惠州地區(qū)亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性特征分析

鐘澤艷 陳迪娜 楊坤祥 陳劍虹

亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）基因位于1p36.3，是葉酸代謝的關(guān)鍵酶，可將5，10?亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)化為具有生物學(xué)功能的5?甲基四氫葉酸，維持DNA 的穩(wěn)定。大量研究表明，葉酸對孕婦尤其重要，葉酸攝入不足或不能被人體有效利用是導(dǎo)致新生兒出生缺陷和不良妊娠結(jié)局的主要原因［1?2］。葉酸在人體不能合成，受遺傳、環(huán)境、生活習(xí)慣影響，我國人群葉酸缺乏率很高，現(xiàn)葉酸已被列為我國重大公共衛(wèi)生服務(wù)項目之一。國內(nèi)外多項研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR基因存在多個基因多態(tài)性位點，其中MTHFR基因C677T（rs1801133，Ala222Val）是最常見的突變位點，其突變使MTHFR活性降低，影響葉酸正常代謝，而且不同基因型的人群代謝能力不同，補(bǔ)充的量也不一樣［3?4］。本研究通過分析惠州地區(qū)育齡夫婦MTHFR基因C677T 位點多態(tài)性分布情況，為本地區(qū)育齡婦女根據(jù)自己的遺傳體質(zhì)，有效地補(bǔ)充葉酸量提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年6月至2019年12月到本院產(chǎn)前診斷中心就診的孕前或孕期行優(yōu)生健康檢查育齡夫婦的樣本共765 例。年齡為17～47 歲，平均年齡（29.56±4.96）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥16 歲（刑法上16 歲開始承擔(dān)完全的刑事責(zé)任）；②就診的孕前或孕期行優(yōu)生健康檢查育齡夫婦，其中包括有過神經(jīng)管畸形妊娠史或不明原因的流產(chǎn)、早產(chǎn)、畸形兒童或產(chǎn)死的女性。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有遺傳疾病或其他機(jī)體異常者。本研究獲得本院倫理委員會批準(zhǔn)，研究對象均知情同意。

1.2 主要儀器與試劑

采用Lab?Aid 824 全自動核酸提取儀（致善生物zeesan）、5430R 臺式離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）、7500 實時熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）、Lab?Aid 824 核酸提取試劑盒（廈門致善生物科技股份有限公司）、亞甲基四氫葉酸還原酶基因677C/T 檢測試劑盒（PCR?熒光探針法，深圳奧薩制藥有限公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 樣本采集

對受檢者進(jìn)行詳細(xì)的病史調(diào)查，內(nèi)容包括疾病史、生育史、家族史、飲食情況、藥物服用情況、行為習(xí)慣等。同時，抽取外周靜脈血2 mL，使用乙二胺四乙酸二鉀（EDTA?K2）抗凝，樣本于4～8℃保存，一周內(nèi)完成檢測。

1.3.2 DNA 提取和基因多態(tài)性檢測

采用Lab?Aid 824 全自動核酸提取儀和核酸提取試劑盒提取外周血基因組DNA，提取量為200 μL EDTA?K2抗凝外周血。采用廠家原裝配套試劑和耗材，均嚴(yán)格按照儀器及試劑說明書操作。獲得的DNA 應(yīng)用深圳奧薩制藥有限公司的亞甲基四氫葉酸還原酶基因677C/T 檢測試劑盒（PCR?熒光探針法）進(jìn)行基因檢測，按照操作說明書進(jìn)行實驗操作和結(jié)果判斷。根據(jù)李杰等［5］的研究報道，MTHFR基因C677T 位點多態(tài)性分布與年齡及地域有相關(guān)性，參考之將年齡以30 歲為分界點，把基因型和等位基因頻率的分布分為兩組。

1.3.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析；用Hardy?Weinberg 遺傳平衡規(guī)律檢驗人群的分布特征。計數(shù)資料以n（%）表示，組間比較采用x2檢驗；P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTHFR 基因C677T 位點的基因型多態(tài)性結(jié)果

對惠州地區(qū)育齡夫婦MTHFR基因C677T 位點的基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行Hardy?Weinberg 遺傳平衡檢驗，MTHFR基因C677T 位點符合Hardy?Weinberg遺傳平衡，納入對象有群體代表性（P=0.644）。檢出野生型（CC）、雜合突變型（CT）和純合突變型（TT）分別占54.12%（414 例）、38.43%（294 例）、7.45%（57 例）。見表1。

表1 惠州地區(qū)育齡夫婦MTHFR 基因C677T 位點的基因型分布［n（%）］Table 1 Genotype distribution of MTHFR C677T in couples of childbearing age in Huizhou［n（%）］

2.2 MTHFR 基因C677T 位點的等位基因頻率分布結(jié)果

MTHFR基因C677T 位點的基因型頻率中，突變T 基因頻率為26.67%。見表2。

表2 不同種族人群MTHFR 基因C677T 的等位基因頻數(shù)與頻率分布［n（%）］Table 2 Allele frequency and frequency distribution of MTHFR C677T in different races［n（%）］

3 討論

葉酸屬于B 族維生素，參與維持細(xì)胞內(nèi)正常甲基化和基因組穩(wěn)定性，孕期缺乏會嚴(yán)重危害孕婦及胎兒健康。孕期葉酸缺乏不僅會造成新生兒神經(jīng)管缺陷、唇腭裂、肛門閉鎖、唐氏綜合征和先天性心臟病等新生兒出生缺陷病，也是引起孕婦妊娠期貧血、高血壓、自發(fā)性流產(chǎn)和早產(chǎn)的原因之一［6?7］。目前，葉酸增補(bǔ)已納入我國出生缺陷項目中一級預(yù)防的主要措施之一，且在2017年《圍受孕期增補(bǔ)葉酸預(yù)防神經(jīng)管缺陷指南》中明確指出，懷孕前三個月和孕期的前三個月每天服用一定量的葉酸來降低新生兒出生缺陷率［1］。因此，MTHFR基因C677T 的基因多態(tài)性檢測，適用于育齡夫婦生育前預(yù)防性檢測，及早發(fā)現(xiàn)圍孕期婦女對葉酸的吸收利用水平，實現(xiàn)個性化增補(bǔ)葉酸，達(dá)到優(yōu)生優(yōu)育。

本研究收集惠州地區(qū)育齡夫婦樣本中，不同年齡段的基因型和基因頻率分布與總體的分布特征一致，均以野生型為主，依次為雜合突變型和純合突變型，三者的占比約為7∶5∶1。研究結(jié)果符合千人基因組數(shù)據(jù)庫（http：//asia.ensembl.org/in?dex.html）中東亞人群和中國南方漢人群的分布規(guī)律，基因型和等位基因頻率結(jié)果分布顯示一樣的特征：基因型分布特征顯示，惠州地區(qū)人群和中國南方漢人群差異性最小，與西雙版納傣族和北京漢族人群不同基因型和等位基因之間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而與東亞人群基因型的分布比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；等位基因頻率分布結(jié)果顯示，惠州地區(qū)人群等位基因頻率分布和中國南方漢人群與東亞人差異無統(tǒng)計學(xué)意義，和西雙版納傣族與北京漢族人群差異有統(tǒng)計學(xué)意義。本研究人群TT 純合突變型占比最低，比前期報道［8?14］的廣東地區(qū)、贛南、遵義、云南、鄭州中原區(qū)、陜西延安和蘇州地區(qū)人群的該基因型所占比例均低。分析原因，惠州地區(qū)的人群主要以漢族客家人群為主，與其他地區(qū)民族人群存在一定的遺傳異質(zhì)性；其次，不同地區(qū)人群由于長期生活的環(huán)境和習(xí)慣不同，導(dǎo)致一定的遺傳差異。此外，本研究納入的樣本量與其他研究的樣本量存在較大的差異，會對結(jié)果的分析產(chǎn)生一定的影響。通過詢問病史，相對于CC 野生型和CT 雜合突變型，TT純合突變型人群的不良妊娠史，例如葡萄胎史、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)史和先兆流產(chǎn)史等的概率更高，這與張運(yùn)霖［15］報道的相一致。由于本研究納入樣本量有限，不同地區(qū)葉酸代謝障礙MTHFR基因C677T 位點多態(tài)性分布特征對不良妊娠史和不良出生缺陷的影響尚有待進(jìn)一步行大樣本、多中心的研究。

本研究表明惠州地區(qū)MTHFR基因C677T 的基因型與等位基因頻率分布除了與廣東地區(qū)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與贛南、遵義、云南、鄭州中原區(qū)、陜西延安和蘇州地區(qū)的分布結(jié)果均存在一定的差異，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義，并且呈現(xiàn)從南方到北方差異不斷增大的趨勢。分析原因可能與選擇的地區(qū)人群以及所選的樣本量有關(guān)，再次驗證MTHFR基因C677T 位點的基因型和基因頻率分布具有明顯的地域和種族人群差異特征性。

綜上，因不同基因型的人群葉酸代謝能力不同，補(bǔ)充的量不一樣，根據(jù)妊娠史和基因檢測結(jié)果，結(jié)合育齡期婦女的具體情況，給出科學(xué)的增補(bǔ)葉酸建議。特別是對MTHFR基因C677T 位點的CT 和TT 基因型婦女，應(yīng)科學(xué)地個體化增加葉酸的補(bǔ)充量，有效降低不良妊娠史和不良出生結(jié)局的發(fā)生率。