重組人糜蛋白酶表達、純化和性質研究

劉曉，李素霞

（生物反應器工程國家重點實驗室，華東理工大學，上海 200237）

重組人糜蛋白酶表達、純化和性質研究

劉曉，李素霞Δ

（生物反應器工程國家重點實驗室，華東理工大學，上海 200237）

目的研究重組人糜蛋白酶（human Chymotrypsin）在大腸桿菌中的表達、純化和部分性質。方法大腸桿菌BL 21（DE 3）高效表達目的蛋白，表達形式為包涵體，復性后的重組蛋白，通過陽離子交換層析純化，對純化蛋白進行性質研究。結果SDS-PAGE分析重組蛋白酶原大小約為30 KD，CM-FF陽離子交換層析純化后最終活性回收率為93．7%，重組酶在pH 3～pH5范圍內穩(wěn)定，溫度穩(wěn)定性好，以N-苯甲酰-L-酪氨酸乙酯(n-benzoyl-ltyrosine ethyl ester,BTEE)作為底物時的Km值為0．067 mmol/L，紫外最大吸收波長為281 nm。結論重組人糜蛋白酶工程菌成功表達目的蛋白，并通過復性、激活后獲得了活性蛋白，建立了生產(chǎn)該酶的方法。

重組人糜蛋白酶；表達；性質

采用基因工程方法表達重組糜蛋白酶不僅能從根源上解決這一問題，而且生產(chǎn)過程簡潔有效，生產(chǎn)工藝穩(wěn)定易控制，通過大腸桿菌高密度發(fā)酵和包涵體復性大大提高了重組酶的產(chǎn)率，改善了純化工藝，因此利用基因工程技術研究和生產(chǎn)重組糜蛋白酶具有非常重要的意義。

1 材料與方法

1.1 質粒，菌株和試劑 含有重組人糜蛋白酶基因的質粒pET-hCT和菌株BL 21(DE 3)由本實驗室保存；重組胰蛋白酶購自上海雅心生物技術有限公司；蛋白低分子量標準（Takara）；BTEE，IPTG（Sigma）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 重組人糜蛋白酶原表達與鑒定 含有重組質粒pET-hCT的BL 21(DE 3)菌株，涂布于含有50 μg/mL卡那霉素抗性的LB（0.1%蛋白胨，0.1%NaCl，0.05%酵母粉）平板，倒置培養(yǎng)14～16 h。挑取菌落于相同濃度抗性的30 mL LB液體培養(yǎng)基，37℃，200 r/min培養(yǎng)12 h后，以2%接種量轉接二級瓶，當菌密度OD 600達0.6～0.8時，IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）誘導4h，離心收集菌體，超聲破碎后SDS-PAGE[7]分析表達情況。

1.3 重組人糜蛋白酶的制備 按菌體：緩沖液約為1g：15 mL的比例懸浮菌體于50 mM Tris-HCl pH 8.0緩沖液中，超聲破碎得上清和包涵體。將包涵體重懸于洗滌液（0.1%Triton，2 M尿素），洗滌后的包涵體溶解于8M尿素中，稀釋復性[8]，用重組胰蛋白酶激活[9]。

使用3 cm×30 cm層析柱，按總蛋白量確定適合的CM-FF陽離子交換樹脂裝柱量。配制20 mM NaAC-HAC pH 4.2緩沖液進行平衡，上柱。上樣后用上述平衡液洗滌至基線，然后用不同濃度NaCl進行梯度洗脫。洗脫后，測定活性，繪制洗脫曲線，并用SDS-PAGE鑒定純度。合并洗脫液，透析后，凍干，凍干粉于-20℃保存。

1.4 活性測定 測活底物為BTEE，酶活力單位定義[10-11]為：在25℃，pH 7.8的條件下，1個活力單位糜蛋白酶每分鐘能水解1μmol BTEE。測活方法為：3.0 mL 25℃底物溶液中加入10μL酶液，在256 nm下每30 s記錄1個吸光值A256，使每分鐘的變化值ΔA在0.015～0.020之間為宜，空白對照為1 mM HCl。

1.5 重組人糜蛋白酶性質研究

1.5.1 pH穩(wěn)定性 取純酶液，分別在pH 3～pH 11緩沖液中稀釋10倍，于25℃下溫育2 h和46 h，取樣測定酶活，以水浴前酶液的初始活性作為100%，計算活性殘余率。緩沖液依次為 NaAc-HAc(pH 3～pH 6)，Tris-HCl (pH 7～pH 8)，Gly-NaOH (pH 9～pH 11)，所有緩沖液均25℃配制。

1.5.2 溫度穩(wěn)定性 取1 mg/mL溶解于1mM HCl中的純酶液，分別置于25℃、37℃水浴中溫育，每隔一定時間測定酶活，以水浴前酶液的初始活性作為100%計算活性殘余率。

1.5.3 反復凍融穩(wěn)定性 取1 mg/mL純酶液，置于-20℃下反復凍融。測定每次凍融后的酶活，以未凍融酶液的活力為100%，計算活性殘余率。

1.5.4 Km和Vmax測定 以測活緩沖液（80 mM Tris HCl pH 7.8含0.05 mol/L Ca2+）溶解不同濃度BTEE底物，[S]/mol/L：1×10-5、2×10-5、5×10-5、1×10-4，1.5×10-4，2×10-4。在256 nm波長處分別測定每個底物濃度下反應2 min時的A256并按下列公式計算酶促反應速度v（μmol/min）：

式中v為加入糜蛋白酶的體積（mL），df為稀釋因子，0.964為BTEE在256 nm下摩爾吸光系數(shù)。

1.5.5 紫外吸收光譜 將0.5 mg/mL重組糜蛋白酶凍干粉溶解于超純水中，在光路1 cm，波長190～300 nm范圍內進行紫外光譜掃描，確定其特征吸收波長。

2 實驗結果

2.1 重組人糜蛋白酶的制備 含重組質粒pET-28 ahCTRB1的E.coliBL 21(DE 3)重組菌的表達結果見SDSPAGE電泳分析（圖1A）。誘導后，在30 KD附近有表達條帶，與預期結果一致，超聲破碎，離心后結果顯示上清中基本沒有目的條帶，因此重組蛋白主要以包涵體形式表達。經(jīng)重組胰蛋白酶和糜蛋白酶自身的切割，酶原被激活并釋放了活性酶，活性酶的大小明顯小于酶原形式（圖1B）。

圖1 重組人糜蛋白酶原表達和激活（A）酶原表達鑒定：M. 低分子量蛋白marker；1. 誘導前；2. IPTG誘導后3.誘導后上清；4. 誘導后包涵體；（B）重組人糜蛋白酶原激活：M. 低分子量蛋白marker；1. 激活前；2. 胰蛋白酶激活后Fig.1 Expression and activation of human chymotrypsinogen(A)Expression of chymotrypsinogen： M. Low molecular weight protein maker； 1. Before induction； 2. After induction with IPTG；3. Supernatant after induction； 4. Inclusion body after induction；(B)Activation of chymotrypsinogen： M. Low molecular weight protein maker；1. Before activation； 2. After activation with trypsin

重組人糜蛋白酶包涵體經(jīng)復性和酶原激活后的活性酶，用20 mmol/L NaAC-HAC pH 4.2和5mmol/L CaCl2透析緩沖液，在酸性條件下透析，隨后進行CM-FF陽離子交換層析，重組蛋白主要在200 mmol/L NaCl濃度下被洗脫，電泳結果如圖2所示。主條帶在29 KD附近，但在14.3～20.1 KD之間也有明顯條帶，分析該條帶為在還原電泳過程中，由于二硫鍵被還原而形成的糜蛋白酶第二條肽鏈（14.4 KD）。洗脫曲線見圖2和表1。

圖2 重組人糜蛋白酶純化（A）洗脫曲線；（B）純化結果SDS-PAGE鑒定：M. 低分子量蛋白marker；1. 流穿液；2～8 試管. 200 mM NaCl 洗脫液Fig.2 CM purification of recombinant human chymotrypsin(A)Elution curve of CM-FF； (B) SDS-PAGE detection of purification：M.Low molecular weight protein maker； 1. Flow solution； 2～8 tuber. 3 to 9 of 200 mM NaCl elution

表1 重組人糜蛋白酶CM-FF純化表Tab.1 The CM puri fi cation table of recombinant humanchymotrypsin

2.2 重組人糜蛋白酶性質研究 pH穩(wěn)定研究（見圖3）發(fā)現(xiàn)，重組人糜蛋白酶在酸性pH條件下（pH 3～5）活性相對較穩(wěn)定，酶液在該條件下溫育46 h任保持約90%的活性，因此在選擇純化，透析，保持的方法時應選擇酸性條件，例如陽離子交換層析CM柱選擇pH 4～5，透析時采用20 mmol/LNaAC-HAC pH 4.2。而相對于pH 8～pH9的條件，重組糜蛋白酶在強堿性條件（pH 10～11）下的殘余活性較高，說明該酶具有一定的堿耐受性。

圖3 重組人糜蛋白酶pH穩(wěn)定性Fig.3 The pH stability of recombinant human chymotrypsin

溫度穩(wěn)定性研究（見圖4）發(fā)現(xiàn)重組糜蛋白酶的熱穩(wěn)定性好，25℃下溫育7 h能保留80%酶活性，因此該酶的純化不需要在4℃下進行。37℃穩(wěn)定性實驗模擬人體內溫度，此時糜蛋白酶的半衰期為7h左右。長期放置后，酶活力還是會有很大損失，必須注意酶的保存方法。

圖4 重組人糜蛋白酶溫度穩(wěn)定性Fig.4 The temperature stability of recombinant human chymotrypsin

反復凍融穩(wěn)定性研究（見圖5）發(fā)現(xiàn)重組糜蛋白酶凍融一次后酶活力能保持100%，但從第二次凍融開始活力有明顯下降，根據(jù)本實驗結果能有效提高酶使用次數(shù)和應用范圍。

圖5 重組人糜蛋白酶反復凍融穩(wěn)定性Fig.5 The Freezing stability of recombinant human chymotrypsin

重組糜蛋白酶Km和Vmax值測定結果（見圖5），按雙倒數(shù)作圖法，以1/[S]為橫坐標，1/v為縱坐標作圖，經(jīng)線性擬合，其曲線方程為y=0.007 x+0.104（R2=0.994）。得到直線的斜率在縱軸上的截距為1/V，橫軸上的截距為-1/Km，可求得Km值為0.067 mmol/L，Vmax值為 9.6 μmol/min。Km值受 pH和溫度的影響，一般只與酶的性質有關，與酶的濃度無關。不同酶有不同的Km值，Km值可以反映酶與底物的結合效率，Km值越大說明底物與酶結合率越低，Km值越小說明酶與底物的結合率越強。

圖6 重組人糜蛋白酶Km和Vmax值測定Fig.6 Measurement of Km and Vmax

由于190～250 nm是蛋白分子的肽鍵紫外光譜吸收，最大吸收波長為228 nm因此不能作為蛋白的特征吸收峰，所以實驗波長范圍設定為240～300 nm，在此范圍內有一個吸收峰。如圖7和8所示，最大吸收波長為281 nm，該處的紫外吸收是一些芳香族氨基酸殘基的吸收，并且重組酶與天然酶的最大吸收峰基本一致。

圖7 重組人糜蛋白酶紫外吸收光譜Fig.7 Ultraviolet absorption spectrum assay of recombinant human chymotrypsin

圖8 天然糜蛋白酶紫外吸收光譜Fig.8 Ultraviolet absorption spectrum assay of native chymotrypsin

3 討論

大腸桿菌表達獲得的蛋白通常難以獲得其天然構象，而是生成不可溶的包涵體，Haibo Wang，Duoduo Yuan等[12]在大腸桿菌中表達了豬源糜蛋白酶C，并進行了復性和純化。本研究通過原核表達載體成功表達了人源糜蛋白酶，表達形式為包涵體，經(jīng)包涵體復性和酶原激活，得到了具有較高活性的重組蛋白。理想的純化方法是提高最終糜蛋白酶活力的主要保證，常用的糜蛋白酶純化方法有離子交換法和親和色譜法。Rafik Balti等[13]采用Phenyl-Sepharose，Sephadex G-200，DEAE 陰離子交換柱層析對烏賊糜蛋白酶進行純化，這些純化方法主要是建立在天然糜蛋白酶含有其他雜蛋白酶的基礎上，而對于通過復性方法得到的重組蛋白酶純度已相對較高，大大降低了純化的難度[14]。本實驗采用CM陽離子交換層析純化激活后的酶，活性回收率達到93.7%。

從pH、溫度和反復凍融三方面基本討論了重組人糜蛋白酶的性質：其pH穩(wěn)定范圍為3～5，這主要是因為在酸性條件下酶分子的活性中心被掩蓋，使酶分子維持相對穩(wěn)定的狀態(tài)，這一性質與同一家族的重組胰蛋白酶[15]的性質相似，而與胰蛋白酶性質不同的是重組糜蛋白酶在強堿性條件（pH 10～pH 11）下溫育46 h能保持40%～60%殘余活性，說明該酶具有一定的堿耐受性。25℃下重組酶比較穩(wěn)定，并且反復凍融需要控制在盡量少的次數(shù)內，這些研究為該酶的純化、使用和保存提供了參考依據(jù)。Km、Vmax值測定，和紫外吸收光譜分析主要從重組酶的動力學和紫外光譜方面分析了其性質。本實驗結合不同側面探討了重組人糜蛋白酶的表達，純化和基本性質，為今后的進一步研究提供了有效的參考。

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Study on the expression,puri fi cation and properties of recombinant human chymotrypsin

LIU Xiao，LI Su-xiaΔ

（State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China）

ObjectiveTo study the prokaryotic expression, purification and properties of recombinant human Chymotrypsin.MethodsThe protein was highly expressed in E.coliBL 21 (DE 3) as inclusion body. After refolding and activated with trypsin, the activated protein was obtained and purified with ion-exchange chromatography(CM-FF), some properties of the recombinant human chymotrypsin was investigated.ResultsThe molecular weight of chymotrypsinogen was about 30 KD in SDS-PAGE, total activity recovery rate of CM-FF purification was 93.7%. The recombinant chymotrypsin kept stable from pH 3 to pH 5, and owned good temperature stability. Km was 0.067 mmol/L with BTEE as a substrate.The UV maximum absorption wavelength was 281 nm.Conculsion The recombinant human enzyme was expressed successfully, and a feasible production method to get a high activity of the recombinant human chymotrypsin was established.

recombinant human chymotrypsin; expression; purification; properties

Q 556+．9

A

1005-1678(2014)02-0071-04

糜蛋白酶（chymotrypsin）也叫胰凝乳蛋白酶，屬于絲氨酸蛋白酶家族，能專一性水解芳香族氨基酸羧基形成的肽鍵[1]。糜蛋白酶原由胰腺分泌，隨胰液進入小腸后，在Arg 15和Ile 16之間（按Bovine chymotrypsin A序列編號）被胰蛋白酶切為通過二硫鍵連接的兩部分，隨后糜蛋白酶在Leu 13酶切去短肽Ser 14-Arg 15，在Tyr 146和Asn 148酶切去短肽Tyr 147-Asn 148，形成由二硫鍵相連的三條多肽鏈并具有生物活性[2-3]。本文主要研究重組人糜蛋白酶（human Chymotrypsin）的表達，純化和部分性質。

糜蛋白酶與胰蛋白酶相似，能迅速分解變性蛋白質，因此在臨床上可用于皮膚傷口或局部炎癥[4]。目前，糜蛋白酶在臨床上的應用主要為治療腱鞘囊腫、皮膚慢性潰瘍、慢性咽炎、皰疹性口炎等，由此可知該酶的主要功能是提高組織通透性、抑制炎癥反應、溶解壞死組織等[5]作用。其臨床給藥方式主要有肌肉注射、灌注、噴霧和局部外敷，而目前臨床用糜蛋白酶系自?；蜇i胰中提取，異源蛋白進入人體后可能會引起免疫反應[6]，增加用藥風險。

劉曉，女，碩士，研究方向：生物化學與分子生物學研究，E-mail：liuxiao 4209@gmail.com；李素霞，通信作者，女,博士，副教授，研究方向：生物化學與分子生物學，酶與酶工程，重組蛋白的變性與復性機理研究，E-mail：lisuxia@ecust.edu.cn。