基于Nrf2/HO-1信號(hào)通路的壽胎丸對(duì)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)大鼠的影響

申思楠 ，牟珍妮 ，唐麗 ，喬宗惠 ，雷磊

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410021

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）指在妊娠28周之前發(fā)生3次或3次以上的胎兒丟失，且隨著墮胎次數(shù)增加，復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)亦增加[1-3]。RSA病因復(fù)雜，常見(jiàn)原因有解剖異常、病原微生物感染、內(nèi)分泌代謝異常、自身免疫性疾病等，但50%以上的RSA無(wú)法明確其致病原因，稱(chēng)為原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（URSA）。目前認(rèn)為，URSA主要與免疫失衡有關(guān)[4-6]。在正常妊娠中，機(jī)體處于氧化與抗氧化平衡狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體活性氧（ROS）增多或抗氧化功能減弱時(shí)，氧化與抗氧化平衡被打破，導(dǎo)致流產(chǎn)發(fā)生[7-8]。核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）介導(dǎo)的信號(hào)通路是機(jī)體抗氧化應(yīng)激的重要通路，在維持機(jī)體氧化與抗氧化平衡中發(fā)揮重要作用[9]。

根據(jù)其臨床特點(diǎn)，RSA屬中醫(yī)學(xué)“滑胎”“數(shù)墮胎”范疇?；ヒ?jiàn)于《產(chǎn)經(jīng)》“治數(shù)落胎方：作大麥豉羹食之，即安胎。又方：取母衣帶三寸燒末，酒服即安”。其病機(jī)多為先天不足，腎氣虛損，以致不能蔭胎系胎；或脾虛中氣虧損，化源匱乏，不能攝養(yǎng)胎元。壽胎丸出自《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》，由炒菟絲子、桑寄生、續(xù)斷、阿膠組成，能補(bǔ)腎固沖安胎，為治療滑胎的經(jīng)典方。前期研究發(fā)現(xiàn)，壽胎丸可通過(guò)多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)發(fā)揮安胎功效[10-12]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，壽胎丸主要成分槲皮素可通過(guò)逆轉(zhuǎn)抗氧化酶表達(dá)、升高血紅素氧合酶1（HO-1）表達(dá)，促進(jìn)妊娠期抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少氧化應(yīng)激損傷[13]，這可能是其發(fā)揮安胎作用的機(jī)制之一。基于此，本研究從Nrf2/HO-1信號(hào)通路探討壽胎丸治療RSA的作用機(jī)制，為壽胎丸治療RSA提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雌性SD大鼠32只、雄性SD大鼠16只，7～8周齡，體質(zhì)量240～250 g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（湘）2019-0004。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房，溫度（22±2）℃，濕度50%±5%，12 h光暗交替。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（LL2020070104）。

1.2 藥物

壽胎丸（炒菟絲子6 g，桑寄生3 g，續(xù)斷3 g，阿膠3 g），飲片購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，由藥劑科主任戴冰教授鑒定為正品。地屈孕酮片，10 mg/片，批號(hào)364221，荷蘭Abbott Biologicals B.V.。米非司酮片，25 mg/片，批號(hào)190907，浙江仙琚制藥股份有限公司。羥基脲片，0.5 g/片，批號(hào)0E0483D05，齊魯制藥有限公司。以上藥物按前期方法[11]配制成相應(yīng)溶液。

1.3 主要試劑與儀器

蘇木素、伊紅染色液（北京中杉金橋，貨號(hào)分別為ZLI-9610、ZLI9613），ROS ELISA試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，貨號(hào)JL21051），RIPA裂解液（北京康為世紀(jì)，貨號(hào)CW2333S），蛋白酶抑制劑（北京康為世紀(jì)，貨號(hào)為CW2200S），磷酸酶抑制劑（北京康為世紀(jì)，貨號(hào)CW2383S），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（武漢伊萊瑞特，貨號(hào)E-BC-K318-M），Nrf2抗體（美國(guó)Affinity公司，貨號(hào)AF0639），HO-1抗體（美國(guó)Affinity公司，貨號(hào)AF5393），醌氧化還原酶1（NQO1）抗體（美國(guó)Affinity公司，貨號(hào)DF6437），GAPDH抗體（美國(guó)Affinity公司，貨號(hào)AF7021），超純總RNA提取試劑盒（杭州新景生物試劑開(kāi)發(fā)有限公司，貨號(hào)5003050），NovoScript?Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix（蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司，貨號(hào)E047），NovoStart?SYBR qPCR SuperMix Plus（蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司，貨號(hào)E096）。Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司），Heraeus Fresco 17超速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），Cytation 3多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司），T100TMThermal Cycler PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模、分組及給藥

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，參照文獻(xiàn)[14]方法建立RSA模型，將32只SD雌鼠和16只SD雄鼠合籠飼養(yǎng)過(guò)夜，次日早晨觀察雌鼠有無(wú)陰道栓脫落，并采集雌鼠陰道分泌物進(jìn)行涂片，當(dāng)觀察到雌鼠有陰道栓脫落且陰道分泌物涂片在顯微鏡下可見(jiàn)大量精子時(shí)將其作為妊娠第0日。將32只孕鼠隨機(jī)分為正常妊娠組、模型組、地屈孕酮組和壽胎丸組，每組8只。模型組、地屈孕酮組和壽胎丸組妊娠第1～9日下午予羥基脲溶液450 mg/kg灌胃，妊娠第10日上午予米非司酮溶液4.0 mg/kg灌胃；同時(shí)，妊娠第1～9日上午，壽胎丸組予壽胎丸藥液0.5 g/kg灌胃，地屈孕酮組予地屈孕酮溶液3.02 mg/kg灌胃，模型組和正常妊娠組予等量生理鹽水灌胃。

2.2 取材

米非司酮溶液灌胃2 h后，稱(chēng)量大鼠體質(zhì)量，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血后脫頸處死大鼠，分離子宮。于子宮角處鈍性分離子宮壁，將胚胎及胎盤(pán)從著床位置剝離，用眼科剪將著床部位蛻膜組織剪下，PBS漂洗后吸干水分，一部分置于4%多聚甲醛中固定，剩余部分以液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 子宮臟器指數(shù)

取出子宮，預(yù)冷PBS清洗干凈，吸水紙吸干水分，稱(chēng)量子宮質(zhì)量，計(jì)算子宮臟器指數(shù)（子宮質(zhì)量÷體質(zhì)量×100%）。

2.3.2 胚胎丟失率

參照文獻(xiàn)[15]方法，取出子宮組織，觀察胚胎發(fā)育情況，計(jì)算胚胎丟失率（丟失胚胎數(shù)÷胚胎總數(shù)×100%）。

2.3.3 HE染色

取出多聚甲醛固定的蛻膜組織，脫水、包埋后制成4 μm石蠟切片，切片脫蠟復(fù)水，蘇木素浸染5 min，1%鹽酸酒精分化3 s，流水返藍(lán)1 h，烘干，伊紅浸染3 min，經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明后，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。

2.3.4 ELISA檢測(cè)

將全血3 000 r/min離心20 min（離心半徑6 cm），取上層血清，按ELISA試劑盒說(shuō)明步驟操作，以空白孔調(diào)零，波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定各孔吸光度（OD值），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算ROS含量。

2.3.5 Western blot檢測(cè)

取蛻膜組織，加入RIPA裂解液，勻漿、研磨提取總蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度為2 μg/μL。配制10%分離膠，每孔10 μL蛋白上樣，凝膠電泳分離（80 V、120 min），200 mA轉(zhuǎn)膜90 min，5%脫脂奶粉室溫孵育1 h，TBST漂洗3次，滴加Nrf2、HO-1、NQO1一抗（均為1∶2 000）和GAPDH一抗（1∶20 000），4 ℃孵育過(guò)夜。TBST漂洗3次，滴加二抗（1∶10 000），37 ℃孵育 h，TBST漂洗3次，ECL顯影液顯影，凝膠成像系統(tǒng)成像，用Image Lab 6.0.1軟件分析目的蛋白灰度值。

2.3.6 RT-qPCR檢測(cè)

使用超純總RNA提取試劑盒提取蛻膜組織總RNA，測(cè)定RNA濃度及純度后，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，配制RT-qPCR反應(yīng)體系：NovoStart?SYBR qPCR SuperMix Plus 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，加DEPC水至總體積20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃、20s，60 ℃、1 min，共40個(gè)循環(huán)；95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。引物由北京擎科生物科技有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 壽胎丸對(duì)模型大鼠子宮臟器指數(shù)的影響

與正常妊娠組比較，模型組大鼠子宮臟器指數(shù)顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，壽胎丸組大鼠子宮臟器指數(shù)顯著升高（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠子宮臟器指數(shù)比較（±s，%）

表2 各組大鼠子宮臟器指數(shù)比較（±s，%）

注：與正常妊娠組比較，★★P<0.01；與模型組比較，*P<0.05

組別正常妊娠組模型組地屈孕酮組壽胎丸組只數(shù)8 8 8 8子宮臟器指數(shù)1.37±0.20 0.69±0.16★★1.09±0.12 1.27±0.15*

3.2 壽胎丸對(duì)模型大鼠胚胎丟失率的影響

與正常妊娠組比較，模型組大鼠胚胎丟失率顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，地屈孕酮組和壽胎丸組大鼠胚胎丟失率顯著降低（P<0.05）。壽胎丸組與地屈孕酮組胚胎丟失率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠胚胎丟失率比較（±s，%）

表3 各組大鼠胚胎丟失率比較（±s，%）

注：與正常妊娠組比較，★★P<0.01；與模型組比較，*P<0.05

組別正常妊娠組模型組地屈孕酮組壽胎丸組只數(shù)8 8 8 8胚胎丟失率12.56± 5.35 72.09±19.98★★30.57±14.93*22.38± 4.10*

3.3 壽胎丸對(duì)模型大鼠蛻膜組織病理形態(tài)的影響

正常妊娠組大鼠蛻膜細(xì)胞排列緊密，胞質(zhì)豐富、呈紅色，細(xì)胞核呈卵圓形，核仁大而明顯、呈藍(lán)紫色，間質(zhì)血管豐富，管壁完整；模型組大鼠蛻膜細(xì)胞胞漿水腫，部分細(xì)胞核消失，間質(zhì)血管分布減少；地屈孕酮組較模型組有所改善，但仍可見(jiàn)部分蛻膜細(xì)胞胞漿水腫，間質(zhì)血管分布較少、管壁完整；壽胎丸組大鼠蛻膜細(xì)胞核形態(tài)更趨于正常妊娠組，細(xì)胞核基本無(wú)固縮、消失、壞死。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠蛻膜組織形態(tài)（HE染色）

3.4 壽胎丸對(duì)模型大鼠血清活性氧含量的影響

與正常妊娠組比較，模型組大鼠血清ROS含量顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，地屈孕酮組和壽胎丸組大鼠血清ROS含量顯著減少（P<0.05，P<0.01）；與地屈孕酮組比較，壽胎丸組大鼠血清ROS含量顯著減少（P<0.01）。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠血清ROS含量比較（±s，U/L）

表4 各組大鼠血清ROS含量比較（±s，U/L）

注：與正常妊娠組比較，★★P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與地屈孕酮組比較，▲▲P<0.01

組別正常妊娠組模型組地屈孕酮組壽胎丸組只數(shù)6 6 6 6 ROS 8.61±2.12 36.56±4.36★★31.32±6.53*15.29±2.73**▲▲

3.5 壽胎丸對(duì)模型大鼠蛻膜組織核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2、血紅素氧合酶1、醌氧化還原酶1蛋白表達(dá)的影響

與正常妊娠組比較，模型組大鼠蛻膜組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.01，P<0.05）；與模型組比較，壽胎丸組大鼠蛻膜組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.05，P<0.01），地屈孕酮組大鼠蛻膜組織Nrf2、NQO1蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.05）。見(jiàn)圖2、表5。

圖2 各組大鼠蛻膜組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白免疫印跡

表5 各組大鼠蛻膜組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)比較（±s）

表5 各組大鼠蛻膜組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與正常妊娠組比較，★P<0.05，★★P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別正常妊娠組模型組地屈孕酮組壽胎丸組只數(shù)3 3 3 3 Nrf2/GAPDH 1.05±0.16 0.37±0.05★★0.91±0.12*0.88±0.13*HO-1/GAPDH 1.17±0.07 0.44±0.10★★0.51±0.11 1.05±0.17**NQO1/GAPDH 0.79±0.15 0.46±0.04★0.88±0.16*1.04±0.25**

3.6 壽胎丸對(duì)模型大鼠蛻膜組織核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2、血紅素氧合酶1、醌氧化還原酶1 mRNA表達(dá)的影響

與正常妊娠組比較，模型組大鼠蛻膜組織Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA表達(dá)顯著降低（P<0.01，P<0.05）；與模型組比較，地屈孕酮組和壽胎丸組大鼠蛻膜組織Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.05，P<0.01）。見(jiàn)表6。

表6 各組大鼠蛻膜組織Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA表達(dá)比較（±s）

表6 各組大鼠蛻膜組織Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與正常妊娠組比較，★P<0.05，★★P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別正常妊娠組模型組地屈孕酮組壽胎丸組只數(shù)3 3 3 3 Nrf2 1.00±0.01 0.64±0.10★★0.78±0.08*0.89±0.03**HO-1 1.01±0.16 0.08±0.01★0.26±0.01**0.77±0.06**NQO1 1.00±0.08 0.66±0.01★★1.00±0.10**1.06±0.05**

4 討論

腎主生殖，“胞絡(luò)者系于腎”（《素問(wèn)·奇病論篇》），腎為先天之本，藏精，主生殖，胚胎的正常發(fā)育離不開(kāi)腎精的滋養(yǎng)和腎氣的固護(hù)。壽胎丸君藥菟絲子陰中有陽(yáng)，守而能走，補(bǔ)腎養(yǎng)精，益陰而固陽(yáng)；臣藥桑寄生補(bǔ)肝腎，養(yǎng)血而固沖任，安胎；續(xù)斷補(bǔ)益肝腎，調(diào)理沖任，有固本安胎之功；阿膠補(bǔ)血滋陰，使沖任血旺，則胎氣自固。四藥合用，以補(bǔ)腎益精為主，養(yǎng)血滋陰，腎氣充足亦可推動(dòng)脾的運(yùn)化，脾旺則水谷運(yùn)化正常，水谷之精亦可滋養(yǎng)腎精，使腎氣充盛，血海充盈，沖任通利，胎氣得固。

RSA發(fā)生與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。當(dāng)氧化應(yīng)激產(chǎn)物堆積時(shí)，機(jī)體的蛋白質(zhì)合成受到抑制，血管內(nèi)皮損傷，影響胚胎正常著床[16]。此外，ROS過(guò)度堆積還會(huì)影響卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育，增加流產(chǎn)發(fā)生率[17]。ROS是細(xì)胞代謝的正常產(chǎn)物，主要在線(xiàn)粒體內(nèi)膜上的電子傳遞鏈中產(chǎn)生，在維持細(xì)胞增殖和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起關(guān)鍵作用[18-19]。正常生理狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和消除保持一定平衡，當(dāng)ROS在體內(nèi)過(guò)度累積則會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷[20-22]。內(nèi)外環(huán)境刺激導(dǎo)致ROS過(guò)量產(chǎn)生時(shí)，Nrf2被激活并易位到細(xì)胞核，識(shí)別并激活抗氧化反應(yīng)元件，進(jìn)而誘導(dǎo)下游NQO1、HO-1等抗氧化蛋白表達(dá)以對(duì)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)[23]。Nrf2是維持細(xì)胞氧化還原平衡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子和Ⅱ相解毒酶的主要轉(zhuǎn)錄因子[24-25]。HO-1和NQO1是體內(nèi)重要的抗氧化劑和Ⅱ相解毒酶，在體內(nèi)發(fā)揮重要的抗氧化作用[26]。NQO1同時(shí)也是輔酶Q和維生素E的還原酶，可通過(guò)維持輔酶Q和維生素E的還原狀態(tài)發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用[27]。Nrf2信號(hào)通路是機(jī)體重要的抗氧化應(yīng)激通路，對(duì)妊娠早期機(jī)體發(fā)生的氧化損傷具有保護(hù)作用，通過(guò)促進(jìn)下游基因HO-1表達(dá)防止流產(chǎn)發(fā)生[28-29]。Luan等[8]發(fā)現(xiàn)，激活Nrf2/HO-1通路可以抑制流產(chǎn)患者絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。

本研究中，模型組大鼠胚胎丟失率顯著升高，子宮臟器指數(shù)顯著降低，蛻膜組織可見(jiàn)細(xì)胞核消失、胞漿水腫、血管分布減少，提示RSA大鼠模型制備成功。壽胎丸治療能明顯降低模型大鼠胚胎丟失率，改善蛻膜組織病理形態(tài)，降低血清ROS含量，促進(jìn)蛻膜組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白和mRNA表達(dá)，提示壽胎丸可能通過(guò)激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路，使氧化-抗氧化系統(tǒng)恢復(fù)平衡狀態(tài)，發(fā)揮安胎作用。本研究結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明Nrf2/HO-1信號(hào)通路在RSA中的重要作用，以及壽胎丸治療RSA的作用機(jī)制。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將繼續(xù)對(duì)該通路下游抗氧化蛋白進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步明確其作用靶點(diǎn)，為壽胎丸的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。