祁梅 ,顧志榮, ,李芹 ,王安紅 ,葛斌
1.甘肅省人民醫(yī)院,甘肅 蘭州 730000; 2.甘肅省中醫(yī)藥研究中心,甘肅 蘭州 730000;3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院,四川 瀘州 646000
麥冬為百合科沿階草屬植物麥冬Ophiopogon japonicus(L. f.)Ker-Gawl.的干燥塊根,被《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品[1],主要產(chǎn)于四川三臺和浙江杭州一帶,分別稱為“川麥冬”和“浙麥冬”,其中浙麥冬品質(zhì)較川麥冬為優(yōu),但生產(chǎn)周期較川麥冬長,種植成本高,且近年生產(chǎn)規(guī)模有所萎縮[2]。二者屬于不同產(chǎn)地的同一種屬來源的中藥,其化學(xué)成分及藥理作用相同。研究表明,麥冬含有皂苷類、黃酮類、多糖類等有效成分[3],具有抗動脈粥樣硬化[4]、抗心肌缺血[5]、抗腫瘤[6]、抗炎[7]、抗氧化[8]、增強免疫[9]、鎮(zhèn)咳[10]、降血糖[11]等廣泛的作用。
2020年版《中華人民共和國藥典》麥冬項下僅以總皂苷含量進(jìn)行質(zhì)量控制,未將其他有效成分、有效部位或指標(biāo)性成分作為質(zhì)控指標(biāo)[12],因此難以對麥冬進(jìn)行快速、全面的質(zhì)量控制與評價。目前已實現(xiàn)麥冬中總皂苷、總黃酮、總多糖的近紅外光譜(NIR)快速測定[13-14],對完善麥冬的質(zhì)量控制體系作出了技術(shù)示范,但主要指標(biāo)性成分及單體有效成分的快速測定對麥冬的質(zhì)量控制更具有實際價值,而鮮見報道。本研究采集不同產(chǎn)區(qū)、不同采收期的麥冬樣品,建立其代表性成分麥冬皂苷B、麥冬皂苷D、麥冬皂苷D′、甲基麥冬二氫高異黃酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B含量的NIR定量分析模型,實現(xiàn)其含量的快速測定,為麥冬的快速、全面質(zhì)量控制與評價提供參考。
Nicolet-6700型傅里葉變換近紅外光譜儀(美國Thermo公司),Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國Agilent公司),Alltech 3300型蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD,美國Grace公司),Milli-Q Advantage A10超純水儀(法國Merck Millipore公司),DZF-6090型真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司),AL204型萬分之一電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司),DD-5M型離心機(湘儀離心機儀器有限公司),SB25-12DTD型超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)。
120批麥冬樣品,采集(購買)于四川、浙江的3個主要產(chǎn)區(qū),見表1。所有樣品均經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室李碩副教授鑒定為百合科沿階草屬植物麥冬Ophiopogon japonicus(L. f.)Ker-Gawl.的干燥塊根[12]。將樣品粉碎至過80目篩,冷藏備用。麥冬皂苷B對照品(批號CHB180122)、麥冬皂苷D對照品(批號CHB180120)、麥冬皂苷D′對照品(批號CHB180121)、甲基麥冬二氫高異黃酮A對照品(批號CHB190119)、甲基麥冬二氫高異黃酮B對照品(批號CHB190125),成都克洛瑪生物科技有限公司,質(zhì)量分?jǐn)?shù)均不低于98%;甲醇、乙腈均為色譜純,天津大茂化學(xué)試劑廠;其他試劑均為分析純。
表1 麥冬樣品來源信息
儀器預(yù)熱30 min后,采用積分球漫反射方式采集NIR。取于60 ℃干燥至恒重的麥冬粉末適量,混勻,置于樣品旋轉(zhuǎn)杯內(nèi),壓實,以內(nèi)置背景為參比,掃描范圍10 000~4 000 cm-1,掃描64次,分辨率8 cm-1,溫度(25±0.5)℃,相對濕度20%~30%,每批樣品重復(fù)采集3次,取平均光譜[15]。120批麥冬樣品NIR疊加圖見圖1。
圖1 120批麥冬樣品NIR疊加圖
2.2.1 供試品溶液制備
精密稱取麥冬粉末約4.0 g,置于具塞三角瓶中,精密加入甲醇溶液50 mL,超聲(頻率40 kHz,功率500 W)提取60 min,過濾,濾液60 ℃水浴蒸至近干,轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中,用甲醇洗滌并定容至刻度線,0.45 μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液,即得。
2.2.2 混合對照品溶液制備
分別精密稱取麥冬皂苷D、麥冬皂苷D′、麥冬皂苷B、甲基麥冬二氫高異黃酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B 7.72、8.62、5.51、10.14、7.53 mg,置于25 mL量瓶中,加甲醇適量,超聲使完全溶解,并以甲醇定容至25 mL,制成濃度分別為0.308 8、0.344 8、0.220 4、0.405 6、0.301 2 mg/mL的混合對照品溶液。
2.2.3 色譜條件
檢測器為ELSD,采用Agilent Extend C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),以乙腈(A)-水(B)為流動相,梯度洗脫(0~60 min,35%A → 65%A),流速1 mL/min,柱溫35 ℃,漂移管溫度100 ℃,氮氣流速3.0 L/min,進(jìn)樣量20 μL。色譜圖見圖2。
圖2 麥冬中5種成分HPLC圖
2.2.4 方法學(xué)考察及含量測定
經(jīng)方法學(xué)考察,5種成分線性回歸方程相關(guān)系數(shù)為0.998 8~0.999 5;精密度試驗結(jié)果表明,5種成分峰面積RSD為0.71%~0.93%;穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明,5種成分的溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定;重復(fù)性試驗結(jié)果表明,5種成分峰面積RSD為1.45%~1.85%;5種成分平均加樣回收率為98.93%~102.33%,RSD為1.76%~2.21%。表明本試驗所采用的儀器及方法誤差均符合要求。按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液,按“2.2.3”項下色譜條件測定峰面積,采用外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算樣品中5種成分含量的化學(xué)參考值。
2.3.1 異常樣品剔除
異常樣品指光譜數(shù)據(jù)存在較大誤差的樣品,這些樣品會對所建模型的準(zhǔn)確性及穩(wěn)健性產(chǎn)生不利影響。本試驗利用Dixon檢驗剔除異常光譜[16],結(jié)果共剔除8個光譜異常的樣品。
2.3.2 樣本集劃分
將經(jīng)過Dixon檢驗的112批樣品按含量數(shù)值從小到大排列后,選取2/3作為校正集(75批),剩余1/3作為驗證集(37批),并且確保驗證集樣品含量在校正集樣品的含量范圍之內(nèi)[17]。樣本集劃分與含量分布結(jié)果見表2。
表2 5種成分樣本集劃分與含量分布結(jié)果(mg/g,n=3)
2.3.3 光譜預(yù)處理方法選擇
NIR易受噪聲、基線漂移、樣品顆粒不均勻、光散射等多種因素干擾,引起隨機誤差,降低信噪比,使模型的準(zhǔn)確性與穩(wěn)健性降低,因此對光譜進(jìn)行預(yù)處理非常重要。本試驗考察未處理光譜(None)、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量校正(SNV)、多元散射校正(MSC)、一階導(dǎo)數(shù)(FD)、二階導(dǎo)數(shù)(SD)、11點移動窗口最小二乘多項式平滑(Savitzky-Golay smoothing,SG)和Norris導(dǎo)數(shù)濾波平滑等常見光譜預(yù)處理方法及組合方法。以決定系數(shù)(R2)、校正均方差(RMSEC)、預(yù)測均方差(RMSEP)和留一法交叉驗證均方差(RMSECV)為指標(biāo),篩選不同建模方法。R2越接近1,RMSEC、RMSEP和RMSECV越接近0,模型的穩(wěn)健性及預(yù)測效果越好。結(jié)果表明,對麥冬皂苷B、麥冬皂苷D、麥冬皂苷D′、甲基麥冬二氫高異黃酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B分別采用SNV+SD+SG、MSC+FD+SG、MSC+SD+SG、MSC+FD+Norris、MSC+FD+ SG進(jìn)行光譜預(yù)處理所得模型預(yù)測效果最佳,見表3。
表3 5種成分最佳光譜預(yù)處理方法
2.3.4 光譜波段選擇
采用篩選出的最佳光譜預(yù)處理方法處理光譜后,用TQ Analyst 8.0軟件的自動優(yōu)化功能,對不同光譜波段的建模效果進(jìn)行考察,選取留一交叉驗證R2最接近1的波段為最佳建模波段??傻名湺碥誃的最佳建模波段為8 105.4~7 316.6 cm-1及9 713.4~8 945.5 cm-1,麥冬皂苷D的最佳建模波段為9 554.6~7 098.4 cm-1,麥冬皂苷D′的最佳建模波段為8 253.1~6 765.2 cm-1、9 425.4~9 005.8 cm-1及9 637.1~9 458.9 cm-1,甲基麥冬二氫高異黃酮A的最佳建模波段為9 252.6~4 125.1 cm-1,甲基麥冬二氫高異黃酮B的最佳建模波段為9 134.2~4 254.2 cm-1。
2.3.5 因子數(shù)選擇
采用內(nèi)部交叉驗證法考察因子數(shù)對RMSECV及交叉驗證R2(%)的影響。當(dāng)模型RMSECV較小且R2最接近1時,對應(yīng)的因子數(shù)用于建模效果最佳。結(jié)果表明,麥冬皂苷B、麥冬皂苷D、麥冬皂苷D′、甲基麥冬二氫高異黃酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B的因子數(shù)分別選擇10、9、10、6、5時建模效果最佳。
2.3.6 定量模型建立與評價
通過上述模型優(yōu)化過程,得到麥冬中5種成分的PLS模型建立方法,見表4。校正模型的相關(guān)性見圖3。其中,麥冬皂苷B定量校正模型R2=0.970 2,RMSEC=0.520 7,RMSEP=0.554 1,采用交叉驗證法判斷模型穩(wěn)健性,交叉驗證R2=0.943 0,RMSECV=0.646 5;麥冬皂苷D定量校正模型R2=0.949 8,RMSEC=0.662 7,RMSEP=0.315 7,交叉驗證R2=0.920 6,RMSECV=0.358 3;麥冬皂苷D′定量校正模型R2=0.980 4,RMSEC=0.085 3,RMSEP=0.415 5,交叉驗證R2=0.951 6,RMSECV=0.693 3;甲基麥冬二氫高異黃酮A定量校正模型R2=0.959 3,RMSEC=0.812 2,RMSEP=0.567 4,交叉驗證R2=0.939 5,RMSECV=0.744 4;甲基麥冬二氫高異黃酮B定量校正模型R2=0.940 8,RMSEC=0.645 1,RMSEP=0.747 6,交叉驗證R2=0.928 3,RMSECV=0.884 9。由圖3可知,校正集與驗證集樣品均勻分布在回歸線兩側(cè),表明模型預(yù)測值與實測值(化學(xué)參考值)之間具有較好的相關(guān)性,模型預(yù)測性能較為理想。
圖3 5種成分參考值與模型預(yù)測值的相關(guān)性
表4 5種成分PLS模型建立方法
2.3.7 外部驗證
選擇15批樣品掃描NIR,輸入模型進(jìn)行外部驗證,檢驗?zāi)P偷臏?zhǔn)確性,結(jié)果見表5~表9??梢?,模型預(yù)測值的分布范圍與實測值基本相符,相對誤差均較小,預(yù)測結(jié)果較為準(zhǔn)確。對各成分的模型預(yù)測值與實測值進(jìn)行配對t檢驗,結(jié)果P值均大于0.05(α=0.05),預(yù)測值與實測值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,表明2種檢測方法之間的系統(tǒng)誤差較小,可忽略不計。因此,利用NIR技術(shù)快速測定麥冬5種成分的含量是可行的。
表5 麥冬皂苷B的PLS模型外部驗證結(jié)果
表6 麥冬皂苷D的PLS模型外部驗證結(jié)果
表9 甲基麥冬二氫高異黃酮B的PLS模型外部驗證結(jié)果
表7 麥冬皂苷D′的PLS模型外部驗證結(jié)果
表8 甲基麥冬二氫高異黃酮A的PLS模型外部驗證結(jié)果
本研究對象是百合科植物麥冬Ophiopogon japonicus(L. f)Ker-Gawl.,不包含山麥冬[即百合科植物湖北麥冬Liriope spicata(Thunb.)Lour. var.proliferaY. T. Ma和Liriope muscari(Decne.)Baily],2020年版《中華人民共和國藥典》將麥冬與山麥冬嚴(yán)格區(qū)分為2種不同的中藥。已有研究發(fā)現(xiàn),山麥冬與麥冬的化學(xué)成分組成存在差異[18]。
傳統(tǒng)的麥冬采收期多根據(jù)經(jīng)驗確定,如川麥冬在種植次年清明之后采收,而浙麥冬在種植后的第3年立夏后采收,兩者種植區(qū)域的東西跨度較大,采收期時間跨度也較大,因此其生產(chǎn)、加工、流通、使用等各環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制較難掌握。2020年版《中華人民共和國藥典》收載了麥冬水分、總灰分、水溶性浸出物和麥冬總皂苷的限量要求,規(guī)定含麥冬總皂苷以魯斯可皂苷元計不得少于0.12%[12],但未對麥冬其他單體有效成分或有效部位進(jìn)行要求。因此,目前尚缺少完善的含量標(biāo)準(zhǔn)評價麥冬質(zhì)量及不同品種的差異。
川麥冬與浙麥冬化學(xué)成分種類及主要藥理作用未見明顯不同,但其成分含量存在明顯差異,主要表現(xiàn)為浙麥冬中麥冬皂苷B、麥冬皂苷D′、甲基麥冬二氫高異黃酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、總黃酮及總多糖的含量更高,因此浙麥冬質(zhì)量更優(yōu)[19]。麥冬總皂苷、總黃酮是麥冬的主要有效部位,是其抗動脈粥樣硬化、抗炎、抗腫瘤的物質(zhì)基礎(chǔ)[4,20]。本研究建立的近紅外光譜模型可以準(zhǔn)確測試2個產(chǎn)地麥冬中的3種主要皂苷及2種主要黃酮的含量,模型預(yù)測結(jié)果與實測結(jié)果無明顯差異,可為麥冬的質(zhì)量控制提供快速、簡便的分析方法及評價依據(jù)。