黃秋葵多糖提取、分離純化及結(jié)構(gòu)分析方法研究進(jìn)展

王小秋， 仇亮， 翟彩嬌， 宋益民， 程玉靜， 劉水東

(江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所， 江蘇 南通 226012)

黃秋葵[Abelmoschusesculentus(L.)Moecnc]，為錦葵目、錦葵科、秋葵屬一年生草本植物。黃秋葵別名眾多，最為大眾熟知的有羊角豆、秋葵。對于黃秋葵起源于非洲還是印度，學(xué)者們略有爭議[1]。但毋庸置疑的是，黃秋葵作為日常生活中常見的蔬菜，烹飪方法多種多樣，還可制作成果干和飲品等[2-4]，受到人們的普遍喜愛。黃秋葵嫩果中富含碳水化合物、膳食纖維、蛋白質(zhì)以及鈣、鎂等微量元素和維生素[5]，幾乎沒有脂肪[6]，很適合運動健身、減脂降糖的人食用。作為短日照作物，黃秋葵主要種植在熱帶以及亞熱帶國家和地區(qū)，如泰國、印度、中東以及美國南部[7]。在國內(nèi)，黃秋葵在四川、福建、江蘇、浙江、山東以及安徽等地區(qū)都可種植。黃秋葵屬典型的藥食同源蔬菜，大量的體內(nèi)和體外研究表明，食用其花、果對一些常見的慢性病，如糖尿病、高血壓、高血脂、腸胃疾病等具有治療和緩解作用，另外還具有抗腫瘤、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等功效[8-9]。而黃秋葵具有上述列舉的功效和其含有的化合物——多糖有關(guān)。

多糖在植物界和生物界中分布廣泛，作為生命體三大物質(zhì)之一，在自然界中有著重要的作用和地位。黃秋葵嫩莢含有的黏液，研究證實為果膠類多糖，也為黃秋葵多糖的主要類型，其主要成分為半乳糖、鼠李糖和半乳糖醛酸[10]。黃秋葵多糖作為天然的植物多糖具有較好的生物活性，如抗氧化、抗癌、降血脂、提高機(jī)體免疫力[11-15]、抗糖尿病，尤其在緩解二型糖尿病癥狀方面具有顯著效果[16]。Yan等[17]通過體外實驗發(fā)現(xiàn)黃秋葵多糖還具有一定的抗抑郁效果。另外，黃秋葵多糖還可作為保濕劑添加材料[18]、污水處理材料[19]，在食品和制藥工業(yè)中用作增稠劑、穩(wěn)定乳劑、懸浮劑和黏合劑等[20-21]。多糖的提取、純化分離以及結(jié)構(gòu)特性研究是開展多糖生物活性、功能和應(yīng)用研究的第一步。多項研究表明，當(dāng)選擇不同的提取、純化分離方法時，所得到的多糖在單糖組成、多糖結(jié)構(gòu)上會有不同的結(jié)果，而這往往會直接影響多糖的生物活性。因此，本文對黃秋葵多糖的提取、分離純化和結(jié)構(gòu)分析方法進(jìn)行了搜集整理，以期對今后黃秋葵多糖的研究提供參考。

1 多糖提取工藝

人們從很早開始就意識到多糖對于人體的重要性和價值，對于多糖的提取工藝一直在不斷探索和優(yōu)化中。提取是多糖研究工作的前期工序，目前多糖提取方法多樣，主要可分為3種類型：1)溶劑提取法。包括熱水浸提法、酸提法和堿提法；2)儀器輔助提取法。有微波法、超聲法、超高壓輔助提法；3)生物提取法。主要是酶提取法。不同的提取方法在提取率、多糖組成和多糖活性方面存在較大差異[22]。多糖在熱水中具有很高的溶解性和穩(wěn)定性。通過熱水浸提法提取時，操作便利，但是耗時較長，一般需要花費2 h以上，有些條件下更長[23]。盡管在提取率上有時也有較好的表現(xiàn)，但耗時較長，在實際的工業(yè)生產(chǎn)中勢必會降低效率和增加成本。同時有不少的研究表明，一些碳水化合物成分如多糖經(jīng)過熱水沸煮后，會造成多糖含量的大量損失(損失率可達(dá)到72.4%～78.2%)[24]。一些在熱水中溶解度較低的多糖，可選擇酸性或堿性試劑進(jìn)行提取。但在該方法下獲得的多糖，在結(jié)構(gòu)以及生物活性上都會有一定的改變[25]。在選取單一的提取方法時，以微波輔助法和超聲波輔助提取法的多糖提取率較高。在此方法下一般提取率可以達(dá)到20%[26-27]，提取時間在20～60 min。當(dāng)兩者結(jié)合或與其他方法協(xié)同作用時，效果更佳。于梅等[28]在微波2 min、超聲波14 min下，獲得秋葵多糖提取率27.68%±0.42%。超聲波輔助法與熱水浸提法相結(jié)合時，甚至可以達(dá)到近30%的提取率[29]。利用纖維素酶等生物酶將破壞植物細(xì)胞壁，使得內(nèi)容物溢出，進(jìn)而利用提取劑對多糖進(jìn)行提取是植物多糖提取的特有方式。生物酶高效的生物活性、溫和的反應(yīng)條件、便捷的操作方式以及低廉的成本，使得該方法也不失為多糖提取方法的良好選擇。孟楠等[30]將能分解植物細(xì)胞壁中大量纖維素的專一酶——纖維素酶加入到秋葵勻漿中，探索最佳的高多糖提取率反應(yīng)條件。最終獲得在酶濃度0.5%，提取時間2 h，提取溫度60 ℃，底物濃度10%條件下，多糖得率達(dá)到了81.06%。雍成文等[31]利用纖維素酶和果膠酶制備復(fù)合酶提取黃秋葵多糖，縮短了提取時間，這在工業(yè)應(yīng)用中可節(jié)約時間成本。對于多糖的提取，無論是采用化學(xué)、物理和生物或其他方法，其原理與目的都在于破壞植物細(xì)胞，使得多糖物質(zhì)擴(kuò)散到提取溶劑中，進(jìn)而進(jìn)行提取純化[21]。但由于多糖的復(fù)雜性，每種多糖提取方法中條件的變化都會影響最終多糖的提取率，以及多糖組成、結(jié)構(gòu)以及生物活性。目前，熱水浸提法、微波或超聲波輔助法在黃秋葵多糖提取中使用頻率較高，同時將兩種或多種方法相結(jié)合提取多糖也是大多數(shù)研究人員的選擇。

2 多糖的分離純化

無論通過哪種提取方法，最終都無法直接獲得純多糖。在粗多糖中還會含有如無機(jī)鹽、低聚糖、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等物質(zhì)。因此，若想要進(jìn)一步對多糖的結(jié)構(gòu)以及生物活性進(jìn)行分析鑒定，還需要對粗多糖進(jìn)行分離純化。

2.1 脫蛋白

通過Sevage法、三氯乙酸法(tricarboxylic acid, TCA)、酶解法等可對多糖中的蛋白進(jìn)行脫除。蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑以及酸性溶劑中時，由于天然構(gòu)象遭到破壞，生物活性喪失易發(fā)生變性形成沉淀，Sevage法和TCA法正是利用了蛋白質(zhì)這一特性，將游離蛋白變性成為不溶物質(zhì)，經(jīng)離心分離去除，達(dá)到去除蛋白目的[32]。Sevage法較為溫和，對多糖結(jié)構(gòu)影響小，但每次僅能除去少量蛋白，需經(jīng)過多次重復(fù)才能達(dá)到理想的效果，嚴(yán)重影響效率。胡日查等[33]使用該方法對黃秋葵粗多糖進(jìn)行脫蛋白處理，結(jié)果顯示，Sevage法可降低黃秋葵多糖的蛋白質(zhì)含量，但脫蛋白多糖中蛋白含量相比于未處理時只減少了1.7百分點(未脫蛋白黃秋葵粗多糖中蛋白質(zhì)含量為6.3%；經(jīng)過Sevage法脫蛋白后多糖中蛋白質(zhì)含量為4.6%)。且在脫蛋白過程中，部分蛋白質(zhì)會與多糖形成復(fù)合物一同形成沉淀被除去，造成樣品損失。同時一些與多糖黏結(jié)牢固或被多糖包裹的蛋白，利用該方法也很難去除。利用部分蛋白酶特異性水解多糖中的某些蛋白質(zhì)也是多糖脫蛋白中的常用方法。劉小攀等[34]在黃精粗多糖中添加了木瓜蛋白酶進(jìn)行蛋白質(zhì)脫除，結(jié)果顯示，在實驗獲得的最優(yōu)工藝中，蛋白質(zhì)脫除率可達(dá)到71.23%，與此同時多糖損失率只有13.7%。高英春等[35]選擇胰蛋白酶對山藥粗多糖進(jìn)行分離純化，蛋白脫除率達(dá)到了88.7%，與此同時多糖保留率為93.1%。當(dāng)不同的酶按照一定比例進(jìn)行復(fù)合作用時，其效果會被顯著放大[36]。盡管目前有較多的多糖脫蛋白方法可供選擇，但是并沒有哪一種方法能夠達(dá)到既除去較大部分蛋白質(zhì)同時保證較高的多糖保留率的效果。在以上的方法中，Sevage法除蛋白效果高于TCA和酶解法[37]，但該方法多糖損失率較高，同時在操作過程中使用了有毒有機(jī)溶劑丙酮，會造成殘留，存在一定安全隱患。TCA法在蛋白質(zhì)清除效果和多糖保留率方面效果都比較良好，但使用的有機(jī)溶劑三氯乙酸為2B類致癌物(2017年10月27日世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布致癌物清單)，同樣存在一定的安全隱患。利用生物高效催化劑酶對蛋白進(jìn)行清除，條件溫和，在合適的溫度、pH值以及一定的時間內(nèi)可以對蛋白進(jìn)行最大可能的清除。但酶也存在另一不可忽視的特性——專一性。植物細(xì)胞中含有多種蛋白質(zhì)，僅僅只利用1～2種或少數(shù)幾種酶并不能達(dá)到較好的清除效果。而當(dāng)將多種酶復(fù)合使用時，要考慮到不同酶的反應(yīng)條件，此時并不能將酶的效應(yīng)發(fā)揮到最大。每種脫蛋白方法都存在各自的優(yōu)缺點，而將不同方法之間進(jìn)行組合應(yīng)用時，有時候可以發(fā)揮更好的效果。有研究表明，Sevage法+蛋白酶降解可明顯修正單獨使用Sevage法帶來的缺點，同時保持較高的多糖保留率[38]。TCA+胰蛋白酶組合使用時，山藥粗多糖蛋白脫除率和多糖保留率分別可以達(dá)到87.25%和92.48%[39]。盡管Sevage方法在多糖保留率和蛋白去除效果上并沒有較好的表現(xiàn)，但是由于其操作簡單且不容易造成多糖結(jié)構(gòu)改變，將其與酶法或者TCA法聯(lián)合使用既省時，同時也能保證一定的脫蛋白效果，在目前仍是多糖尤其在黃秋葵多糖脫蛋白方法中的主要選擇。

2.2 脫色素

粗多糖中除含有大部分蛋白質(zhì)外，還含有色素?？赏ㄟ^降解或者吸附將色素脫除。H2O2法利用在熱或光條件下H2O2分解釋放的氧與色素發(fā)生反應(yīng)，破壞色素物質(zhì)。在該方法中要注意溫度、溶液、pH值、時間、用量等對脫色素效果的影響。H2O2作為一種強(qiáng)氧化劑可直接將色素氧化，但在使用的量上難以把握精準(zhǔn)控制，過少時無法達(dá)到脫色目的，過多則會破壞多糖結(jié)構(gòu)[40]。通過吸附作用去除色素的方法有活性炭法、大孔樹脂法等。活性炭是熟知的吸附材料，由含碳材料制作而成，內(nèi)部空隙結(jié)構(gòu)發(fā)達(dá)、比表面積大，內(nèi)部有微小的細(xì)孔——毛細(xì)管，吸附能力極強(qiáng)。將活性炭在多糖脫色素應(yīng)用時，不會造成多糖結(jié)構(gòu)的破壞，但由于只是對物質(zhì)表面進(jìn)行物理吸附，因此，在吸附色素的同時不可避免地也會有部分多糖一同被吸附，造成多糖損失[41]。同時活性炭殘留難以除凈，會直接影響后續(xù)的分析。樹脂脫色作為近年新發(fā)展起來的脫色手段，具有脫色范圍廣、能力強(qiáng)、容量高、可重復(fù)使用等優(yōu)點，尤其在工業(yè)化生產(chǎn)中有較多應(yīng)用。大孔樹脂通過物理吸附從溶液中有選擇性地吸附有機(jī)物質(zhì)，從而達(dá)到分離提純目的。針對不同植物色素有多種樹脂類型可供選擇。目前樹脂類型有AmberliteXAD系列(美國Rohm和Haas公司生產(chǎn))、DiaionHP系列(日本三菱化成工業(yè)公司生產(chǎn))、D系列(中國南開大學(xué)生產(chǎn))、HPD系列(中國滄州寶恩生產(chǎn))等。在實驗中可根據(jù)需要選擇合適的樹脂類型，同時對影響吸附效果的因素如pH值、溫度、樹脂投入比等進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到最優(yōu)效果[42]。張叢叢等[43]優(yōu)化了大孔樹脂HP-20對黃秋葵多糖脫色的工藝條件：上樣質(zhì)量濃度為9.8 mg·mL-1、pH為6.0、溫度 20 ℃、時間7 h。對此優(yōu)化條件進(jìn)行驗證，脫色率為 91.07%，平均多糖保留率為 85.52%。王維香等[44]比較了過氧化氫、活性炭和8種型號大孔吸附樹脂對川赤芍多糖的脫色能力。結(jié)果顯示，三種方法中以大孔吸附樹脂效果最佳，且其中S-8型號大孔吸附樹脂多糖回收率達(dá)到了93.0%，脫色率達(dá)到了92.7%，同時保證了高多糖回收率和脫色率。其他方法如Al2O3法[45]、反膠束法(reversed micelles)[46]、靜態(tài)混合器法[47]、聚酰胺吸附法等[48-49]，在多糖脫色研究中也有所報道。

在多糖純化工藝中，通常將脫蛋白和脫色素兩個步驟分開操作。目前有研究人員探索了只經(jīng)過一次操作同時實現(xiàn)脫蛋白和脫色素的方法。李貴森等[50]用乙醇-硫酸銨雙水相體系萃取法，實驗結(jié)果證明：當(dāng)乙醇質(zhì)量濃度為 28%，硫酸銨質(zhì)量濃度為 18%，pH 為 6.8 時，秋葵莖多糖回收率可達(dá)83.75%，脫蛋白率為 57.92%，脫色率為 63.28%。Wang等[51]在雙水相之上增加了叔丁醇(three-phase partitioning，TPP)，并結(jié)合硫酸銨梯度無溶劑沉淀(gradient non-solvent precipitation，GNP)進(jìn)行黃秋葵果莢多糖分離純化，經(jīng)50%濃度硫酸銨沉淀得到的多糖蛋白質(zhì)殘留率顯著低于使用30%和40%濃度硫酸銨以及未經(jīng)過硫酸銨沉淀的多糖蛋白質(zhì)殘留率，且獲得的多糖表現(xiàn)出更高的氧化活性。這些實例說明，在將來很有可能會出現(xiàn)更簡便、更高效、更安全的工藝用于多糖的提取與純化。

2.3 多糖分離

在對多糖進(jìn)行初步的分離提純之后，獲得的多糖為不同類型多糖的混合物，而往往具有生物活性的為單一組分的多糖，因此，有必要進(jìn)行進(jìn)一步地分離[52]。根據(jù)多糖性質(zhì)的不同，可用多種方法將多糖進(jìn)行分級，方法主要分為沉淀法、柱層析技術(shù)法和膜分離法三大類。不同類型多糖因分子量和結(jié)構(gòu)的差異，在乙醇、丙酮、三氯乙酸等有機(jī)溶劑中的溶解度不同。當(dāng)在多糖水溶液中逐級提高有機(jī)溶劑濃度時，此時可以實現(xiàn)多糖按分子量從小到大沉淀，將沉淀收集并溶解，即可實現(xiàn)多糖分離。但該方法往往實現(xiàn)不了得到均一多糖的效果。長鏈季銨鹽為堿性表面活性劑，能與多糖溶液中以聚陰離子形式存在的酸性多糖形成不溶性配合物。相對分子質(zhì)量越大、酸性越強(qiáng)的多糖分子越容易形成沉淀，通過改變季銨鹽濃度即可分離出不同分子質(zhì)量的酸性多糖[53]。柱層析法是目前最為常用的多糖分級分離方法。主要分為兩類：一類為凝膠柱層析，如DEAE-葡聚糖凝膠(DEAE-Sephadex)和DEAE-瓊脂糖凝膠(DEAE-Sepharose)；另一類為離子交換層析，如DEAE-纖維素(DEAE cellulose)。兩者都是利用不同分子量多糖在層析柱中洗脫先后順序不同而進(jìn)行分級分離[54]。區(qū)別在于凝膠柱層析固定相為凝膠顆粒，在離子交換柱層析中為離子交換劑。在黃秋葵多糖分離中以使用DEAE纖維素-52較為常見。該離子交換柱為陰離子交換樹脂，柱子直徑一般為2.5～3.0 cm，流速一般在1 mL·min-1，柱子寬度在25～100 cm不等，流動相為純水和不同濃度的NaCl溶液。洗脫后獲得的多個組分經(jīng)吸光度值測定，觀察峰形數(shù)量確定為單一或多個組分[55]。DEAE-纖維素不僅可以用來分離粗多糖，而且還可以達(dá)到脫除色素的目的[52]。透析法的原理是利用半透膜的滲透作用和截留作用，將不可透析的大分子截留于膜內(nèi)，可透析的小分子經(jīng)擴(kuò)散作用不斷透出膜外，直到膜兩端濃度達(dá)到平衡。根據(jù)這兩個作用，針對性的開發(fā)出了相應(yīng)的多糖分離方法—透析和超濾。透析主要發(fā)揮了半透膜的滲透作用，小分子經(jīng)過半透膜從高濃度一側(cè)到達(dá)低濃度一側(cè)，從而實現(xiàn)濾液中大小分子的分離[23]。超濾則利用了半透膜的截留作用，在對濾液進(jìn)行加壓下，濾液中的小分子以及溶劑可經(jīng)過超濾膜，而大于膜孔徑的大分子物質(zhì)例如多糖則被攔截[56]。與通常所認(rèn)為的化合物純度標(biāo)準(zhǔn)不同的是，多糖的純度與其是否為單一多糖物質(zhì)之間并無直接關(guān)系。因為即便是多糖純品，也僅代表鏈長相近的多糖分子的平均分布，而通常所謂的多糖純品實際上也只是一定相對分子質(zhì)量范圍內(nèi)的相對均一組分[57]。因此，在經(jīng)過以上幾個脫蛋白、脫色素以及分級分離后所得到的多糖樣品仍是混合物。

3 多糖組成

多糖由單糖脫水縮合而成，可利用酸、醇等有機(jī)溶劑進(jìn)行水解，釋放單糖，而后經(jīng)過中和、過濾，利用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)[58]、氣相色譜法(gas chromatography, GC)[7]、質(zhì)譜法(mass spectrometry, MS)[7]以及核磁共振法(nuclear magnetic resonance，NMR)[59]等進(jìn)行分析。HPLC法高效、高速、高靈敏度、可反復(fù)使用，在黃秋葵多糖組分檢測中使用頻率極高。從已報道的文獻(xiàn)中可知，組成黃秋葵多糖的單糖有鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、木糖、葡萄糖醛酸以及半乳糖醛酸等，其中又主要以鼠李糖、半乳糖和半乳糖醛酸為主[10,60]。Sengkhampar等[60]采用熱水浸提法(hot buffer, HBSS)、螯合劑法(chelating agent, CHSS)和堿提法(dilute alkaline, DASS)三種方法提取黃秋葵果莢細(xì)胞壁多糖。發(fā)現(xiàn)三種方法獲得的多糖在單糖組成上存在較大差異。HBSS法和CHSS法中半乳糖、鼠李糖和半乳糖醛酸都占了極大比例，但在比例上三者比例前者為1.3∶1∶1.3，后者為4.5∶1.0∶1.2。在DASS法中除以上三種外還存在部分的阿拉伯糖。同樣利用這三種提取方法進(jìn)行黃秋葵果莢多糖中單糖組分分析時，周彥強(qiáng)等[61]得到了另一不同結(jié)果。說明不同的提取方法會影響多糖中單糖的組成，這在其他研究人員的結(jié)果中也得到了驗證[62]。在對黃秋葵其他組織多糖進(jìn)行分析時，Zhang等[55]發(fā)現(xiàn)，黃秋葵花多糖的單糖組成為半乳糖、鼠李糖和半乳糖醛酸，摩爾分子質(zhì)量比為0.86∶1∶1.02。吳慧玉[63]則只在黃秋葵花多糖中檢測到了半乳糖和鼠李糖。閔莉靜等[64-66]以黃秋葵種子多糖為分析對象，經(jīng)過分析分別得到由鼠李糖、阿拉伯糖、D-木糖、D-果糖、D-葡萄糖以及甘露糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和鼠李糖組成，后兩者分析的種子多糖組分結(jié)果相同，但在各單糖含量上不同。植物多糖遍布于植物全身，黃秋葵葉片[7,67]、莖稈[68]和純果皮[69]以及木質(zhì)化黃秋葵果莢[70]都有相關(guān)針對于多糖的研究報道。另外，黃秋葵果莢不同的干燥方式[71]以及對提取的多糖采用不同的干燥方式[72]也會對單糖組成與物質(zhì)的量的比造成一定影響，對多糖含量未見顯著差異[73]?？赡苁歉淖兞斯z分子以及支鏈的結(jié)構(gòu)，從而出現(xiàn)了上述的結(jié)果[74](表1)。

4 多糖結(jié)構(gòu)分析

黃秋葵多糖中的單糖主要以鼠李糖、半乳糖以及半乳糖醛酸為主，不同的單糖之間通過不同的糖苷鍵相連形成多糖鏈骨架，側(cè)鏈連接著不同基團(tuán)[94]。Whistle等[10]在黃秋葵果膠多糖的不完全酸水解產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了以Galα1→4Gal單元形成的半乳二糖晶體，首次揭開了黃秋葵多糖結(jié)構(gòu)的面紗?？偨Y(jié)大量的實驗結(jié)果可知，黃秋葵多糖主鏈上主要存在→4)-α-GalAp-(1→2)-α-L-Rhap-(1→單元重復(fù)，側(cè)鏈上主要存在β-Galp-(1→4)-β-Galp-1[95]。在之后的研究中發(fā)現(xiàn)還存在一種特殊的α鍵連接的鼠李糖-半乳糖交替單元[60]。Sengkhamparn等[60]利用三種提取方法HBSS、CHSS和DASS法對黃秋葵細(xì)胞壁多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。發(fā)現(xiàn)經(jīng)過HBSS和CHSS法得到的多糖主要為RGI(rhamnogalacturonan I, 鼠李半乳糖醛酸聚糖-I，RGI)，側(cè)鏈上主要為短半乳糖殘基；CHSS法則主要是HG(homogalacturonan，同型半乳糖醛酸聚糖，HG)，側(cè)鏈上桶為半乳糖殘基，但長度長于連接在RGI上的殘基，這兩種類型都屬于典型的果膠多糖[96]。RGI由多個重復(fù)鼠李半乳糖醛酸二糖(-4)-α-D-GalpA-(1,2)-α-L-Rhap-(1)構(gòu)成。在黃秋葵多糖中，通常其中的鼠李糖殘基有部分會被其他糖支鏈取代[97]。HG為主要由(1,4)-α-D-半乳糖醛酸共價連接的線性長鏈[98]。單糖與單糖以及單糖與側(cè)鏈間通過糖苷鍵相連，通過高碘酸氧化、Smith降解和甲基化等手段可以判斷出糖苷鍵的類型以及在鏈上的具體位置[64]。Bhat等[99]對獲得的只含有鼠李糖、半乳糖以及半乳糖醛酸的黃秋葵果膠多糖AP-1進(jìn)行Smith降解后，分析得出該組分主鏈主要是由(1→4)-D-半乳糖糖醛酸殘基與(1→2)L-鼠李糖殘基組成。對于單糖殘基上攜帶的官能團(tuán)(以O(shè)-H為主[100-102])，則可運用GC-HS[103]、GC-MS、HPLC進(jìn)行檢測[104]。方法原理為：先將官能團(tuán)甲基化，而后將其水解、還原以及乙酰化，對產(chǎn)物的種類進(jìn)行檢測分析推斷官能團(tuán)以及糖苷鍵類型[105]。目前還可以利用傅里葉紅外光譜儀(Fourier-transform infrared spectroscopy, FTIR)、核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)法等分析儀器與技術(shù)進(jìn)一步分析多糖的分子結(jié)構(gòu)和構(gòu)象，使得推斷糖殘基以及序列組成有了科學(xué)依據(jù)[59](表1)。Li等[92]利用FTIR對黃秋葵果皮多糖進(jìn)行分析，除發(fā)現(xiàn)了含有豐富的O-H和C-H外，還檢測到了C=O、C-OH、C-O-C以及COOH的存在。Chen等[86]在果莢多糖中除檢測到O-H、C-H外，還檢測到了S=O和吡喃糖的典型結(jié)構(gòu)C-O-C和C-O-H。NMR同時可對單糖的構(gòu)型進(jìn)行分析，是解析物質(zhì)結(jié)構(gòu)的有效手段。Liu等[77]利用以上方法，猜測黃秋葵果莢多糖可能存在的結(jié)構(gòu)為以→4)-D-GalpAMe-(1→2)-L-Rhap-(1→為主鏈。側(cè)鏈為Galp-β-D-(1→4)-Galp-β-D-(1→4)-Galp-β-D-(1→4)-Galp-β-D-(1→4)-Galp-β-D-(1→Araf-α-L-(1→6)-Galp-β-D-(1→4)-Galp-β-D-(1→4)-Galp-β-D-(1→4)-Galp-β-D-(1→。Liu等[79]在黃秋葵木質(zhì)化多糖中發(fā)現(xiàn)了→2)-α-D-Rhap-(1→,→4)-β-D-Galp-(1→,→4)-α-D-GalpA-(1→,→6)-β-D-Galp-(1→,β-D-Glcp-(1→和 α-L-Araf-(1→的結(jié)構(gòu)存在。多糖的結(jié)構(gòu)本身十分復(fù)雜，再加上不同的提取方法、條件[106]以及從不同組織提取[107]獲得的黃秋葵多糖在組成與結(jié)構(gòu)上也不盡相同。這讓分析多糖結(jié)構(gòu)，找出其中的規(guī)律與特點具有很大挑戰(zhàn)性。多糖作為天然的氧化劑，其生物活性主要與其組成和結(jié)構(gòu)息息相關(guān)[108]，因此，解析多糖結(jié)構(gòu)與其生物活性之間的關(guān)系一直是熱門話題。

表1 不同提取方法下黃秋葵多糖結(jié)構(gòu)

表1(續(xù))

表1(續(xù))

5 展望

黃秋葵營養(yǎng)豐富[109]，其獨特的黏液帶來異于其他蔬菜的口感，受到人們的喜愛，逐漸成為餐桌上的?？?。植物多糖作為天然的活性物質(zhì)，毒副作用小、來源廣泛[110]，是現(xiàn)代生活中優(yōu)質(zhì)多糖的來源。經(jīng)過大量的藥理和臨床研究已經(jīng)證實，多糖對生命活動起著重要的作用[111]。黃秋葵多糖因具有多種生物活性，除在醫(yī)藥保健領(lǐng)域中應(yīng)用外，目前在化工、食品等行業(yè)中也進(jìn)行了探索開發(fā)[112]。多糖的提取、分離純化以及結(jié)構(gòu)分析是開展多糖生物活性研究的前提。黃秋葵多糖提取方法多樣，但考慮到提取效果和盡量不破壞多糖結(jié)構(gòu)，目前主要以超聲波、微波輔助法和熱水浸提法為主。將提取的粗多糖經(jīng)過分離純化，進(jìn)行后續(xù)的組成與結(jié)構(gòu)分析，確定黃秋葵多糖主要以鼠李糖、半乳糖和半乳糖醛酸組成，多糖主鏈上主要存在→4)-α-GalAp-(1→2)-α-L-Rhap-(1→單元重復(fù)，側(cè)鏈上主要存在β-Galp-(1→4)-β-Galp-1[95]。盡管對于黃秋葵多糖的研究一直沒有間斷，但目前仍未將其結(jié)構(gòu)以及生物活性研究透徹。在今后的研究中，仍有一些問題有待解決：1)目前黃秋葵多糖提取方法有多種選擇，但是每種方法也都具有不可忽視的弊端，對于能否獲得更高提取率同時保證多糖生物活性不被破壞的提取方法仍需要不斷進(jìn)行探索與優(yōu)化；2)提取物中往往含有非多糖物質(zhì)，如何能夠盡可能除去也是一個值得深入研究的問題。尤其是能否找到一種方法或技術(shù)能夠?qū)⒎嵌嗵俏镔|(zhì)一次性去除，是在當(dāng)今追求效率和質(zhì)量并存下，值得探索的方向。同時在目前的方法中往往會使用到有毒或致癌試劑，能否找到更安全和綠色的純化分離方法也是需要解決的問題；3)多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，目前普遍認(rèn)為黃秋葵多糖的結(jié)構(gòu)為RGI類型，但也有不少的研究結(jié)果表明還存在其他的結(jié)構(gòu)，因此，對于黃秋葵多糖結(jié)構(gòu)的研究仍具有很大的空間；4)對于多糖結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系、參與體內(nèi)代謝的過程、作用機(jī)制以及在其他行業(yè)中的應(yīng)用已有了不少研究，但尚未能將其原理闡明，還需要更多方面的研究來對黃秋葵多糖涉及到結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系進(jìn)行闡明。找到解決上述問題的答案，更科學(xué)地將黃秋葵多糖應(yīng)用在生活生產(chǎn)中，是一項重要的現(xiàn)實課題。