶活性，但和對照組相比無差異顯著性（P＞0.05）。0.23%褐藻寡糖提高了α-淀粉酶活性，0.23%褐藻寡糖鋅降低了α-淀粉酶活性，0.23%褐藻寡糖、褐藻寡糖鋅降低了脂肪酶活性，均無顯著性差異（P＞0.05）。褐藻寡糖提高腸道消化酶活性可能原因是寡糖被實驗魚攝取后經(jīng)口腔、胃，再進入腸道調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，推測腸內(nèi)的有益菌群在良好的微環(huán)境中更能發(fā)揮分泌淀粉酶的作用，對碳水化合物的利用率提高，從而使起到間接提高消化酶活性的作用[35]。潘金露[36]在大菱鲆飼料中補充褐藻寡糖（0%、0.02%、0.05%、0.20%和0.50%），結(jié)果顯示蛋白酶和淀粉酶活性變化不顯著（P＞0.05），添加量為0.02%和0.05%時，脂肪酶活性變化顯著（P＜0.05）。飼料中添加的酶活性變化不顯著可能是由于腸道消化酶摻雜胰液和胃液中消化酶成分[37]，而并無研究表明寡糖對胰液和胃液有明顯影響。同種魚中消化酶差異主要受飼料成分、環(huán)境干擾[38]。

表7 褐藻寡糖及其鋅絡合物對暗紋東方鲀腸道消化酶活性的影響

2.5 腸道微生物菌群

腸道菌群的改善和穩(wěn)定對魚類生長性能、免疫功能至關重要[39]。高通量技術作為一種新型方法，利用測序，探究菌群的類別及數(shù)目[40]，拓寬了測定腸道菌群的方向[41]。

2.5.1 腸道微生物群的多樣性和相似性比較

通過樣品測序序列計算各樣品中細菌多樣性指數(shù)。Coverage 指數(shù)表示樣品的測序深度，也表明樣品的覆蓋率，3 個處理組中的Coverage 指數(shù)均在0.99 以上，表明樣品中未被檢測到的可能性較低。

功能性寡糖可調(diào)節(jié)腸道功能，豐富腸道乳酸桿菌等有益菌，抑制大腸桿菌等病原菌生長，增加腸道中乳酸菌的數(shù)量、種類[22]。通過測序計算樣品中豐富度指數(shù)（表8），Shannon（Shannon-Wiener index）、Chao1和ACE（Abundance-based Coverage Estimator）是衡量菌落菌種均勻度、豐富度、多樣性的常見指標[42]，其中Shannon指數(shù)表明群落的豐富度、均勻度，數(shù)值越大說明種群多樣性越高，ACE 默認將序列量10 以下的OTU定義為稀有并單獨計算，從而估計群落中實際存在的物種數(shù)。Chao1、ACE 是估計樣品所含OTU（Operational Taxonomic Unit）數(shù)目的指數(shù)，指數(shù)越大說明樣本物種數(shù)越多、豐富度越高。結(jié)果顯示，對照組中的Chao1和ACE指數(shù)高于褐藻寡糖添加組，但差異不顯著（P＞0.05）。表明添加褐藻寡糖組、褐藻寡糖鋅試驗組的腸道細菌多樣性高于對照組。

表8 基于16SRNA基因序列的細菌多樣性指數(shù)

式中：Sobs—觀測到的OTU數(shù)；

n1—只有1條序列的OTU數(shù)目；

n2—只有2條序列的OTU數(shù)目。

對照組中與褐藻寡糖、褐藻寡糖鋅組中腸道菌群共有2 304 個OTU，對照組占80.21%，添加褐藻寡糖組占77.30%，添加褐藻寡糖鋅組占53.91%（見圖1）。各組微生物群的相似度高。說明添加褐藻寡糖、褐藻寡糖鋅后，沒有破壞腸道內(nèi)原有的土著菌群，實驗組檢測到的菌群種類單元更多。

圖1 腸道微生物群OTU分析

2.5.2 腸道微生物群的組成

菌群組成在Phylum（門）的水平上共鑒定出9 個門，以Proteobacteria（變形桿菌門）、Firmicutes（厚壁菌門）、Spirochaetota（螺旋體門）、Bacteroidetes（擬桿菌門）和Actinobacteria（放線菌門）等5 個菌門為主。變形菌門在對照組中相對比例最高，占對照組腸道菌群的25.4%。厚壁菌門的許多成員都是有益菌，其中乳酸桿菌是一種常見于酸奶和其他發(fā)酵乳制品中的益生菌[43]，這些微生物產(chǎn)生乙酸鹽、乳酸鹽和抗菌物質(zhì)，可防止病原體干擾健康[44]。A 組、B 組、C 組腸道中厚壁菌門相對豐度分別為0.172、0.191、0.225，飼料中添加0.23%褐藻寡糖、0.23%褐藻寡糖可提高腸道中厚壁菌門相對豐度。王發(fā)明等[45]在仔豬飼料中加入功能性寡糖，發(fā)現(xiàn)腸道中乳酸菌的數(shù)量、種類有效增加。放線菌門中的有益菌雙歧桿菌是人和動物腸道的重要生理菌群，有助于改善消化能力，提高免疫力。A組、B組、C組腸道中放線菌門相對豐度分別為0.118、0.124、0.095，飼料中添加0.23%褐藻寡糖可提高腸道中放線菌門相對豐度。Wang 等[46]發(fā)現(xiàn)果寡糖和大豆寡糖可提高豬源植物乳桿菌的存活率。

圖2 腸道微生物門水平上的物種相對豐度柱形圖

3 結(jié)論

飼料中添加褐藻寡糖投喂56 d 可提高暗紋東方鲀增重率、特定生長率，說明褐藻寡糖有一定的促生長效果，但不顯著（P＞0.05）。相比于對照組，褐藻寡糖組、褐藻寡糖鋅組暗紋東方鲀血清溶菌酶活力分別提高了201.761、51.235 U/mL，且存在顯著性差異（P＜0.05），褐藻寡糖、褐藻寡糖鋅對暗紋東方鲀的免疫能力具有促進作用，提高抵抗病原微生物的功能。飼料中添加褐藻寡糖和褐藻寡糖鋅均可以提高暗紋東方鲀腸道中的胃蛋白酶和纖維素酶活性，提高腸道消化能力，褐藻寡糖提高了α-淀粉酶活性，均無差異顯著性（P＞0.05）。飼料中添加褐藻寡糖、褐藻寡糖鋅可維持暗紋東方鲀腸道菌群，提高細菌多樣性。