李納平 ,涂杜鑫 ,鄺高艷 ,劉鑫 ,譚旭儀 ,曾凡 ,盧敏
1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,湖南 長(zhǎng)沙 410011; 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué),湖南 長(zhǎng)沙 410208;3.湖南中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院,湖南 長(zhǎng)沙 410006
骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是中老年人群常見的慢性退行性關(guān)節(jié)疾病,其病理特征主要包括關(guān)節(jié)軟骨退變、滑膜炎癥、軟骨下骨硬化、大量骨贅生成等[1-2]。在OA好發(fā)部位中,膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis,KOA)發(fā)病率最高,其次是手關(guān)節(jié)炎和髖關(guān)節(jié)炎,我國(guó)中老年人群KOA發(fā)病率為8.1%,且有不斷升高趨勢(shì)[3-4]。
關(guān)節(jié)軟骨退變被認(rèn)為是KOA發(fā)病最關(guān)鍵的機(jī)制,軟骨細(xì)胞通過維持細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成與降解的動(dòng)態(tài)平衡,從而在潤(rùn)滑關(guān)節(jié)、維持關(guān)節(jié)軟骨機(jī)械形態(tài)方面發(fā)揮重要作用[5],軟骨細(xì)胞凋亡會(huì)打破關(guān)節(jié)軟骨合成與降解的穩(wěn)態(tài)平衡。自噬是細(xì)胞維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵機(jī)制,細(xì)胞通過自噬降解和再利用細(xì)胞中衰老的細(xì)胞器和大分子物質(zhì),從而避免直接死亡。研究發(fā)現(xiàn),軟骨細(xì)胞自噬和KOA發(fā)生密切相關(guān),通過激活自噬可以減少軟骨細(xì)胞凋亡,延緩關(guān)節(jié)軟骨退變[6-7]。中醫(yī)藥治療KOA具有多途徑、多靶點(diǎn)的特點(diǎn),且不良反應(yīng)少,能有效緩解KOA癥狀,延緩軟骨退變[8]。
中藥威靈仙為毛茛科植物威靈仙Clematis chinensisOsbeck、棉團(tuán)鐵線蓮Clematis hexapetalaPall.或東北鐵線蓮Clematis manshuricaRupr.的干燥根和根莖,具有祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、止痹痛作用[9],其三萜皂苷類成分在治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和KOA方面具有一定療效[10],能通過抑制軟骨細(xì)胞凋亡[11],維持ECM穩(wěn)定[12],從而延緩KOA關(guān)節(jié)軟骨退變。靈仙新苷(clematichinenoside AR,C-AR)是從威靈仙中提取的一種三萜皂苷,具有抗炎鎮(zhèn)痛作用,能將關(guān)節(jié)炎大鼠血清和尿液24種類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)標(biāo)志物調(diào)至正常水平,緩解關(guān)節(jié)炎癥狀[13],并可通過激活自噬減輕氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥[14]。但其能否治療KOA目前尚無報(bào)道。基于此,本研究觀察C-AR對(duì)KOA軟骨細(xì)胞凋亡和自噬的影響,為KOA治療提供新思路。
KOA關(guān)節(jié)軟骨樣本來自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院四肢關(guān)節(jié)科2021年1月-2021年12月接受全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的KOA患者。共14名患者,其中女性11名,男性3名,平均年齡(69.71±6.28)歲。本研究經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)(HNLL-2021-006-01),并獲得所有患者書面知情同意。
靈仙新苷,貨號(hào)L-151,成都瑞思芬;DEME/F12、胎牛血清(FBS),貨號(hào)分別為11330032、10099,美國(guó)Gibco公司;活性氧(ROS)試劑盒、胰蛋白酶,貨號(hào)分別為S0033S、C0201,上海碧云天;Ⅱ型膠原酶,貨號(hào)9001-12-1,美國(guó)Sigma公司;白細(xì)胞介素(IL)-1β,貨號(hào)200-01B,美國(guó)Peprotech公司;IL-6、IL-8 ELISA檢測(cè)試劑盒,貨號(hào)分別為CSBE04638h、CSB-E04641h,武漢華美生物工程;BCA蛋白定量試劑盒,貨號(hào)10030908,長(zhǎng)沙艾碧維;PBS、RIPA裂解液,貨號(hào)分別為G4202、G2002,武漢賽維爾;CCK8試劑盒,貨號(hào)NU679,日本同仁;Trizol總RNA提取試劑,貨號(hào)15596026,美國(guó)Thermo;HiFiScript cDNA Synthesis Kit,貨號(hào)CW2569,北京康為生物;甲苯胺藍(lán)染液,貨號(hào)BL539A,北京索萊寶;DAPI染色液,貨號(hào)C02-04002,北京Bioss;Ⅱ型膠原一抗,貨號(hào)AF0135,美國(guó)Affinity Biosciences;Bax、Caspase-3、Beclin1、LC3B一抗,貨號(hào)分別為50599-2-Ig、19677-1-AP、11306-1-AP、18725-1-AP,美國(guó)Proteintech;Bcl-2一抗,貨號(hào)ab59348,英國(guó)Abcam;HRP-goat anti-mouse IgG、HRP-goat antirabbit IgG,貨號(hào)分別為SA00001-1、SA00001-2,美國(guó)Proteintech。SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái),江蘇蘇凈;HERAcell2401二氧化碳培養(yǎng)箱,美國(guó)Thermo;XDS-3倒置生物顯微鏡,上海奧顯;Enspire多功能酶標(biāo)儀,美國(guó)Perkinelmer;LSM800激光掃描共聚焦顯微鏡,德國(guó)蔡司;Aria Ⅱ流式細(xì)胞儀,美國(guó)BD;MB-530酶標(biāo)儀,深圳匯松。
參考文獻(xiàn)[15]采用二步酶消化法提取軟骨細(xì)胞,將軟骨組織剪碎,加入0.25%胰蛋白酶,放入37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱消化30 min,加入完全培養(yǎng)基(79% DMEM/F12+20% FBS+1%雙抗)終止消化。將軟骨組織轉(zhuǎn)移至離心管,1 200 r/min離心5 min,棄上清液,加入與軟骨組織等體積的0.2% Ⅱ型膠原酶,轉(zhuǎn)移至無菌玻璃瓶,置于培養(yǎng)箱消化20 h。用70 μm細(xì)胞過濾器過濾,濾液1 200 r/min離心5 min,去除上清液,沉淀即為軟骨細(xì)胞。用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,接種至培養(yǎng)瓶,3~5 d換液1次,待細(xì)胞鋪滿瓶底80%以上后進(jìn)行傳代。取P1代細(xì)胞進(jìn)行甲苯胺藍(lán)及Ⅱ型膠原免疫熒光染色鑒定。
將軟骨細(xì)胞按1×105個(gè)/孔接種至6孔板,加入完全培養(yǎng)基,置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。將細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組和C-AR組,每組4個(gè)復(fù)孔,對(duì)照組正常培養(yǎng),模型組參考課題組前期方法[16]加入10 ng/mL IL-1β處理24 h,C-AR組參照文獻(xiàn)[17]方法,先加入30 μmol/L C-AR預(yù)處理1 h,然后加入10 ng/mL IL-1β處理24 h。
將軟骨細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種至96孔板,使用完全培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,然后換成無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h,按“1.4”項(xiàng)下方法分組并進(jìn)行干預(yù),吸去培養(yǎng)基,每孔加入100 μL CCK8工作液(用PBS按1∶9稀釋),放入培養(yǎng)箱避光孵育2 h,酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm處檢測(cè)各孔吸光度(OD值)。
將細(xì)胞按“1.4”項(xiàng)下方法處理后,吸去培養(yǎng)基,加入預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞,將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中,加入PBS,超聲破碎細(xì)胞,4 ℃、3 000 r/min離心5 min,取上清液,根據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測(cè)細(xì)胞IL-6和IL-8含量。
按“1.4”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞后,PBS洗滌細(xì)胞2次,加入10 μmol/L DCFH-DA,37 ℃孵育20 min,無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次,收集細(xì)胞,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS含量。
按“1.4”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞后,胰蛋白酶消化細(xì)胞,將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管,2 000 r/min離心5 min,沉淀用PBS洗滌2次,每次洗滌后2 000 r/min離心5 min,向樣品中加入結(jié)合緩沖液490 μL、Annexin V-FITC 5 μL和碘化丙啶5 μL,室溫避光反應(yīng)10 min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。
將細(xì)胞按“1.4”項(xiàng)下方法處理后,吸去培養(yǎng)基,加入RIPA裂解液提取蛋白,使用BCA蛋白試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,加入Bax一抗(1∶5 000)、Caspase-3一抗(1∶1 000)、Bcl-2一抗(1∶500)、Beclin1一抗(1∶1 000)、LC3B一抗(1∶500),4 ℃孵育過夜。加相應(yīng)二抗,室溫孵育90 min,ECL發(fā)光液顯影,凝膠成像系統(tǒng)成像。用Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析,以β-actin為內(nèi)參,計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。
將細(xì)胞按“1.4”項(xiàng)下方法處理后,吸去培養(yǎng)基,用總RNA提取試劑盒提取總RNA,根據(jù)HiFiScript cDNA Synthesis Kit,以總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,SYBR法對(duì)樣品進(jìn)行qRT-PCR。以β-actin為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。引物序列見表1。
表1 各基因PCR引物序列
將爬片放入6孔板中,以1×105個(gè)/孔接種細(xì)胞,按“1.4”項(xiàng)下方法處理。4%多聚甲醛固定30 min,加入0.3%Triton X-100,37 ℃通透15 min,5% BSA 37 ℃封閉10 min,加入LC3B一抗(1∶100),4 ℃孵育過夜。滴加山羊抗兔IgG(1∶100),室溫避光孵育20 min,DAPI工作溶液染細(xì)胞核,抗熒光淬滅封片劑封片,熒光顯微鏡下觀察并拍照,用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算熒光強(qiáng)度。
采用Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示,多組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
初期軟骨細(xì)胞呈不規(guī)則多角形或短梭形,隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),形態(tài)多呈長(zhǎng)梭形,細(xì)胞核呈圓形或橢圓形,細(xì)胞間有偽足相連,形態(tài)似成纖維細(xì)胞。甲苯胺藍(lán)染色可見胞漿呈淺藍(lán)色,細(xì)胞核為深藍(lán)色。Ⅱ型膠原免疫熒光染色顯示,胞漿及胞膜呈綠色熒光,表明培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)特征性Ⅱ型膠原,細(xì)胞核被DAPI復(fù)染,呈藍(lán)色。見圖1。
圖1 人KOA軟骨細(xì)胞形態(tài)觀察及鑒定(×200)
與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞活力顯著降低(P<0.01);與模型組比較,C-AR組細(xì)胞活力顯著升高(P<0.05)。結(jié)果見表2。
表2 各組軟骨細(xì)胞細(xì)胞活力比較(±s)
表2 各組軟骨細(xì)胞細(xì)胞活力比較(±s)
注:與對(duì)照組比較,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05
組別對(duì)照組模型組C-AR組n 4 4 4細(xì)胞活力1.60±0.07 0.97±0.04**1.31±0.04#
與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞IL-6和IL-8含量顯著增加(P<0.01);與模型組比較,C-AR組細(xì)胞IL-6和IL-8含量顯著減少(P<0.05)。結(jié)果見表3。
表3 各組軟骨細(xì)胞IL-6和IL-8含量比較(±s,pg/mL)
表3 各組軟骨細(xì)胞IL-6和IL-8含量比較(±s,pg/mL)
注:與對(duì)照組比較,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05
組別對(duì)照組模型組C-AR組n4 4 4 IL-6 23.87±4.62 44.01±3.68**33.25±6.10#IL-8 57.79±5.48 97.10±6.26**83.92±3.68#
與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞ROS含量顯著增加,凋亡率顯著升高(P<0.01);與模型組比較,C-AR組細(xì)胞ROS含量顯著減少,凋亡率顯著降低(P<0.01)。結(jié)果見圖2、圖3、表4。
圖2 各組軟骨細(xì)胞ROS檢測(cè)
圖3 各組軟骨細(xì)胞凋亡率檢測(cè)
表4 各組軟骨細(xì)胞ROS含量和凋亡率比較(±s)
表4 各組軟骨細(xì)胞ROS含量和凋亡率比較(±s)
注:與對(duì)照組比較,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01
組別對(duì)照組模型組C-AR組n4 4 4 ROS熒光強(qiáng)度1 292±241.7 6 197±154.3**3 410±135.7##凋亡率/%4.19±0.26 25.86±0.59**17.35±0.97##
與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01),Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01);與模型組比較,C-AR組細(xì)胞Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01),Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)。結(jié)果見圖4、表5。
表5 各組軟骨細(xì)胞Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)比較(±s)
表5 各組軟骨細(xì)胞Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)比較(±s)
注:與對(duì)照組比較,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01
組別對(duì)照組模型組C-AR組n 4 4 4 Bax/β-actin 0.24±0.03 0.57±0.03**0.32±0.03##Bcl-2/β-actin 0.55±0.03 0.15±0.03**0.30±0.03##Caspase-3/β-actin 0.19±0.02 0.54±0.06**0.32±0.05##
圖4 各組軟骨細(xì)胞Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白免疫印跡
與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞Bax和Caspase-3 mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.01),Bcl-2 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01);與模型組比較,C-AR組細(xì)胞Bax和Caspase3 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01),Bcl-2 mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.01)。結(jié)果見表6。
表6 各組軟骨細(xì)胞Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達(dá)比較(±s)
表6 各組軟骨細(xì)胞Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達(dá)比較(±s)
注:與對(duì)照組比較,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01
組別對(duì)照組模型組C-AR組n 4 4 4 Bax 1.00±0.06 5.33±0.29**2.84±0.35##Bcl-2 1.00±0.06 0.26±0.01**0.55±0.06##Caspase-3 1.00±0.07 3.49±0.21**2.12±0.21##
Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞Beclin1蛋白表達(dá)和LC3BⅡ/LC3BⅠ比值顯著降低(P<0.01);與模型組比較,C-AR組細(xì)胞Beclin1蛋白表達(dá)和LC3BⅡ/LC3BⅠ比值顯著升高(P<0.01)。免疫熒光結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞LC3B表達(dá)顯著降低(P<0.01);與模型組比較,C-AR組細(xì)胞LC3B蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)。結(jié)果見圖5、圖6、表7。
圖5 各組軟骨細(xì)胞Beclin1、LC3B蛋白免疫印跡
圖6 各組軟骨細(xì)胞LC3B陽(yáng)性表達(dá)(免疫熒光染色,標(biāo)尺=25 μm)
表7 各組軟骨細(xì)胞Beclin1、LC3B蛋白表達(dá)比較(±s)
表7 各組軟骨細(xì)胞Beclin1、LC3B蛋白表達(dá)比較(±s)
注:與對(duì)照組比較,**P<0.01,與模型組比較,##P<0.01
組別對(duì)照組模型組C-AR組Beclin1/β-actin 0.43±0.04 0.24±0.03**0.38±0.02##LC3BⅡ/LC3BⅠ2.22±0.06 0.42±0.03**0.93±0.04##LC3B熒光強(qiáng)度67 452±2 138 44 023±2 371**57 225±1 563##
威靈仙是治療風(fēng)濕痹痛的要藥。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),威靈仙提取物及有效成分在治療KOA方面均能發(fā)揮積極作用[18]。馬勇等[19]運(yùn)用威靈仙提取物對(duì)體外培養(yǎng)的兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),發(fā)現(xiàn)其能促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 mRNA的表達(dá),對(duì)關(guān)節(jié)軟骨產(chǎn)生保護(hù)作用,從而延緩KOA發(fā)展。此外,威靈仙提取物還能促進(jìn)軟骨細(xì)胞ECM合成,維持軟骨細(xì)胞表型穩(wěn)定[20]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),在獨(dú)活寄生湯基礎(chǔ)上加入威靈仙、黃芩等藥物能降低KOA兔血清及關(guān)節(jié)液炎癥因子表達(dá),緩解軟骨退變[21]。體外實(shí)驗(yàn)?zāi)芡ㄟ^調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡[22]。
C-AR作為威靈仙中一種三萜皂苷類成分,在抗炎、抗氧化應(yīng)激方面具有一定作用。炎癥反應(yīng)貫穿KOA發(fā)病過程,促炎因子如IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α等在KOA發(fā)病過程中大量釋放,導(dǎo)致產(chǎn)生疼痛。軟骨細(xì)胞異常的氧化應(yīng)激狀態(tài)也會(huì)誘發(fā)炎癥因子產(chǎn)生[10],從而進(jìn)一步加速軟骨細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn),C-AR能降低TNF-α刺激下MH7A細(xì)胞IL-6和IL-8分泌,減少基質(zhì)金屬蛋白酶產(chǎn)生,有效拮抗TNF-α誘導(dǎo)的炎癥和細(xì)胞毒性[17]。本研究發(fā)現(xiàn),IL-1β刺激導(dǎo)致軟骨細(xì)胞活力降低,細(xì)胞IL-6和IL-8含量明顯增加,氧化應(yīng)激水平也隨之升高,細(xì)胞凋亡率明顯升高。C-AR處理后,軟骨細(xì)胞活力升高,細(xì)胞IL-6和IL-8含量明顯減少,氧化應(yīng)激水平和細(xì)胞凋亡率明顯降低,促凋亡Bax、Caspase-3基因和蛋白表達(dá)下調(diào),抗凋亡Bcl-2基因和蛋白表達(dá)上調(diào)。提示C-AR可減輕體外培養(yǎng)的KOA軟骨細(xì)胞炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng),抑制細(xì)胞凋亡。
自噬可恢復(fù)受損軟骨細(xì)胞功能,減少軟骨細(xì)胞凋亡,延緩KOA發(fā)生發(fā)展[23]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),牛膝多糖能促進(jìn)軟骨細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá),抑制凋亡相關(guān)蛋白Fadd、Caspase-3/9表達(dá),降低軟骨細(xì)胞凋亡率[24-25],提示可通過促進(jìn)軟骨細(xì)胞自噬抑制軟骨細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示,C-AR組軟骨細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3B表達(dá)及LC3BⅡ/LC3BⅠ比值升高,表明C-AR能促進(jìn)自噬發(fā)生。結(jié)合細(xì)胞凋亡率可見,軟骨細(xì)胞凋亡與自噬水平呈負(fù)相關(guān),隨著自噬增強(qiáng),凋亡進(jìn)一步減弱。
綜上所述,C-AR可減輕體外培養(yǎng)的KOA軟骨細(xì)胞炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng),抑制軟骨細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能與激活自噬有關(guān)。本研究初步觀察了C-AR對(duì)KOA軟骨細(xì)胞自噬和凋亡的影響,對(duì)其通過哪些途徑激活自噬、抑制細(xì)胞凋亡及量效關(guān)系尚未明確,今后我們將繼續(xù)深入研究,為防治KOA提供更多依據(jù)。