蚌埠地區(qū)3408例女性宮頸HPV感染狀況及基因亞型分布

王中安 郭清江 喬林爽 郭鵬飛

宮頸癌是女性好發(fā)惡性腫瘤之一，發(fā)病率及病死率分列女性腫瘤第二位，是當(dāng)今女性健康的重大威脅［1?2］。研究表明，宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展和人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）的持續(xù)感染密切相關(guān)，且因所感染HPV 基因亞型的不同而存在一定差異［3］。近年來隨著HPV?DNA 分型檢測的逐漸普及，越來越多的研究表明，女性HPV感染率及亞型分布情況因經(jīng)濟水平和生活方式的不同而呈現(xiàn)出區(qū)域性差異的特征［4］，因此進行區(qū)域性女性HPV 感染情況研究，對于該地區(qū)宮頸癌的早期篩查及疫苗接種具有十分重要的指導(dǎo)意義［5?6］。本研究對蚌埠地區(qū)女性宮頸HPV 感染狀況及亞型分布情況進行分析，以期了解該地區(qū)HPV 感染狀況及亞型分布特征，為該地區(qū)疫苗接種、宮頸癌早期防治提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2016年7月1日至2019年12月31日在蚌埠市第一人民醫(yī)院及周邊社區(qū)醫(yī)院進行HPV檢測的門診、住院患者及健康體檢女性，去除重復(fù)患者僅統(tǒng)計初次檢測結(jié)果，共計3 408 例，年齡17～80 歲，將受檢者年齡分為17～歲、20～歲、30～歲、40～歲、50～歲、≥60 歲共6 個年齡段，平均年齡（38.8±9.1）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：提前告知檢測項目并自愿參檢；有既往性生活史；非月經(jīng)期間；非妊娠期間。排除標(biāo)準(zhǔn)：無既往性生活史；采樣檢測時處于月經(jīng)或妊娠期間；有既往子宮切除史。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 儀器與試劑

ABI 7500 Real Time PCR 儀購自美國Thermo Fisher 公司，HybriMax 醫(yī)用核酸分子快速雜交儀、HPV21 種分型檢測試劑盒（PCR?膜雜交法）（包含HPV?DNA 提取試劑、PCR 反應(yīng)試劑、核酸雜交試劑）以及配套的樣本采集器均購自潮州凱普生物化學(xué)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集

使用棉拭子將宮頸口分泌物擦拭干凈，將宮頸脫落細(xì)胞采取器的刷頭置于宮頸口，順時針旋轉(zhuǎn)5 周，取出宮頸刷，將其頭部放入標(biāo)有病人編號的取樣管中，擰緊瓶蓋迅速送檢。

1.3.2 HPV?DNA 的提取

充分洗脫宮頸刷，取500 μL 洗脫液14 000 r/min 離心1 min 收集沉淀，加入400 μL 裂解液混勻后100℃加熱15 min，然后再加入400 μL 異丙醇混勻，14 000 r/min 離心5 min 收集沉淀，加入60 μL滅菌注射用水備用。1.3.3 PCR 擴增

反應(yīng)條件如下：95℃9 min；95℃20 s，55℃30 s，72℃30 s，共40 個循環(huán)；72℃5 min。

1.3.4 膜雜交反應(yīng)

利用HybriMax 醫(yī)用核酸分子快速雜交儀和凱普核酸雜交試劑盒，按照預(yù)雜交、雜交、封閉、酶標(biāo)、顯色的步驟，對PCR 擴增產(chǎn)物進行分型檢測，每批實驗均設(shè)有陰、陽性對照，每個樣本檢測單元均設(shè)有生物素（Biotin）和內(nèi)參（IC）對照。該試劑盒共可檢測21 種HPV 基因亞型，包括15 種高 危亞型：HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68；6 種低危亞型：HPV6、HPV11、HPV42、HPV43、HPV44、HPVCP8304。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以率n（%）表示，采用χ2檢驗，以χ2<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR?膜雜交法實驗結(jié)果

HPV?DNA 擴增產(chǎn)物經(jīng)過膜雜交實驗后，結(jié)果符合試劑盒判定標(biāo)準(zhǔn)，實驗對照及陰、陽性標(biāo)本均有檢出。如圖1所示，A、B、C、D 四個實驗結(jié)果分別提示樣本為陰性、單一感染、雙重感染和三重感染。

圖1 HPV?DNA 膜雜交實驗結(jié)果Figure 1 Results of HPV?DNA membrane hybridization

2.2 HPV 感染檢出情況

3 408 例樣本中，共檢測出HPV 感染陽性患者810 例，總檢出率為23.77%（810/3 408），2016-2019四年中檢出率呈現(xiàn)小幅上升趨勢。見表1。

表1 2016-2019年蚌埠地區(qū)HPV 檢出率［n（%）］Table 1 Detection rate of HPV in Bengbu area from 2016 to 2019［n（%）］

2.3 HPV 感染模式檢出情況

對810 例HPV 感染陽性患者的感染模式分析后發(fā)現(xiàn)，單一感染模式人數(shù)最多，主要亞型為HPV16 型。多重感染模式中，以二重感染人數(shù)居首，主要亞型組合為HPV16 型+HPV52 型。多重感染模式中最多檢出8 種亞型同時感染。見表2。

表2 蚌埠地區(qū)HPV 感染模式檢出情況Table 2 Detection of HPV infection mode in Bengbu area

2.4 不同年齡段HPV 感染分布情況

各年齡段分組中，30～歲年齡段參檢人數(shù)最多，但感染率卻為所有年齡段最低，為22.38%（254/1 135）；17～歲年齡段參檢人數(shù)最少，但感染率居首，為44.44%（12/27）。各年齡段間HPV 感染率比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.712，P<0.05）。見表3。

表3 蚌埠地區(qū)不同年齡段HPV 檢出情況［n（%）］Table 3 Detection of HPV in different age groups in Bengbu area［n（%）］

2.5 HPV 感染患者中基因亞型分布情況

該款分型試劑盒所能檢測的21 種HPV 基因亞型在本次研究中均有檢出，共檢出各種亞型1 130 次，其中高危型占85.31%（964/1 130），低危型占14.69%（166/1 130）。高危型中HPV16（4.67%）、HPV52（3.55%）、HPV58（2.88%）位列前三，低危型中HPV6（1.41%）、HPV11（1.32%）、HPVCP8304（1.17%）位列前三。在所有21 種亞型中，檢出率最高的為HPV16，最低的為HPV43。見表4。

表4 蚌埠地區(qū)HPV 感染患者亞型分布檢出情況Table 4 Detection of HPV gene subtypes distribution in Bengbu area

3 討論

人乳頭瘤病毒屬于乳多空病毒科的乳頭瘤空泡病毒A 屬，是一種球形DNA 病毒，能引起人體皮膚黏膜的鱗狀上皮增殖，目前已分離出130 多種，不同的型別可引起不同的臨床表現(xiàn)［1］。HPV感染所誘發(fā)的女性宮頸癌變，發(fā)病率和致死率均位列目前女性腫瘤疾病的前列，成為危害女性健康和生命的重大威脅，近年來越來越引起臨床醫(yī)療的高度關(guān)注［3］。不同的區(qū)域、種族以及不同年齡段的女性感染的HPV 亞型分布及各種亞型的感染率是有差異性的［7?12］。本研究對蚌埠地區(qū)2016-2019年的HPV 感染情況分析后發(fā)現(xiàn)，四年間HPV 感染率均維持在24%上下，整體呈現(xiàn)一種緩慢上升趨勢，需要引起該地區(qū)衛(wèi)生防疫系統(tǒng)的重視。

本研究在蚌埠地區(qū)選取檢測的3408 例標(biāo)本中，共檢測出HPV 感染陽性患者810 例，總檢出率為23.77%，與羅仲秋等［4］報道的成都地區(qū)HPV 感染率（23.28%）基本相同，高于吳丹丹等［8］報道的合肥地區(qū)HPV 感染率（15.52%），但低于張亞麗等［9］報道的鄭州地區(qū)HPV 感染率（33.38%）。不同地區(qū)報道的樣本中感染率的差異可能與地理位置、經(jīng)濟水平、篩查技術(shù)以及取樣手段有關(guān)。本地區(qū)檢測方法不同于發(fā)達地區(qū)的自動化平臺，目前手工化程度較高，民眾對于HPV 的知曉度和關(guān)注度也較低，生活習(xí)慣亦與其他地區(qū)存在一定差異，這些原因均可引起疾病檢出率的不同。

本研究中所用分型試劑盒所能檢測的21 種HPV 基因亞型在蚌埠地區(qū)均有檢出，亞型分布豐富且以高危險為主。其中位列前三位的高危亞型與吳丹丹等［8］報道的合肥地區(qū)檢出情況相同，均為HPV16、HPV52、HPV58 型。單個亞型感染率最高的為HPV16 型，感染率為4.67%，應(yīng)當(dāng)引起足夠的重視，同為高致癌率基因亞型的HPV18 型感染率相對較低，為1.76%。雖然不同地區(qū)感染的順序有些許差別，但各地區(qū)的高危亞型的總體分布趨于一致，均為HPV52、HPV16、HPV58 型，符合我國的分布特點［13?15］。不過蚌埠地區(qū)目前主要提供針對16 和18 亞型的二價疫苗接種服務(wù)，尚不能滿足民眾需求。

蚌埠地區(qū)不同年齡段直接HPV 檢出率存在一定差異。其中20 歲以下年齡段檢出率較高，可能與健康意識薄弱、年輕女性宮頸發(fā)育不成熟、免疫系統(tǒng)未被致敏，易受HPV 感染有關(guān)等因素相關(guān)［11］。30～49 歲年齡段檢出率較低，可能因性伴侶較為固定，對于健康問題較為重視，并有一定的經(jīng)濟能力及時應(yīng)對，HPV 感染率較其他年齡組低［10］。50～歲年齡段和>60 歲年齡段的患者感染率較高，可能與絕經(jīng)后雌激素下降、陰道皺襞消失、自身清除病毒能力降低等原因關(guān)系密切。胥莎莎等［14］研究發(fā)現(xiàn)HPV 感染患者的病毒清除速率與年齡呈負(fù)相關(guān)，50 歲以上年齡段女性的病毒清除時間顯著長于年輕女性，與本研究結(jié)果相符，而且清除較慢的多為高危亞型，需要引起高齡女性的重視［15］。

綜上所述，本研究為蚌埠地區(qū)女性后續(xù)HPV感染的診斷與治療、HPV 接種以及為臨床宮頸癌的防治工作提供了重要的參考依據(jù)。建議將HPV分型檢測納入到該地區(qū)婦女宮頸疾病普查項目，做到早篩查、早診斷、早干預(yù)、早治療，從而降低本地區(qū)女性宮頸癌的發(fā)病率。