• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    靈仙新苷對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡和自噬的影響

    2023-03-11 09:19:18李納平涂杜鑫鄺高艷劉鑫譚旭儀曾凡盧敏
    關(guān)鍵詞:威靈仙貨號(hào)軟骨

    李納平 ,涂杜鑫 ,鄺高艷 ,劉鑫 ,譚旭儀 ,曾凡 ,盧敏

    1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,湖南 長(zhǎng)沙 410011; 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué),湖南 長(zhǎng)沙 410208;3.湖南中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院,湖南 長(zhǎng)沙 410006

    骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是中老年人群常見的慢性退行性關(guān)節(jié)疾病,其病理特征主要包括關(guān)節(jié)軟骨退變、滑膜炎癥、軟骨下骨硬化、大量骨贅生成等[1-2]。在OA好發(fā)部位中,膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis,KOA)發(fā)病率最高,其次是手關(guān)節(jié)炎和髖關(guān)節(jié)炎,我國(guó)中老年人群KOA發(fā)病率為8.1%,且有不斷升高趨勢(shì)[3-4]。

    關(guān)節(jié)軟骨退變被認(rèn)為是KOA發(fā)病最關(guān)鍵的機(jī)制,軟骨細(xì)胞通過維持細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成與降解的動(dòng)態(tài)平衡,從而在潤(rùn)滑關(guān)節(jié)、維持關(guān)節(jié)軟骨機(jī)械形態(tài)方面發(fā)揮重要作用[5],軟骨細(xì)胞凋亡會(huì)打破關(guān)節(jié)軟骨合成與降解的穩(wěn)態(tài)平衡。自噬是細(xì)胞維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵機(jī)制,細(xì)胞通過自噬降解和再利用細(xì)胞中衰老的細(xì)胞器和大分子物質(zhì),從而避免直接死亡。研究發(fā)現(xiàn),軟骨細(xì)胞自噬和KOA發(fā)生密切相關(guān),通過激活自噬可以減少軟骨細(xì)胞凋亡,延緩關(guān)節(jié)軟骨退變[6-7]。中醫(yī)藥治療KOA具有多途徑、多靶點(diǎn)的特點(diǎn),且不良反應(yīng)少,能有效緩解KOA癥狀,延緩軟骨退變[8]。

    中藥威靈仙為毛茛科植物威靈仙Clematis chinensisOsbeck、棉團(tuán)鐵線蓮Clematis hexapetalaPall.或東北鐵線蓮Clematis manshuricaRupr.的干燥根和根莖,具有祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、止痹痛作用[9],其三萜皂苷類成分在治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和KOA方面具有一定療效[10],能通過抑制軟骨細(xì)胞凋亡[11],維持ECM穩(wěn)定[12],從而延緩KOA關(guān)節(jié)軟骨退變。靈仙新苷(clematichinenoside AR,C-AR)是從威靈仙中提取的一種三萜皂苷,具有抗炎鎮(zhèn)痛作用,能將關(guān)節(jié)炎大鼠血清和尿液24種類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)標(biāo)志物調(diào)至正常水平,緩解關(guān)節(jié)炎癥狀[13],并可通過激活自噬減輕氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥[14]。但其能否治療KOA目前尚無報(bào)道。基于此,本研究觀察C-AR對(duì)KOA軟骨細(xì)胞凋亡和自噬的影響,為KOA治療提供新思路。

    1 材料與方法

    1.1 樣本來源

    KOA關(guān)節(jié)軟骨樣本來自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院四肢關(guān)節(jié)科2021年1月-2021年12月接受全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的KOA患者。共14名患者,其中女性11名,男性3名,平均年齡(69.71±6.28)歲。本研究經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)(HNLL-2021-006-01),并獲得所有患者書面知情同意。

    1.2 主要試劑與儀器

    靈仙新苷,貨號(hào)L-151,成都瑞思芬;DEME/F12、胎牛血清(FBS),貨號(hào)分別為11330032、10099,美國(guó)Gibco公司;活性氧(ROS)試劑盒、胰蛋白酶,貨號(hào)分別為S0033S、C0201,上海碧云天;Ⅱ型膠原酶,貨號(hào)9001-12-1,美國(guó)Sigma公司;白細(xì)胞介素(IL)-1β,貨號(hào)200-01B,美國(guó)Peprotech公司;IL-6、IL-8 ELISA檢測(cè)試劑盒,貨號(hào)分別為CSBE04638h、CSB-E04641h,武漢華美生物工程;BCA蛋白定量試劑盒,貨號(hào)10030908,長(zhǎng)沙艾碧維;PBS、RIPA裂解液,貨號(hào)分別為G4202、G2002,武漢賽維爾;CCK8試劑盒,貨號(hào)NU679,日本同仁;Trizol總RNA提取試劑,貨號(hào)15596026,美國(guó)Thermo;HiFiScript cDNA Synthesis Kit,貨號(hào)CW2569,北京康為生物;甲苯胺藍(lán)染液,貨號(hào)BL539A,北京索萊寶;DAPI染色液,貨號(hào)C02-04002,北京Bioss;Ⅱ型膠原一抗,貨號(hào)AF0135,美國(guó)Affinity Biosciences;Bax、Caspase-3、Beclin1、LC3B一抗,貨號(hào)分別為50599-2-Ig、19677-1-AP、11306-1-AP、18725-1-AP,美國(guó)Proteintech;Bcl-2一抗,貨號(hào)ab59348,英國(guó)Abcam;HRP-goat anti-mouse IgG、HRP-goat antirabbit IgG,貨號(hào)分別為SA00001-1、SA00001-2,美國(guó)Proteintech。SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái),江蘇蘇凈;HERAcell2401二氧化碳培養(yǎng)箱,美國(guó)Thermo;XDS-3倒置生物顯微鏡,上海奧顯;Enspire多功能酶標(biāo)儀,美國(guó)Perkinelmer;LSM800激光掃描共聚焦顯微鏡,德國(guó)蔡司;Aria Ⅱ流式細(xì)胞儀,美國(guó)BD;MB-530酶標(biāo)儀,深圳匯松。

    1.3 細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定

    參考文獻(xiàn)[15]采用二步酶消化法提取軟骨細(xì)胞,將軟骨組織剪碎,加入0.25%胰蛋白酶,放入37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱消化30 min,加入完全培養(yǎng)基(79% DMEM/F12+20% FBS+1%雙抗)終止消化。將軟骨組織轉(zhuǎn)移至離心管,1 200 r/min離心5 min,棄上清液,加入與軟骨組織等體積的0.2% Ⅱ型膠原酶,轉(zhuǎn)移至無菌玻璃瓶,置于培養(yǎng)箱消化20 h。用70 μm細(xì)胞過濾器過濾,濾液1 200 r/min離心5 min,去除上清液,沉淀即為軟骨細(xì)胞。用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,接種至培養(yǎng)瓶,3~5 d換液1次,待細(xì)胞鋪滿瓶底80%以上后進(jìn)行傳代。取P1代細(xì)胞進(jìn)行甲苯胺藍(lán)及Ⅱ型膠原免疫熒光染色鑒定。

    1.4 分組、造模及給藥

    將軟骨細(xì)胞按1×105個(gè)/孔接種至6孔板,加入完全培養(yǎng)基,置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。將細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組和C-AR組,每組4個(gè)復(fù)孔,對(duì)照組正常培養(yǎng),模型組參考課題組前期方法[16]加入10 ng/mL IL-1β處理24 h,C-AR組參照文獻(xiàn)[17]方法,先加入30 μmol/L C-AR預(yù)處理1 h,然后加入10 ng/mL IL-1β處理24 h。

    1.5 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力

    將軟骨細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種至96孔板,使用完全培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,然后換成無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h,按“1.4”項(xiàng)下方法分組并進(jìn)行干預(yù),吸去培養(yǎng)基,每孔加入100 μL CCK8工作液(用PBS按1∶9稀釋),放入培養(yǎng)箱避光孵育2 h,酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm處檢測(cè)各孔吸光度(OD值)。

    1.6 ELISA檢測(cè)

    將細(xì)胞按“1.4”項(xiàng)下方法處理后,吸去培養(yǎng)基,加入預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞,將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中,加入PBS,超聲破碎細(xì)胞,4 ℃、3 000 r/min離心5 min,取上清液,根據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測(cè)細(xì)胞IL-6和IL-8含量。

    1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)活性氧含量

    按“1.4”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞后,PBS洗滌細(xì)胞2次,加入10 μmol/L DCFH-DA,37 ℃孵育20 min,無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次,收集細(xì)胞,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS含量。

    1.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

    按“1.4”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞后,胰蛋白酶消化細(xì)胞,將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管,2 000 r/min離心5 min,沉淀用PBS洗滌2次,每次洗滌后2 000 r/min離心5 min,向樣品中加入結(jié)合緩沖液490 μL、Annexin V-FITC 5 μL和碘化丙啶5 μL,室溫避光反應(yīng)10 min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

    1.9 Western blot檢測(cè)

    將細(xì)胞按“1.4”項(xiàng)下方法處理后,吸去培養(yǎng)基,加入RIPA裂解液提取蛋白,使用BCA蛋白試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,加入Bax一抗(1∶5 000)、Caspase-3一抗(1∶1 000)、Bcl-2一抗(1∶500)、Beclin1一抗(1∶1 000)、LC3B一抗(1∶500),4 ℃孵育過夜。加相應(yīng)二抗,室溫孵育90 min,ECL發(fā)光液顯影,凝膠成像系統(tǒng)成像。用Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析,以β-actin為內(nèi)參,計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

    1.10 qRT-PCR檢測(cè)

    將細(xì)胞按“1.4”項(xiàng)下方法處理后,吸去培養(yǎng)基,用總RNA提取試劑盒提取總RNA,根據(jù)HiFiScript cDNA Synthesis Kit,以總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,SYBR法對(duì)樣品進(jìn)行qRT-PCR。以β-actin為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。引物序列見表1。

    表1 各基因PCR引物序列

    1.11 免疫熒光檢測(cè)

    將爬片放入6孔板中,以1×105個(gè)/孔接種細(xì)胞,按“1.4”項(xiàng)下方法處理。4%多聚甲醛固定30 min,加入0.3%Triton X-100,37 ℃通透15 min,5% BSA 37 ℃封閉10 min,加入LC3B一抗(1∶100),4 ℃孵育過夜。滴加山羊抗兔IgG(1∶100),室溫避光孵育20 min,DAPI工作溶液染細(xì)胞核,抗熒光淬滅封片劑封片,熒光顯微鏡下觀察并拍照,用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算熒光強(qiáng)度。

    1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示,多組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 軟骨細(xì)胞鑒定

    初期軟骨細(xì)胞呈不規(guī)則多角形或短梭形,隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),形態(tài)多呈長(zhǎng)梭形,細(xì)胞核呈圓形或橢圓形,細(xì)胞間有偽足相連,形態(tài)似成纖維細(xì)胞。甲苯胺藍(lán)染色可見胞漿呈淺藍(lán)色,細(xì)胞核為深藍(lán)色。Ⅱ型膠原免疫熒光染色顯示,胞漿及胞膜呈綠色熒光,表明培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)特征性Ⅱ型膠原,細(xì)胞核被DAPI復(fù)染,呈藍(lán)色。見圖1。

    圖1 人KOA軟骨細(xì)胞形態(tài)觀察及鑒定(×200)

    2.2 靈仙新苷對(duì)軟骨細(xì)胞活力的影響

    與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞活力顯著降低(P<0.01);與模型組比較,C-AR組細(xì)胞活力顯著升高(P<0.05)。結(jié)果見表2。

    表2 各組軟骨細(xì)胞細(xì)胞活力比較(±s)

    表2 各組軟骨細(xì)胞細(xì)胞活力比較(±s)

    注:與對(duì)照組比較,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05

    組別對(duì)照組模型組C-AR組n 4 4 4細(xì)胞活力1.60±0.07 0.97±0.04**1.31±0.04#

    2.3 靈仙新苷對(duì)軟骨細(xì)胞白細(xì)胞介素-6和白細(xì)胞介素-8表達(dá)的影響

    與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞IL-6和IL-8含量顯著增加(P<0.01);與模型組比較,C-AR組細(xì)胞IL-6和IL-8含量顯著減少(P<0.05)。結(jié)果見表3。

    表3 各組軟骨細(xì)胞IL-6和IL-8含量比較(±s,pg/mL)

    表3 各組軟骨細(xì)胞IL-6和IL-8含量比較(±s,pg/mL)

    注:與對(duì)照組比較,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05

    組別對(duì)照組模型組C-AR組n4 4 4 IL-6 23.87±4.62 44.01±3.68**33.25±6.10#IL-8 57.79±5.48 97.10±6.26**83.92±3.68#

    2.4 靈仙新苷對(duì)軟骨細(xì)胞活性氧含量及凋亡率的影響

    與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞ROS含量顯著增加,凋亡率顯著升高(P<0.01);與模型組比較,C-AR組細(xì)胞ROS含量顯著減少,凋亡率顯著降低(P<0.01)。結(jié)果見圖2、圖3、表4。

    圖2 各組軟骨細(xì)胞ROS檢測(cè)

    圖3 各組軟骨細(xì)胞凋亡率檢測(cè)

    表4 各組軟骨細(xì)胞ROS含量和凋亡率比較(±s)

    表4 各組軟骨細(xì)胞ROS含量和凋亡率比較(±s)

    注:與對(duì)照組比較,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01

    組別對(duì)照組模型組C-AR組n4 4 4 ROS熒光強(qiáng)度1 292±241.7 6 197±154.3**3 410±135.7##凋亡率/%4.19±0.26 25.86±0.59**17.35±0.97##

    2.5 靈仙新苷對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

    與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01),Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01);與模型組比較,C-AR組細(xì)胞Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01),Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)。結(jié)果見圖4、表5。

    表5 各組軟骨細(xì)胞Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)比較(±s)

    表5 各組軟骨細(xì)胞Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)比較(±s)

    注:與對(duì)照組比較,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01

    組別對(duì)照組模型組C-AR組n 4 4 4 Bax/β-actin 0.24±0.03 0.57±0.03**0.32±0.03##Bcl-2/β-actin 0.55±0.03 0.15±0.03**0.30±0.03##Caspase-3/β-actin 0.19±0.02 0.54±0.06**0.32±0.05##

    圖4 各組軟骨細(xì)胞Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白免疫印跡

    2.6 靈仙新苷對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)mRNA表達(dá)的影響

    與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞Bax和Caspase-3 mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.01),Bcl-2 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01);與模型組比較,C-AR組細(xì)胞Bax和Caspase3 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01),Bcl-2 mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.01)。結(jié)果見表6。

    表6 各組軟骨細(xì)胞Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達(dá)比較(±s)

    表6 各組軟骨細(xì)胞Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達(dá)比較(±s)

    注:與對(duì)照組比較,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01

    組別對(duì)照組模型組C-AR組n 4 4 4 Bax 1.00±0.06 5.33±0.29**2.84±0.35##Bcl-2 1.00±0.06 0.26±0.01**0.55±0.06##Caspase-3 1.00±0.07 3.49±0.21**2.12±0.21##

    2.7 靈仙新苷對(duì)軟骨細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

    Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞Beclin1蛋白表達(dá)和LC3BⅡ/LC3BⅠ比值顯著降低(P<0.01);與模型組比較,C-AR組細(xì)胞Beclin1蛋白表達(dá)和LC3BⅡ/LC3BⅠ比值顯著升高(P<0.01)。免疫熒光結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞LC3B表達(dá)顯著降低(P<0.01);與模型組比較,C-AR組細(xì)胞LC3B蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)。結(jié)果見圖5、圖6、表7。

    圖5 各組軟骨細(xì)胞Beclin1、LC3B蛋白免疫印跡

    圖6 各組軟骨細(xì)胞LC3B陽(yáng)性表達(dá)(免疫熒光染色,標(biāo)尺=25 μm)

    表7 各組軟骨細(xì)胞Beclin1、LC3B蛋白表達(dá)比較(±s)

    表7 各組軟骨細(xì)胞Beclin1、LC3B蛋白表達(dá)比較(±s)

    注:與對(duì)照組比較,**P<0.01,與模型組比較,##P<0.01

    組別對(duì)照組模型組C-AR組Beclin1/β-actin 0.43±0.04 0.24±0.03**0.38±0.02##LC3BⅡ/LC3BⅠ2.22±0.06 0.42±0.03**0.93±0.04##LC3B熒光強(qiáng)度67 452±2 138 44 023±2 371**57 225±1 563##

    3 討論

    威靈仙是治療風(fēng)濕痹痛的要藥。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),威靈仙提取物及有效成分在治療KOA方面均能發(fā)揮積極作用[18]。馬勇等[19]運(yùn)用威靈仙提取物對(duì)體外培養(yǎng)的兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),發(fā)現(xiàn)其能促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 mRNA的表達(dá),對(duì)關(guān)節(jié)軟骨產(chǎn)生保護(hù)作用,從而延緩KOA發(fā)展。此外,威靈仙提取物還能促進(jìn)軟骨細(xì)胞ECM合成,維持軟骨細(xì)胞表型穩(wěn)定[20]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),在獨(dú)活寄生湯基礎(chǔ)上加入威靈仙、黃芩等藥物能降低KOA兔血清及關(guān)節(jié)液炎癥因子表達(dá),緩解軟骨退變[21]。體外實(shí)驗(yàn)?zāi)芡ㄟ^調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡[22]。

    C-AR作為威靈仙中一種三萜皂苷類成分,在抗炎、抗氧化應(yīng)激方面具有一定作用。炎癥反應(yīng)貫穿KOA發(fā)病過程,促炎因子如IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α等在KOA發(fā)病過程中大量釋放,導(dǎo)致產(chǎn)生疼痛。軟骨細(xì)胞異常的氧化應(yīng)激狀態(tài)也會(huì)誘發(fā)炎癥因子產(chǎn)生[10],從而進(jìn)一步加速軟骨細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn),C-AR能降低TNF-α刺激下MH7A細(xì)胞IL-6和IL-8分泌,減少基質(zhì)金屬蛋白酶產(chǎn)生,有效拮抗TNF-α誘導(dǎo)的炎癥和細(xì)胞毒性[17]。本研究發(fā)現(xiàn),IL-1β刺激導(dǎo)致軟骨細(xì)胞活力降低,細(xì)胞IL-6和IL-8含量明顯增加,氧化應(yīng)激水平也隨之升高,細(xì)胞凋亡率明顯升高。C-AR處理后,軟骨細(xì)胞活力升高,細(xì)胞IL-6和IL-8含量明顯減少,氧化應(yīng)激水平和細(xì)胞凋亡率明顯降低,促凋亡Bax、Caspase-3基因和蛋白表達(dá)下調(diào),抗凋亡Bcl-2基因和蛋白表達(dá)上調(diào)。提示C-AR可減輕體外培養(yǎng)的KOA軟骨細(xì)胞炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng),抑制細(xì)胞凋亡。

    自噬可恢復(fù)受損軟骨細(xì)胞功能,減少軟骨細(xì)胞凋亡,延緩KOA發(fā)生發(fā)展[23]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),牛膝多糖能促進(jìn)軟骨細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá),抑制凋亡相關(guān)蛋白Fadd、Caspase-3/9表達(dá),降低軟骨細(xì)胞凋亡率[24-25],提示可通過促進(jìn)軟骨細(xì)胞自噬抑制軟骨細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示,C-AR組軟骨細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3B表達(dá)及LC3BⅡ/LC3BⅠ比值升高,表明C-AR能促進(jìn)自噬發(fā)生。結(jié)合細(xì)胞凋亡率可見,軟骨細(xì)胞凋亡與自噬水平呈負(fù)相關(guān),隨著自噬增強(qiáng),凋亡進(jìn)一步減弱。

    綜上所述,C-AR可減輕體外培養(yǎng)的KOA軟骨細(xì)胞炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng),抑制軟骨細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能與激活自噬有關(guān)。本研究初步觀察了C-AR對(duì)KOA軟骨細(xì)胞自噬和凋亡的影響,對(duì)其通過哪些途徑激活自噬、抑制細(xì)胞凋亡及量效關(guān)系尚未明確,今后我們將繼續(xù)深入研究,為防治KOA提供更多依據(jù)。

    猜你喜歡
    威靈仙貨號(hào)軟骨
    威靈仙炮制歷史沿革研究
    威靈仙治手足不遂
    保健與生活(2022年4期)2022-02-13 10:43:05
    鞋品牌新品爆單“故事匯”
    鞍區(qū)軟骨黏液纖維瘤1例
    作者更正致歉說明
    原發(fā)肺軟骨瘤1例報(bào)告并文獻(xiàn)復(fù)習(xí)
    威靈仙與鐵絲威靈仙的鑒別
    市售威靈仙飲片的質(zhì)量分析
    大學(xué)生網(wǎng)球裝備推薦
    骨科英漢詞匯
    91狼人影院| 悠悠久久av| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 人人妻人人澡欧美一区二区| 88av欧美| 俺也久久电影网| 成人亚洲精品av一区二区| 精品国内亚洲2022精品成人| 日韩中文字幕欧美一区二区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 超碰av人人做人人爽久久| 久99久视频精品免费| 级片在线观看| 国产精品不卡视频一区二区| 午夜久久久久精精品| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 午夜久久久久精精品| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲国产精品sss在线观看| 色综合站精品国产| 搡老妇女老女人老熟妇| 欧美成人一区二区免费高清观看| 日韩欧美免费精品| 色哟哟·www| 色吧在线观看| videossex国产| 午夜福利成人在线免费观看| 免费人成在线观看视频色| 久久久精品大字幕| 赤兔流量卡办理| 免费在线观看日本一区| av在线老鸭窝| 全区人妻精品视频| 国产精品一区二区三区四区久久| 禁无遮挡网站| 久久精品国产鲁丝片午夜精品 | 国产乱人视频| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 中文字幕免费在线视频6| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产一区二区三区av在线 | 国产免费av片在线观看野外av| 久久人人爽人人爽人人片va| 偷拍熟女少妇极品色| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 91麻豆av在线| 国产精品伦人一区二区| 色尼玛亚洲综合影院| 黄色丝袜av网址大全| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 日本黄色片子视频| 久久久久性生活片| 成人鲁丝片一二三区免费| 又爽又黄无遮挡网站| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 久久亚洲真实| 国产精品永久免费网站| 日本成人三级电影网站| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 成人无遮挡网站| 在线播放国产精品三级| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲国产欧美人成| 欧美3d第一页| .国产精品久久| 亚洲成人中文字幕在线播放| 男女视频在线观看网站免费| 高清在线国产一区| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产中年淑女户外野战色| 麻豆一二三区av精品| 又粗又爽又猛毛片免费看| 久久久久久久午夜电影| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 午夜日韩欧美国产| 少妇人妻一区二区三区视频| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产单亲对白刺激| 欧美激情久久久久久爽电影| 精品久久久久久久久亚洲 | av黄色大香蕉| 99热精品在线国产| 日韩大尺度精品在线看网址| 欧美三级亚洲精品| 亚洲18禁久久av| 日本欧美国产在线视频| 亚洲avbb在线观看| 在线国产一区二区在线| 成年版毛片免费区| 久久欧美精品欧美久久欧美| 久久这里只有精品中国| 欧美精品国产亚洲| 国产伦人伦偷精品视频| 欧美在线一区亚洲| 最后的刺客免费高清国语| 久99久视频精品免费| 一进一出抽搐动态| 春色校园在线视频观看| 99久久精品一区二区三区| 亚洲专区中文字幕在线| 嫩草影院新地址| 国产亚洲欧美98| 亚洲性久久影院| 亚洲自拍偷在线| 日本爱情动作片www.在线观看 | 一个人看视频在线观看www免费| 黄片wwwwww| 日韩av在线大香蕉| 天堂网av新在线| 麻豆久久精品国产亚洲av| 99在线人妻在线中文字幕| 国产精品一区www在线观看 | 99热只有精品国产| 日本与韩国留学比较| 国产三级在线视频| 一a级毛片在线观看| 综合色av麻豆| 又爽又黄无遮挡网站| 看免费成人av毛片| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 亚洲美女视频黄频| 一本一本综合久久| 色5月婷婷丁香| 一a级毛片在线观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 免费在线观看日本一区| 美女免费视频网站| 日韩高清综合在线| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 久久久久久九九精品二区国产| 亚洲最大成人av| aaaaa片日本免费| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产熟女欧美一区二区| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 欧美xxxx性猛交bbbb| 在线播放无遮挡| 黄片wwwwww| 亚洲va在线va天堂va国产| 观看免费一级毛片| 国产乱人视频| 丝袜美腿在线中文| 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲真实伦在线观看| 免费观看人在逋| 亚洲男人的天堂狠狠| 国产精品久久久久久久电影| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 女人被狂操c到高潮| 少妇高潮的动态图| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产视频内射| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产精品,欧美在线| 成人性生交大片免费视频hd| 亚洲国产精品合色在线| 88av欧美| 老司机福利观看| 在线观看免费视频日本深夜| 成人特级av手机在线观看| 女人被狂操c到高潮| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 麻豆成人午夜福利视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 中亚洲国语对白在线视频| 亚洲五月天丁香| 男人和女人高潮做爰伦理| 精品无人区乱码1区二区| 婷婷丁香在线五月| 一本精品99久久精品77| 一个人看视频在线观看www免费| 久久精品人妻少妇| 欧美精品国产亚洲| 亚洲成人久久爱视频| 看黄色毛片网站| 精品人妻偷拍中文字幕| 精品久久国产蜜桃| 真人一进一出gif抽搐免费| 欧美日韩精品成人综合77777| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 亚洲人与动物交配视频| 精品日产1卡2卡| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 午夜老司机福利剧场| 午夜爱爱视频在线播放| 国产成人a区在线观看| 欧美三级亚洲精品| 香蕉av资源在线| 桃红色精品国产亚洲av| 久久人妻av系列| 在线a可以看的网站| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 一区福利在线观看| 长腿黑丝高跟| 嫩草影院入口| 欧美3d第一页| 国内精品一区二区在线观看| 长腿黑丝高跟| 国产av一区在线观看免费| 一区二区三区高清视频在线| 在线观看美女被高潮喷水网站| 久久精品国产鲁丝片午夜精品 | 人妻久久中文字幕网| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产精品久久电影中文字幕| 老熟妇仑乱视频hdxx| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 一级黄片播放器| 国产三级在线视频| 亚洲av.av天堂| 超碰av人人做人人爽久久| 亚洲欧美日韩高清专用| 人妻久久中文字幕网| 亚洲性久久影院| 日本与韩国留学比较| 99riav亚洲国产免费| 啦啦啦韩国在线观看视频| av国产免费在线观看| 日韩高清综合在线| 国内精品一区二区在线观看| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲第一电影网av| 亚洲欧美日韩无卡精品| 能在线免费观看的黄片| 亚洲av五月六月丁香网| 我要看日韩黄色一级片| 黄色丝袜av网址大全| 日本-黄色视频高清免费观看| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 国产精品精品国产色婷婷| 亚洲精品久久国产高清桃花| 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 99热只有精品国产| 精品日产1卡2卡| 22中文网久久字幕| 午夜免费激情av| 国产探花极品一区二区| 综合色av麻豆| 国产探花在线观看一区二区| 黄片wwwwww| 午夜激情欧美在线| 国产老妇女一区| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲在线自拍视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 三级毛片av免费| 欧美最新免费一区二区三区| 国产高清有码在线观看视频| 国产在线男女| 变态另类丝袜制服| 一本精品99久久精品77| 黄片wwwwww| 午夜激情福利司机影院| 国内精品美女久久久久久| 欧美在线一区亚洲| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 哪里可以看免费的av片| 国产综合懂色| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产中年淑女户外野战色| 一区二区三区激情视频| 欧美在线一区亚洲| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 亚洲av成人av| 亚洲av成人精品一区久久| 男人舔女人下体高潮全视频| 麻豆av噜噜一区二区三区| 亚洲成人久久性| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| av在线观看视频网站免费| 日韩亚洲欧美综合| 老熟妇乱子伦视频在线观看| av在线天堂中文字幕| 国产成人a区在线观看| 3wmmmm亚洲av在线观看| 亚洲欧美激情综合另类| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 97超视频在线观看视频| 91麻豆av在线| 一级a爱片免费观看的视频| 国产真实乱freesex| .国产精品久久| 日本免费a在线| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 美女黄网站色视频| 99热这里只有精品一区| 精华霜和精华液先用哪个| bbb黄色大片| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲黑人精品在线| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 欧美日本视频| 亚洲内射少妇av| 亚洲av不卡在线观看| .国产精品久久| 制服丝袜大香蕉在线| 看黄色毛片网站| 长腿黑丝高跟| 联通29元200g的流量卡| 亚洲18禁久久av| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 最新中文字幕久久久久| 如何舔出高潮| 91av网一区二区| 韩国av在线不卡| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国产精华一区二区三区| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 午夜福利在线观看吧| 一个人看视频在线观看www免费| 日韩强制内射视频| 亚洲中文日韩欧美视频| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 久久人妻av系列| 国产伦精品一区二区三区视频9| 99久国产av精品| 国产三级中文精品| 无人区码免费观看不卡| 中文字幕av成人在线电影| 99在线视频只有这里精品首页| 全区人妻精品视频| 久久国内精品自在自线图片| 日韩中文字幕欧美一区二区| 99久久精品国产国产毛片| 婷婷精品国产亚洲av| 一区二区三区四区激情视频 | 欧美最黄视频在线播放免费| 老司机福利观看| 国产真实伦视频高清在线观看 | 他把我摸到了高潮在线观看| 亚洲第一电影网av| 久久99热这里只有精品18| 如何舔出高潮| 在线观看一区二区三区| 国产久久久一区二区三区| 男人舔女人下体高潮全视频| 久久99热6这里只有精品| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 两个人视频免费观看高清| 十八禁国产超污无遮挡网站| 精品不卡国产一区二区三区| www.色视频.com| 日韩高清综合在线| 日本三级黄在线观看| 婷婷精品国产亚洲av| 哪里可以看免费的av片| 简卡轻食公司| 亚洲中文日韩欧美视频| av国产免费在线观看| 欧美zozozo另类| 久久久精品大字幕| 亚洲av中文av极速乱 | 国产精品亚洲美女久久久| 日本精品一区二区三区蜜桃| 性欧美人与动物交配| 国产极品精品免费视频能看的| 91久久精品国产一区二区三区| 国产亚洲欧美98| h日本视频在线播放| 热99在线观看视频| 一区二区三区四区激情视频 | 精品欧美国产一区二区三| 国产熟女欧美一区二区| 久久久色成人| 成人av一区二区三区在线看| 热99re8久久精品国产| 午夜福利高清视频| 少妇人妻精品综合一区二区 | 18+在线观看网站| 日韩欧美三级三区| 18禁在线播放成人免费| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 又紧又爽又黄一区二区| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 久久精品国产亚洲网站| 成人国产综合亚洲| 婷婷六月久久综合丁香| 成人av在线播放网站| 在线观看舔阴道视频| 热99在线观看视频| 亚洲人成伊人成综合网2020| 麻豆成人av在线观看| 99九九线精品视频在线观看视频| 黄色丝袜av网址大全| 婷婷精品国产亚洲av在线| 男人的好看免费观看在线视频| 国产欧美日韩精品一区二区| 日韩欧美精品v在线| 免费人成视频x8x8入口观看| 99久久成人亚洲精品观看| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 麻豆国产97在线/欧美| 国产精品野战在线观看| 欧美一区二区亚洲| 婷婷亚洲欧美| 亚洲欧美清纯卡通| 悠悠久久av| 一进一出抽搐动态| 国产精品无大码| 人妻久久中文字幕网| 草草在线视频免费看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 哪里可以看免费的av片| 在线观看舔阴道视频| 国产伦人伦偷精品视频| 波野结衣二区三区在线| 亚洲av免费高清在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| 免费在线观看成人毛片| 日韩中字成人| 国产av一区在线观看免费| 88av欧美| 久久久久久久久中文| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 不卡视频在线观看欧美| 欧美在线一区亚洲| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 国产精品爽爽va在线观看网站| 久久久久久九九精品二区国产| 亚洲精品日韩av片在线观看| 毛片女人毛片| 亚洲专区国产一区二区| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 久久久午夜欧美精品| 精品免费久久久久久久清纯| 日韩大尺度精品在线看网址| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 欧美又色又爽又黄视频| 亚洲熟妇熟女久久| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国产毛片a区久久久久| 精品久久久久久久久av| 日韩欧美在线二视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 精品久久久噜噜| 国产主播在线观看一区二区| 国内精品久久久久久久电影| 亚洲第一区二区三区不卡| 成人午夜高清在线视频| 伦精品一区二区三区| а√天堂www在线а√下载| 亚洲av五月六月丁香网| 在现免费观看毛片| av在线观看视频网站免费| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 精品乱码久久久久久99久播| 国产激情偷乱视频一区二区| 日本免费a在线| av福利片在线观看| 人妻少妇偷人精品九色| 色在线成人网| 欧美国产日韩亚洲一区| 精品久久久久久久久av| 伊人久久精品亚洲午夜| 日本一二三区视频观看| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 亚洲美女视频黄频| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产av不卡久久| 在线播放无遮挡| 亚洲黑人精品在线| 身体一侧抽搐| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| eeuss影院久久| 真实男女啪啪啪动态图| 一夜夜www| 亚洲最大成人中文| 禁无遮挡网站| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 免费高清视频大片| av在线亚洲专区| 中亚洲国语对白在线视频| 国产精品一区二区性色av| 亚洲成a人片在线一区二区| 热99在线观看视频| 欧美潮喷喷水| 亚洲欧美日韩卡通动漫| av在线蜜桃| 免费看av在线观看网站| 色吧在线观看| 91在线观看av| 欧美成人a在线观看| 成人av一区二区三区在线看| 99久国产av精品| 亚州av有码| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 18禁在线播放成人免费| 精品不卡国产一区二区三区| 国产中年淑女户外野战色| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产精品电影一区二区三区| 两个人视频免费观看高清| 国产极品精品免费视频能看的| 欧美色欧美亚洲另类二区| 热99在线观看视频| a级一级毛片免费在线观看| 岛国在线免费视频观看| 我的老师免费观看完整版| 男人狂女人下面高潮的视频| 深夜精品福利| 内射极品少妇av片p| 天天躁日日操中文字幕| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 午夜爱爱视频在线播放| 又粗又爽又猛毛片免费看| 夜夜夜夜夜久久久久| 欧美色欧美亚洲另类二区| 日本成人三级电影网站| 欧美zozozo另类| 国产精品1区2区在线观看.| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 亚洲欧美日韩高清专用| av在线蜜桃| 久久久国产成人免费| 成人毛片a级毛片在线播放| bbb黄色大片| 亚洲av中文av极速乱 | 国产探花在线观看一区二区| 十八禁网站免费在线| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 精品国产三级普通话版| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 午夜a级毛片| 别揉我奶头 嗯啊视频| 国产精品av视频在线免费观看| 久久精品国产鲁丝片午夜精品 | 可以在线观看毛片的网站| 天美传媒精品一区二区| 人妻夜夜爽99麻豆av| 男人狂女人下面高潮的视频| 久久人人爽人人爽人人片va| 日韩精品中文字幕看吧| av女优亚洲男人天堂| 精品久久久久久,| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 日韩欧美国产一区二区入口| 精品久久久久久久久亚洲 | 变态另类成人亚洲欧美熟女| 成年女人永久免费观看视频| 我要搜黄色片| av在线亚洲专区| 哪里可以看免费的av片| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲不卡免费看| 97超视频在线观看视频| a级一级毛片免费在线观看| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 亚洲精品456在线播放app | 无人区码免费观看不卡| 此物有八面人人有两片| 乱系列少妇在线播放| 国产三级中文精品| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产不卡一卡二| 国产在视频线在精品| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 男女边吃奶边做爰视频| 18+在线观看网站| 日韩av在线大香蕉| 日韩欧美国产一区二区入口| 最近最新中文字幕大全电影3| 偷拍熟女少妇极品色| 国内精品美女久久久久久| 中文字幕免费在线视频6| 丰满乱子伦码专区| 麻豆成人av在线观看| 成人鲁丝片一二三区免费| АⅤ资源中文在线天堂| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 免费在线观看成人毛片| 国产成年人精品一区二区| 黄色一级大片看看| 一级黄片播放器| 欧美黑人欧美精品刺激| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲人与动物交配视频| 国产精品,欧美在线| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 免费电影在线观看免费观看| 欧美精品啪啪一区二区三区| 三级毛片av免费| 亚洲av美国av| 亚洲欧美日韩东京热| 少妇人妻精品综合一区二区 | 一级黄色大片毛片| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 88av欧美| 国产黄片美女视频| 免费在线观看成人毛片| 十八禁网站免费在线| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 欧美丝袜亚洲另类 | 午夜日韩欧美国产| 亚洲最大成人手机在线| 男人舔女人下体高潮全视频| 在线观看舔阴道视频| 麻豆成人午夜福利视频|