魚腥草對(duì)加州鱸生長(zhǎng)、抗氧化的影響及其緩解高溫應(yīng)激作用研究

■薛小翠 李彩瑩 趙建華 許 紅 陳麗萍 徐奇友

（1.湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，水生動(dòng)物繁育與營(yíng)養(yǎng)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，浙江省水生生物資源養(yǎng)護(hù)與開(kāi)發(fā)技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江湖州 313000；2.湖州市農(nóng)業(yè)科技發(fā)展中心，浙江湖州 313000）

加州鱸學(xué)名大口黑鱸（Micropterus salmoides），鱸形目、太陽(yáng)魚科，是典型的肉食性淡水魚類，自20 世紀(jì)80 年代引進(jìn)我國(guó)廣東，成為具有地方特色的名特優(yōu)品種，具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、肉質(zhì)鮮緊實(shí)美、無(wú)肌間刺[1]，適應(yīng)能力強(qiáng)、養(yǎng)殖周期短、耐低溫等優(yōu)點(diǎn)，主要活動(dòng)在中下水層。隨著全球氣候變暖，養(yǎng)殖的水產(chǎn)動(dòng)物常處于不同的應(yīng)激狀態(tài)，魚類疾病在高溫季節(jié)頻發(fā)，特別是病毒病，目前沒(méi)有特效藥可以治療。因此，緩解熱應(yīng)激一直是研究的重點(diǎn)。近年來(lái)，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)學(xué)調(diào)控理論，提高水產(chǎn)動(dòng)物抗應(yīng)激能力，緩解外界環(huán)境帶來(lái)的脅迫影響越來(lái)越受到很多研究者的關(guān)注。

魚腥草（Houttuynia cordata）是自然界中普遍存在的多年草本植物，又名折耳根，可以清熱解毒，具有一定的生物活性和食用價(jià)值?，F(xiàn)有研究顯示，魚腥草化學(xué)成分包括揮發(fā)性油、黃酮類、生物堿類、萜類、甾醇類和有機(jī)酸類等，其主要藥效成分為揮發(fā)油、黃酮類化合物[2]。國(guó)家衛(wèi)生部確定魚腥草為“既是食品，又是藥品”的藥食兩用植物，還可作為飼料添加劑，具有很高的研究?jī)r(jià)值。魚腥草能促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，促進(jìn)動(dòng)物機(jī)體代謝、蛋白質(zhì)及酶的合成，被廣泛用于畜禽及水產(chǎn)動(dòng)物。研究表明，魚腥草有助于提高水產(chǎn)動(dòng)物的抗氧化能力及抗應(yīng)激能力[3]。目前，魚腥草應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖相關(guān)研究，主要集中在養(yǎng)殖水體[4-5]、魚體非特異性免疫能力[6-7]。但關(guān)于魚腥草對(duì)加州鱸等水產(chǎn)動(dòng)物在高溫應(yīng)激下的作用仍不清楚。因此，本試驗(yàn)擬采取高溫應(yīng)激方式，評(píng)估魚腥草在高溫下對(duì)加州鱸魚抗氧化能力及應(yīng)激方面的調(diào)控作用，對(duì)有效調(diào)節(jié)與緩解魚類的高溫應(yīng)激具有一定意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

魚腥草干根購(gòu)自某藥店，經(jīng)測(cè)定含粗蛋白25.24%、粗脂肪3.61%。經(jīng)粉碎機(jī)粉碎過(guò)60目篩得到原料用于試驗(yàn)。

加州鱸購(gòu)自湖州菱湖一加州鱸苗種場(chǎng)。選取健康、體重相同加州鱸幼魚80 尾，隨機(jī)分為2 組，每組8 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5 尾。對(duì)照組飼喂不添加魚腥草的基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組飼喂在基礎(chǔ)飼料中添加2%魚腥草的試驗(yàn)飼糧，飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（干基，%）

試驗(yàn)在湖州師范學(xué)院室內(nèi)溫控循環(huán)水養(yǎng)殖箱中進(jìn)行（40 cm×50 cm×60 cm），飼養(yǎng)50 d。養(yǎng)殖用水為曝氣后的自來(lái)水，試驗(yàn)期間水溫、溶解氧、pH、氨氮含量均在正常范圍內(nèi)，每天早晚（07：00、18：00）各喂一次，日投喂量為魚總體重的4%，根據(jù)加州鱸每天攝食和游動(dòng)情況，適當(dāng)調(diào)整投喂量，在投食1 h 后吸出剩余飼料，烘干計(jì)算重量，用于計(jì)算餌料系數(shù)，防止水質(zhì)惡化，在魚缸里放入遮蔽物，以減少互相殘殺，并記錄加州鱸的死亡數(shù)。

試驗(yàn)結(jié)束，稱取每組魚體重和記錄剩余數(shù)量，以計(jì)算加州鱸的成活率（SR）、增重率（WGR）和飼料系數(shù)（FCR）。

成活率（SR，%）=（試驗(yàn)?zāi)┪矓?shù)/試驗(yàn)初尾數(shù)）×100

增重率（WGR，%）=[（終末體重-初始體重）/初始體重]×100

飼料系數(shù)（FCR）=總耗料量/（終末體重+死亡體重-初始體重）

1.2 體成分

試驗(yàn)結(jié)束，每缸2尾每組16尾加州鱸，置于-20 ℃的冰箱中保存，用于測(cè)定加州鱸體成分。水分含量用105 ℃烘箱干燥法（GB/T 6435—2006/ISO6496:1999）測(cè)定，粗蛋白含量采用杜馬斯燃燒法測(cè)定，粗灰分采用550 ℃馬弗爐灼燒法（GB/T 6438—2007/ISO5984:2002）測(cè)定，粗脂肪含量采用索氏抽提法測(cè)定（GB/T 6443—2006/ISO6492:1999）測(cè)定。

1.3 生化和免疫指標(biāo)測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)束，每缸2 尾每組隨機(jī)取16 尾，使用MS-222 將魚麻醉，用毛巾擦干，靜脈取血收集到離心管中，然后進(jìn)行無(wú)菌解剖，離心管放置于4 ℃冰箱中靜置24 h，4 500 r/min 離心10 min，吸取上清液，于-25 ℃的冰箱中保存，用于血清免疫指標(biāo)的檢測(cè)。取肝胰腺，置冷凍管與液氮中保存，采樣結(jié)束后移至于-80 ℃超低溫冰箱保存，用于組織抗氧化酶等測(cè)定。

生化和非特異性免疫指標(biāo)主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、乳酸脫氫酶（LDH）活性，均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測(cè)定，相應(yīng)操作按照說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4 熱應(yīng)激處理

試驗(yàn)結(jié)束后各組取16 尾加州鱸，進(jìn)行熱應(yīng)激試驗(yàn)，使用加熱棒以2 ℃/h 將水溫升至38 ℃后，將魚持續(xù)浸浴10 h，在此期間加州鱸均能保持正常游動(dòng)，應(yīng)激期間不投喂飼料。高溫應(yīng)激后每組隨機(jī)取出16尾加州鱸，采樣處理與常溫環(huán)境試驗(yàn)相同。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2019和SPSS 20.0 軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析加州鱸生長(zhǎng)性能和體組成，P＜0.05 為差異顯著；采用two-way ANOVA 分析添加魚腥草和溫度是否存在交互作用，若交互作用顯著，則采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較，采用獨(dú)立性t檢驗(yàn)，用“*”表示P＜0.05為差異顯著，用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚腥草對(duì)加州鱸生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知，兩組之間加州鱸的成活率、增重率和飼料系數(shù)均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表2 魚腥草對(duì)加州鱸生長(zhǎng)性能、飼料利用和存活率的影響

2.2 魚腥草對(duì)加州鱸體組成的影響

由表3可知，養(yǎng)殖50 d后，試驗(yàn)組魚體水分、粗蛋白、灰分及粗脂肪含量與對(duì)照組均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表3 魚腥草對(duì)加州鱸體組成的影響（%）

2.3 魚腥草對(duì)加州鱸血清抗氧化和生化指標(biāo)的影響

由表4 可知，溫度和魚腥草含量對(duì)加州鱸血清SOD、MDA、GOT 和GPT 活 性 均 無(wú) 顯 著 影 響（P＞0.05），SOD、MDA 存在顯著的交互作用（P＜0.05），GPT、GOT 不存在交互作用（P＞0.05）。魚腥草含量對(duì)LDH 有顯著影響（P＜0.05），且存在交互作用（P＜0.05）。血清抗氧化和生化指標(biāo)變化情況見(jiàn)圖1。獨(dú)立性t檢驗(yàn)表明，未添加魚腥草高溫應(yīng)激后SOD、MDA 活性顯著降低（P＜0.05），添加魚腥草后SOD、GOT 活性顯著升高（P＜0.05），常溫下，添加魚腥草后MDA 活性顯著降低（P＜0.05），其余各組均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表4 魚腥草對(duì)加州鱸血清抗氧化和生化指標(biāo)的影響

圖1 魚腥草對(duì)加州鱸抗氧化和生化指標(biāo)的影響

2.4 魚腥草對(duì)加州鱸肝胰腺抗氧化和生化指標(biāo)的影響

由表5 可知，溫度和魚腥草對(duì)肝胰腺SOD 和GPT 活性均無(wú)顯著影響（P＞0.05），且兩者不存在顯著的交互作用（P＞0.05）。溫度和魚腥草對(duì)GOT 活性均顯著影響（P＜0.05），但不存在顯著的交互作用（P＞0.05）。肝胰腺抗氧化和生化指標(biāo)變化情況見(jiàn)圖2，獨(dú)立性t檢驗(yàn)表明，未添加魚腥草高溫應(yīng)激后SOD 活性顯著降低（P＜0.05），添加魚腥草高溫應(yīng)激后GPT 活性顯著降低（P＜0.05），其余各組均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

圖2 魚腥草對(duì)加州鱸肝胰腺抗氧化和生化指標(biāo)的影響

表5 魚腥草對(duì)加州鱸肝胰腺抗氧化和生化指標(biāo)的影響

3 討論

3.1 魚腥草對(duì)加州鱸生長(zhǎng)性能的影響

魚腥草中除含有抗菌、免疫活性物質(zhì)以外，還含生物堿、有機(jī)酸、多糖、多醇類等促進(jìn)機(jī)體代謝、提高飼料轉(zhuǎn)化率、抗應(yīng)激等作用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，被廣泛用于畜禽及水產(chǎn)類養(yǎng)殖。研究表明，在飼料中添加2%魚腥草可促進(jìn)肉雞[8]的生長(zhǎng)，陸牡龍等[9]在日糧中添加菊粉和魚腥草，增加了雛雞的回腸長(zhǎng)度，使日糧中營(yíng)養(yǎng)成分在體內(nèi)吸收更完全，從而加快其生長(zhǎng)。飼糧中添加400～1 600 g/t魚腥草提取物提高了巴西龜（Trachemys scriptaelegans）的增重率[10]，姚宇等[11]發(fā)現(xiàn)添加8～64 g/t 魚腥草提取物可提高肉雞的增重，添加0.5%的魚腥草、大黃等復(fù)方藥用植物添加劑對(duì)施氏鱘（Acipenser schrenckiiBrandt）的攝食量、增重率有顯著的提高效果[12]，添加2%魚腥草顯著提高了草魚增重率[13]。而本研究中，飼料中添加2%的魚腥草對(duì)加州鱸的增重率未產(chǎn)生影響，這與王荻等[14]報(bào)道中采用口灌魚腥草和當(dāng)歸對(duì)施氏鱘的生長(zhǎng)沒(méi)有促進(jìn)作用研究結(jié)果一致。此外，魚腥草添加水平過(guò)低或過(guò)高都會(huì)使試驗(yàn)魚生長(zhǎng)性能受到影響，張鱗等[15]證明了這一點(diǎn)。

3.2 魚腥草對(duì)加州鱸抗氧化指標(biāo)的影響

SOD是機(jī)體對(duì)抗自由基的酶促體系，能有效清除自由基，其活性變化可以間接反映動(dòng)物體內(nèi)自由基平衡狀態(tài)[16]。有研究證明，高溫應(yīng)激24 h 后，異育銀鯽（Carassiusauratus gibelio）血清中SOD活性下降[17]。本試驗(yàn)中，飼料中沒(méi)有添加魚腥草，當(dāng)遇到高溫脅迫時(shí)，SOD 活性顯著降低，飼喂魚腥草后，當(dāng)遇到高溫應(yīng)激時(shí)，SOD 顯著升高，表明添加魚腥草能夠通過(guò)增強(qiáng)SOD 活性提高加州鱸的抗熱應(yīng)激能力，且交互作用顯著，常溫條件下添加魚腥草SOD 活性降低，高溫情況下添加魚腥草能夠顯著提高SOD活性，這可能是魚腥草中含有生物堿、黃酮類、揮發(fā)油等多種生物活性物質(zhì)能有效清除自由基，提高機(jī)體免疫力[18]。譚娟等[13]報(bào)道，在飼料中添加一定濃度的魚腥草并投喂適宜時(shí)間草魚幼魚的SOD活性升高。

MDA 是反映機(jī)體抗應(yīng)激能力的參數(shù)之一，能反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化速率及機(jī)體過(guò)氧化損傷程度，當(dāng)機(jī)體氧化的自由基不能及時(shí)清除時(shí)，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生過(guò)氧化物，造成細(xì)胞膜損傷。本試驗(yàn)中，飼料中沒(méi)有添加魚腥草，當(dāng)遇到高溫脅迫時(shí)，MDA 活性顯著降低，飼喂魚腥草后，高溫應(yīng)激時(shí)，MDA 顯著升高，表明添加魚腥草能夠通過(guò)增強(qiáng)MDA活性提高鱸魚的抗熱應(yīng)激能力，這與王荻等[19]熱應(yīng)激施氏鱘血清MDA含量顯著升高結(jié)果一致。推測(cè)可能是魚腥草中揮發(fā)油在高溫下轉(zhuǎn)化為MDA；或者魚腥草中揮發(fā)油不在適宜范圍內(nèi)，抗氧化效果不顯著[20]；也可能是由于加州鱸是肉食性動(dòng)物，其對(duì)魚腥草的消化吸收能力不如畜禽動(dòng)物[21]，且對(duì)魚腥草的加工工藝要求更高，這有待將來(lái)進(jìn)一步研究。

3.3 魚腥草對(duì)加州鱸生化指標(biāo)的影響

血液生化指標(biāo)變化情況可以作為評(píng)價(jià)機(jī)體健康水平和營(yíng)養(yǎng)成分代謝的依據(jù)之一。GOT 和GPT 主要存在于肝臟和腎臟等組織中，其活性變化可以作為水產(chǎn)動(dòng)物肝功能健康指標(biāo)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)之一，對(duì)肝臟的代謝具有重要作用，也可以用來(lái)評(píng)價(jià)藥物的毒副作用，GOT和GPT在血液中活性恒定且較低，當(dāng)組織細(xì)胞受損時(shí)，其從肝臟細(xì)胞中流入血液，從而使血液中酶活性升高[22]。本研究中，飼料中沒(méi)有添加魚腥草，當(dāng)遇到高溫脅迫時(shí)，GPT、GOP活性無(wú)顯著變化，飼喂魚腥草后，高溫應(yīng)激時(shí)，GPT 無(wú)明顯變化，GOT 顯著上升，說(shuō)明添加2%魚腥草對(duì)肝臟等組織代謝功能產(chǎn)生不利影響。目前尚未有魚腥草對(duì)加州鱸熱應(yīng)激影響的研究報(bào)道，但相似的研究表明，在飼料中分別添加3%的刺五加、蒲公英、枸杞子、金銀花和大蒜單方中草藥飼喂鯉（Cyprinus carpio），各組GOT 活性差異不顯著[23]，中草藥對(duì)烏雞高溫應(yīng)激后各組血清GPT 活性無(wú)顯著變化[24]，飼料中添加0.5%和1%的茯苓、白芍、魚腥草及大黃復(fù)方藥用植物添加劑對(duì)施氏鱘GOT、GPT 和LDH 活性無(wú)顯著影響[11]，這些研究結(jié)果與本試驗(yàn)相似。

LDH是水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)參與糖代謝重要的酶之一，該酶活性的升高與無(wú)氧酵解的加強(qiáng)息息相關(guān)。當(dāng)水產(chǎn)動(dòng)物處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，該酶活性會(huì)升高，有相關(guān)報(bào)道，在飼料中添加白藜蘆醇使熱應(yīng)激條件下黃羽肉雞的血清LDH活性顯著下降[25]。而本研究中，LDH活性無(wú)顯著變化，表明添加魚腥草在受到高溫應(yīng)激后會(huì)在一定程度緩解加州鱸高溫應(yīng)激，維持機(jī)體正常生命活動(dòng)，變化不顯著可能是因?yàn)榧又蓣|在熱應(yīng)激過(guò)程中機(jī)體的糖代謝與家禽不同有關(guān)，加州鱸高溫應(yīng)激后生化指標(biāo)變化機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

添加2%魚腥草對(duì)加州鱸生長(zhǎng)性能和體組成沒(méi)有顯著影響。從SOD 和LDH 指標(biāo)看，添加2%魚腥草可以緩解加州鱸熱應(yīng)激。