黃瓜DIR家族基因的全基因組鑒定及其表達(dá)分析

張開(kāi)京，何帥帥，賈利，胡玉超，楊德坤，陸曉民，張其安，嚴(yán)從生?

1安徽科技學(xué)院農(nóng)學(xué)院，安徽鳳陽(yáng) 233100；2安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物種質(zhì)創(chuàng)制與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（部省共建）/園藝作物種質(zhì)創(chuàng)制及生理生態(tài)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230031

0 引言

【研究意義】Dirigent（DIR）基因家族廣泛存在于維管植物中，是參與木脂素及木質(zhì)素生物合成的一類關(guān)鍵基因，在植物防御反應(yīng)、次生代謝和抗病性等方面具有重要的作用[1-2]。黃瓜（Cucumis sativusL.）作為第一個(gè)完成基因組測(cè)序工作的蔬菜作物[3]，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展中占據(jù)著重要地位。通過(guò)在黃瓜全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行DIR基因家族的鑒定，并分析其在不同組織器官和脅迫響應(yīng)過(guò)程中的表達(dá)模式，以初步探明DIR基因家族在黃瓜應(yīng)答生物和非生物脅迫過(guò)程中所發(fā)揮的相關(guān)作用，為后續(xù)深入研究DIR基因在黃瓜中的功能奠定重要基礎(chǔ)，并為黃瓜抗性分子育種提供參考?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】DIR基因家族蛋白結(jié)構(gòu)均含有一個(gè)典型的 dirigent結(jié)構(gòu)域，但少數(shù)成員含有兩個(gè)串聯(lián)的dirigent結(jié)構(gòu)域[4]。植物DIR家族通常分為DIR-a、DIR-b/d、DIR-c、DIR-e、DIR-f和 DIR-g等 6個(gè)亞族[5]，研究表明，DIR-a亞族的一些成員直接參與了木脂素和木質(zhì)素的合成，參與細(xì)胞壁修飾，而關(guān)于其他DIR亞族的基因功能研究較少[6-7]。DIR蛋白最先在連翹中發(fā)現(xiàn)[8]，目前，已在許多重要植物中進(jìn)行了DIR蛋白家族的鑒定研究，如擬南芥[9]、水稻[10-11]、云杉[5]、白梨[12]、楊樹(shù)[13]、白菜[14]、辣椒[15]、草莓[16]、陸地棉[17]等，并發(fā)現(xiàn)DIR基因家族在響應(yīng)非生物脅迫和生物脅迫中發(fā)揮重要作用，如高溫[11,18]、冷害[11,14]、干旱[11,14,18-21]、鹽害[11,19,21]、重金屬[11]、H2O2[18-19]和病蟲(chóng)害[1,14,21-26]等，還受乙烯、JA、SA、ABA等信號(hào)分子的調(diào)控[14,18,21]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】利用黃瓜的高質(zhì)量基因組信息，已經(jīng)在黃瓜全基因組范圍內(nèi)開(kāi)展了大量的基因家族鑒定工作，如WRKY[27]、MADS-box[28]、NBS[29]、bZIP[30]等基因家族的鑒定。雖然有個(gè)別研究報(bào)道了黃瓜DIR家族基因的鑒定[21,31]，但其是基于黃瓜ChineseLong_V2版本基因組信息[3]進(jìn)行的分析，這就導(dǎo)致了黃瓜DIR家族基因的全基因組鑒定不完全，并且之前的研究沒(méi)有進(jìn)行黃瓜DIR家族基因在響應(yīng)生物脅迫和非生物脅迫過(guò)程中的表達(dá)模式分析，這極大地限制了DIR基因在黃瓜中的生物學(xué)功能研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究將利用生物信息學(xué)手段，在黃瓜 ChineseLong_V3版本基因組[32]中進(jìn)行全基因組范圍內(nèi)的DIR家族基因鑒定和分析；再基于黃瓜轉(zhuǎn)錄組測(cè)序大數(shù)據(jù)，利用黃瓜 ChineseLong_V3版本基因組信息，重新進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，完成黃瓜DIR基因家族的組織特異性表達(dá)分析以及在脅迫響應(yīng)過(guò)程中的表達(dá)模式分析，初步探明DIR家族基因在黃瓜生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的生物學(xué)功能，為后續(xù)黃瓜DIR基因功能的深入研究奠定重要基礎(chǔ)，并為黃瓜抗性分子育種提供有利基因。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2021年在安徽科技學(xué)院進(jìn)行。

1.1 黃瓜DIR家族基因鑒定與染色體定位

從Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)（http://pfam.xfam.org/）[33]中下載DIR基因家族的HMM模型文件（PF03018），從葫蘆科基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.icugi.org/）中下載黃瓜ChineseLong_V3蛋白組序列文件（http://cucurbitgenomics.org/ftp/genome/cucumber/Chinese_lon g/v3/），并構(gòu)建本地蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，利用HMMER軟件包[34]的hmmsearch程序從黃瓜蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出可能的DIR基因ID（E<1×10-5），利用Perl腳本提取候選蛋白的序列信息，并利用在線工具Pfam、SMART（http://smart.embl.de/smart/batch.pl）[35]對(duì)可能的DIR基因序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域驗(yàn)證，選擇含有Dirigent結(jié)構(gòu)域的序列，最終確定黃瓜中的DIR基因家族成員。根據(jù)擬南芥DIR基因家族鑒定研究結(jié)果[9]，從擬南芥基因組網(wǎng)站（https://www.arabidopsis.org/）中下載擬南芥DIR基因家族成員信息。利用在線工具 ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）分析黃瓜DIR基因家族成員的氨基酸數(shù)目、分子量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定性系數(shù)、脂肪系數(shù)、親水性平均值等理化特征。利用在線網(wǎng)站 CELLO（http://cello.life.nctu.edu.tw/）[36]對(duì)黃瓜中DIR基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。利用TBtools軟件[37]繪制黃瓜DIR基因家族在染色體上的分布圖。

1.2 黃瓜DIR家族基因特征分析與系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用在線工具GSDS（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）[38]分析黃瓜 DIR基因家族成員的結(jié)構(gòu)。利用在線軟件MEME（http://meme-suite.org/）[39]分析黃瓜 DIR 家族蛋白的保守基序（motif），參數(shù)設(shè)置為：保守基序個(gè)數(shù)為10，保守基序最佳匹配長(zhǎng)度為6—100。利用MEGA 11[40]軟件對(duì)擬南芥和黃瓜的 DIR家族基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，采用鄰接法，參數(shù)設(shè)置為：Poisson model, pairwise deletion, 1 000 bootstrap replications。利用在線網(wǎng)站 PlantCare（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）[41]分析黃瓜DIR基因家族成員啟動(dòng)子cis元件。

1.3 黃瓜DIR家族成員基因復(fù)制類型及共線性分析

利用MCScanX[42]軟件分析黃瓜DIR基因家族中的串聯(lián)重復(fù)基因和片段重復(fù)基因。為了解黃瓜DIR基因家族與擬南芥、水稻DIR基因家族的種間共線性關(guān)系，用MCScanX軟件對(duì)黃瓜、擬南芥、水稻DIR家族基因進(jìn)行共線性分析，使用 Circos軟件[43]可視化DIR基因家族在種間的共線性關(guān)系。

1.4 黃瓜轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)重新進(jìn)行RNA-seq分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中檢索到黃瓜相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，進(jìn)行下載，然后利用TBtools中的SRA to Fastq插件，將下載的sra數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成fastq數(shù)據(jù)，利用FastQC插件查看數(shù)據(jù)質(zhì)量，利用Trimmomatics插件去除接頭和低質(zhì)量序列，清理完原始數(shù)據(jù)后獲得clean data，再利用Hisat2-Build Index插件對(duì)黃瓜ChineseLong_V3版本基因組建立索引，利用 Hisat2-Align插件將過(guò)濾后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對(duì)到黃瓜 ChineseLong_V3版本基因組上，生成 bam文件，接著利用StringTie Quantify插件進(jìn)行基因表達(dá)量分析，最后，基于每個(gè)基因的counts數(shù)據(jù)，利用DESeq2插件完成差異表達(dá)基因的分析。

1.5 黃瓜DIR家族基因組織特異性表達(dá)分析

在 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中檢索黃瓜不同組織間的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序項(xiàng)目PRJNA80169[44]，利用黃瓜ChineseLong_V3版本基因組信息，重新進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，再利用 TBtools軟件繪制黃瓜DIR家族基因在黃瓜不同組織器官中的表達(dá)熱圖。

1.6 黃瓜 DIR家族基因在非生物脅迫和生物脅迫下的表達(dá)模式分析

在 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索黃瓜在高溫脅迫（PRJNA634519）[45]、低溫脅迫（PRJNA438923）、鹽和硅脅迫（PRJNA477930）[46]、霜霉?。≒RJNA285071）[47]、白粉?。≒RJNA321023）[48]、根結(jié)線蟲(chóng)脅迫（PRJNA419665）[49]處理下的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，基于黃瓜 ChineseLong_V3版本基因組信息，重新進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，利用TBtools軟件繪制黃瓜DIR家族基因在非生物脅迫和生物脅迫響應(yīng)過(guò)程中的表達(dá)熱圖，并根據(jù)不同處理中的差異表達(dá)基因結(jié)果篩選出每個(gè)處理中發(fā)生差異表達(dá)的黃瓜DIR基因。

2 結(jié)果

2.1 黃瓜DIR基因家族成員的基本信息

基于已公布的黃瓜 ChineseLong_V3基因組信息，利用生物信息學(xué)方法，在黃瓜全基因組范圍內(nèi)鑒定到23個(gè)DIR基因家族成員，基因CDS大小介于237—2 055 bp，編碼氨基酸數(shù)量在78—684，分子量大小為 8.70—73.82 kD，脂肪系數(shù)在 64.37—100.63。23個(gè)DIR蛋白的等電點(diǎn)理論值在4.31—10.08。除CsaV3_1G003540.1、CsaV3_1G010290.1、CsaV3_2G015830.1、CsaV3_5G006670.1、CsaV3_7G005610.1、CsaV3_7G005630.1和CsaV3_7G022920.1屬于不穩(wěn)定蛋白外（不穩(wěn)定性指數(shù)大于40），其余DIR基因的不穩(wěn)定性指數(shù)小于40，屬于穩(wěn)定蛋白。在23個(gè)DIR基因家族中，14個(gè)DIR基因的平均親水性小于零，表明它們是親水性蛋白；9個(gè)DIR基因的平均親水性大于零，表明它們是疏水蛋白。通過(guò)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)黃瓜DIR基因主要定位于質(zhì)膜、細(xì)胞外間隙、線粒體和葉綠體中（表1）。

表1 黃瓜23個(gè)DIR基因家族成員的理化特征Table 1 The physiochemical characteristics of 23 members in the cucumber DIR gene family

2.2 黃瓜DIR家族基因的染色體定位

根據(jù)黃瓜23個(gè)DIR家族基因的染色體定位分析，繪制DIR家族基因在黃瓜染色體上的分布圖（圖1）。黃瓜DIR家族基因在黃瓜的每條染色體上均有分布，其中4號(hào)染色體上的DIR基因最多，有7個(gè)DIR基因，其中CsaV3_4G006240/CsaV3_4G006250、CsaV3_4G023480/CsaV3_4G023490/CsaV3_4G023500/CsaV3_4G023510為串聯(lián)重復(fù)基因；6號(hào)染色體的DIR基因最少，僅有1個(gè)DIR基因；3號(hào)染色體上有2個(gè)DIR基因；7號(hào)染色體上有 4個(gè) DIR基因，其中CsaV3_7G003510和2號(hào)染色體上的CsaV3_2G034820為片段重復(fù)基因；其余染色體上分別各有3個(gè)DIR基因，2號(hào)染色體上的CsaV3_2G015820/CsaV3_2G015830、5號(hào)染色體上的CsaV3_5G006660/CsaV3_5G006670為串聯(lián)重復(fù)基因（圖1）。

圖1 黃瓜DIR家族基因在染色體上的分布Fig.1 The distribution of DIR gene family on cucumber chromosomes

2.3 黃瓜和擬南芥DIR家族基因聚類分析

為充分明確黃瓜DIR家族各基因間親緣關(guān)系與生物學(xué)功能，對(duì)鑒定到的黃瓜DIR家族基因和模式植物擬南芥的DIR家族基因成員進(jìn)行多序列比對(duì)分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖2）。依據(jù)擬南芥DIR家族基因的分類結(jié)果，發(fā)現(xiàn)進(jìn)化樹(shù)共分為3個(gè)亞族：a、b/d、e，其中b/d亞族中的DIR基因最多，共有29個(gè)；而a亞族中的DIR基因最少，只有10個(gè)；e家族中含有11個(gè)黃瓜 DIR基因。分析發(fā)現(xiàn)黃瓜與擬南芥的 DIR家族基因間存在 3對(duì)直系同源基因，即CsaV3_7G022920/AT5G42655、CsaV3_2G015820/AT2G21110和CsaV3_2G015830/AT2G21100，黃瓜DIR基因家族中存在5對(duì)旁系同源基因，分別是CsaV3_1G003540/CsaV3_4G023510、CsaV3_2G034820/CsaV3_7G003510、CsaV3_4G006240/CsaV3_4G006250、CsaV3_4G023480/CsaV3_4G023490、CsaV3_7G005610/CsaV3_3G005630，在進(jìn)化關(guān)系上比較相近的一類DIR基因在結(jié)構(gòu)和功能上均比較相似，可以根據(jù)模式植物擬南芥中相似基因的研究結(jié)果推測(cè)黃瓜中DIR基因的生物學(xué)功能。

圖2 黃瓜、擬南芥DIR家族基因聚類分析Fig.2 Phylogenetic analysis of DIR genes from cucumber and Arabidopsis

2.4 黃瓜DIR家族基因結(jié)構(gòu)與保守序列

利用TBtools軟件繪制黃瓜DIR家族基因聚類分析圖和結(jié)構(gòu)示意圖，發(fā)現(xiàn)黃瓜DIR基因家族可以分為3個(gè)亞族，即a、b/d、e亞族（圖3），與黃瓜、擬南芥 DIR基因聚類結(jié)果一致（圖 2），其中 b/d亞族中的黃瓜DIR基因最多，有14個(gè)；而a亞族中的DIR基因最少，只有4個(gè)；e家族中含有5個(gè)黃瓜DIR基因。根據(jù)黃瓜DIR家族基因的結(jié)構(gòu)示意圖，發(fā)現(xiàn)a亞族中的黃瓜DIR基因平均外顯子和內(nèi)含子個(gè)數(shù)最多，分別是3.75和2.75個(gè)，而e亞族中的黃瓜DIR基因平均外顯子和內(nèi)含子個(gè)數(shù)最少，分別是1.4和0.4個(gè)，b/d亞族中的黃瓜DIR基因平均具有 2.1個(gè)外顯子和 1.1個(gè)內(nèi)含子。利用在線軟件MEME對(duì)黃瓜中DIR蛋白進(jìn)行保守motif分析，共獲得10條motif（表2）。通過(guò)黃瓜DIR家族基因的結(jié)構(gòu)示意圖，發(fā)現(xiàn)不同亞族中的DIR蛋白保守序列不同，而相同亞族中的DIR蛋白具有相同的保守序列，例如在b/d亞族中，大多數(shù)基因都含有motif 3、1、4、2，且具有相同的排列順序，而在 e亞族中大多數(shù)基因都含有motif 3、1、2、10，且具有相同的排列順序，這說(shuō)明不同亞族中基序分布的不同導(dǎo)致其可能在進(jìn)化過(guò)程中出現(xiàn)了功能多樣性演變。同時(shí)，在相同亞族中DIR基因相似的保守基序表明其含有相似的功能。

表2 黃瓜DIR蛋白的基序信息Table 2 The motifs information of cucumber DIR proteins

圖3 黃瓜DIR家族基因結(jié)構(gòu)與保守序列示意圖Fig.3 Exon-intron structures of DIR genes and a schematic diagram of the amino acid motifs of DIR proteins in cucumber

2.5 黃瓜、擬南芥和水稻DIR家族基因共線性分析

對(duì)黃瓜與擬南芥、黃瓜與水稻中的DIR家族基因進(jìn)行共線性分析，發(fā)現(xiàn)黃瓜中有 12個(gè) DIR基因（CsaV3_1G003540、CsaV3_1G010290、CsaV3_2G015820、CsaV3_2G015830、CsaV3_3G011390、CsaV3_4G006220、CsaV3_4G023510、CsaV3_5G006670、CsaV3_5G026130、CsaV3_6G006930、CsaV3_7G005610、CsaV3_7G022920）與擬南芥中的19個(gè)DIR基因（AT1G22900、AT1G55210、AT1G56180、AT1G58170、AT1G64160、AT1G65870、AT2G21100、AT2G21110、AT2G28670、AT2G39430、AT3G13650、AT3G13662、AT3G24020、AT3G55230、AT3G58090、AT4G13580、AT4G23690、AT5G42500、AT5G49040）存在27種線性關(guān)系；黃瓜中有12個(gè)DIR 基因（CsaV3_1G003340、CsaV3_1G003540、CsaV3_2G015830、CsaV3_3G011390、CsaV3_4G006220、CsaV3_4G023500、CsaV3_4G023510、CsaV3_5G006670、CsaV3_5G026130、CsaV3_7G005610、CsaV3_7G005630、CsaV3_7G022920）與水稻中的 11個(gè) DIR基因（Os01g06250、Os02g07250、Os03g05030、Os03g17220、Os07g44450、Os07g44930、Os11g07680、Os11g07830、Os11g27620、Os11g42550、Os12g07580）存在19種線性關(guān)系。另外還有8個(gè)DIR基因（CsaV3_ 2G034820、CsaV3_3G015180、CsaV3_4G006240、CsaV3_4G006250、CsaV3_4G023480、CsaV3_4G023490、CsaV3_5G006660、CsaV3_7G003510）在黃瓜中較保守，既不與擬南芥中的DIR基因存在共線性，也不與水稻中的DIR基因存在共線性。對(duì)黃瓜中的DIR家族基因進(jìn)行共線性分析，發(fā)現(xiàn)僅有1對(duì)黃瓜DIR家族基因（CsaV3_2G034820/CsaV3_7G003510）存在線性關(guān)系（圖4）。

圖4 黃瓜、擬南芥、水稻中DIR家族基因的共線性關(guān)系Fig.4 Syntenic relationships of DIR gene family in cucumber, Arabidopsis and rice

2.6 黃瓜DIR家族基因啟動(dòng)子序列cis元件

在23個(gè)黃瓜DIR家族基因啟動(dòng)子序列中，共鑒定到14種不同的cis元件（圖5）。其中，與光響應(yīng)（lightresponsiveness）相關(guān)的cis元件是最多的一類cis元件，包括ACE、Box 4、G-box、I-box等，占總cis元件數(shù)目的51%。另外，還鑒定到一些其他cis元件，包括與激素（生長(zhǎng)素、赤霉素、水楊酸、脫落酸、MeJA）響應(yīng)，逆境（干旱、低溫）響應(yīng)，光周期調(diào)控，胚乳表達(dá)和分生組織表達(dá)等相關(guān)的cis元件。不同的DIR基因啟動(dòng)子區(qū)域存在不同的cis元件成員，表明黃瓜DIR基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮了多種功能。

圖5 黃瓜DIR家族基因啟動(dòng)子序列cis元件分析Fig.5 Cis-elements analysis of the promoters of cucumber DIR family genes

2.7 黃瓜DIR家族基因的組織特異性表達(dá)

基于已公布的黃瓜不同組織間的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)（PRJNA80169）[44]，利用黃瓜ChineseLong_V3版本基因組信息，重新進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，繪制黃瓜DIR家族基因在不同組織間的表達(dá)熱圖（圖 6），發(fā)現(xiàn)CsaV3_3G011390、CsaV3_3G015180、CsaV3_1G003540、CsaV3_4G023480、CsaV3_5G006660和CsaV3_1G010290在所有組織中均不表達(dá)；CsaV3_2G034820、CsaV3_5G006670、CsaV3_7G003510、CsaV3_4G006220、CsaV3_4G023510、CsaV3_4G006250和CsaV3_4G006240在黃瓜的根中特異性表達(dá)，但在其他組織中低表達(dá)或者不表達(dá)；CsaV3_7G005610、CsaV3_7G005630、CsaV3_7G022920、CsaV3_4G023490、CsaV3_2G015820、CsaV3_5G026130和CsaV3_1G003340在黃瓜的所有組織中均有表達(dá)，但表達(dá)量較低；CsaV3_4G023500在所有組織中都有表達(dá)，且表達(dá)量較高，在根、莖、子房和受精子房中表達(dá)量最高；CsaV3_6G006930在卷須中高表達(dá)，在根中不表達(dá)，在其余組織中有表達(dá)；CsaV3_6G006930在莖、葉片和卷須中特異性表達(dá)，在其余組織中有表達(dá)，但表達(dá)量較低。

圖6 黃瓜DIR家族基因在不同組織器官中的表達(dá)熱圖Fig.6 The expression heatmap of DIR gene family in different tissues of cucumber

2.8 黃瓜DIR家族基因在非生物脅迫處理下的表達(dá)模式

基于已公布的黃瓜在高溫（PRJNA634519）[45]、低溫（PRJNA438923）、鹽和硅脅迫（PRJNA477930）[46]處理下的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，利用黃瓜ChineseLong_V3版本基因組信息，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，繪制黃瓜DIR家族基因在不同非生物脅迫響應(yīng)下的表達(dá)熱圖（圖7）。研究發(fā)現(xiàn)在高溫脅迫處理下，與對(duì)照材料相比，僅有CsaV3_4G023490這一個(gè)DIR基因發(fā)生顯著的上調(diào)表達(dá)，而CsaV3_6G006930、CsaV3_2G015830、CsaV3_4G023500、CsaV3_1G0003340發(fā)生顯著的下調(diào)表達(dá)。在低溫脅迫處理下，與對(duì)照材料相比，發(fā)現(xiàn)CsaV3_2G015830和CsaV3_1G003540分別發(fā)生顯著的下調(diào)表達(dá)和上調(diào)表達(dá)，但由于FPKM值小于5，不認(rèn)為是可靠的差異表達(dá)基因，因此，在低溫脅迫處理下，僅發(fā)現(xiàn)CsaV3_6G006930發(fā)生顯著的下調(diào)表達(dá)，CsaV3_4G023490發(fā)生上調(diào)表達(dá)。在鹽脅迫處理下，與對(duì)照材料相比，發(fā)現(xiàn)所有黃瓜DIR基因?qū)}脅迫處理沒(méi)有顯著的響應(yīng)調(diào)控，但在硅脅迫下，與對(duì)照材料相比，CsaV3_4G023490和CsaV3_4G023510發(fā)生顯著地上調(diào)表達(dá)。

圖7 黃瓜DIR家族基因在非生物脅迫處理下的表達(dá)熱圖Fig.7 The expression heatmaps of cucumber DIR gene family under abiotic stress treatments

2.9 黃瓜 DIR家族基因在生物脅迫處理下的表達(dá)模式

基于已公布的黃瓜在霜霉病（PRJNA285071）[47]、白粉病（PRJNA321023）[48]、根結(jié)線蟲(chóng)脅迫（PRJNA419665）[49]處理下的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，利用黃瓜ChineseLong_V3版本基因組信息，重新進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，繪制黃瓜DIR家族基因在生物脅迫響應(yīng)下的表達(dá)熱圖（圖8）。研究發(fā)現(xiàn)，在霜霉病脅迫處理下，與對(duì)照材料相比，CsaV3_4G023490、CsaV3_2G015820、CsaV3_4G023500、CsaV3_1G003340在抗、感材料中全都發(fā)生顯著的上調(diào)表達(dá)，CsaV3_4G006250、CsaV3_4G006240、CsaV3_4G023510僅在感病材料中發(fā)生明顯的上調(diào)表達(dá)，而CsaV3_7G005610和CsaV3_2G034820的FPKM值小于5，因此不認(rèn)為是差異表達(dá)基因。在白粉病脅迫處理下，與對(duì)照材料相比，僅發(fā)現(xiàn)CsaV3_4G023490在抗、感材料中均發(fā)生顯著地上調(diào)表達(dá)，而CsaV3_4G023510、CsaV3_2G015830和CsaV3_2G015820的FPKM值小于5，因此不認(rèn)為是差異表達(dá)基因。在根結(jié)線蟲(chóng)脅迫處理下，與對(duì)照材料相比，CsaV3_6G006930和CsaV3_2G034820在抗、感材料中均發(fā)生顯著上調(diào)表達(dá)，CsaV3_4G023510和CsaV3_5G006660在抗、感材料中均發(fā)生顯著地下調(diào)表達(dá)；CsaV3_4G023490和CsaV3_4G006240只在感病材料中發(fā)生顯著上調(diào)表達(dá)，在抗病材料中也發(fā)生上調(diào)表達(dá)，但不顯著，其中CsaV3_4G023490的表達(dá)水平隨著接種時(shí)間的增加而逐漸上調(diào)表達(dá)，而CsaV3_4G006240的表達(dá)水平隨著接種時(shí)間的增加先增高后下降；CsaV3_4G006250表達(dá)水平在感病材料接種1 d后顯著上調(diào)表達(dá)，隨后開(kāi)始緩慢下降，而在抗病材料中是持續(xù)地下調(diào)表達(dá)；CsaV3_7G003510在感病材料中的表達(dá)水平隨著接種時(shí)間增加而逐漸下降，但在抗病材料中的表達(dá)水平是先增加后下降；CsaV3_5G006670、CsaV3_5G026130和CsaV3_1G010290在感病材料中發(fā)生顯著下調(diào)表達(dá)，在抗病材料中也發(fā)生下調(diào)表達(dá)，但不顯著；CsaV3_4G006220在抗病材料中發(fā)生顯著的下調(diào)表達(dá)，在感病材料中也發(fā)生下調(diào)表達(dá)，但不顯著；CsaV3_1G003340的FPKM值小于5，因此不認(rèn)為是差異表達(dá)基因。

圖8 黃瓜DIR家族基因在生物脅迫處理下的表達(dá)熱圖Fig.8 The expression heatmaps of cucumber DIR gene family under biotic stress treatments

2.10 黃瓜DIR家族基因在非生物脅迫和生物脅迫響應(yīng)下的調(diào)控模式分析

通過(guò)上述黃瓜DIR家族基因在非生物和生物脅迫下的表達(dá)模式分析，將有差異表達(dá)的黃瓜DIR基因進(jìn)行標(biāo)注，繪制熱圖（圖 9）。發(fā)現(xiàn)CsaV3_4G023490在非生物和生物脅迫下均呈現(xiàn)明顯上調(diào)表達(dá)，表明該基因積極參與脅迫響應(yīng)，可以作為后續(xù)研究的重點(diǎn)候選基因；還有一些黃瓜DIR基因，例如CsaV3_4G023500、CsaV3_6G006930、CsaV3_1G003340、CsaV3_4G023510，同時(shí)在個(gè)別非生物和生物脅迫處理中有差異表達(dá)，但表達(dá)模式不一樣；還有一些黃瓜DIR基因只在非生物脅迫中參與響應(yīng)表達(dá)，例如CsaV3_2G015830只在高溫脅迫中下調(diào)表達(dá)；還有一些黃瓜DIR基因，例如CsaV3_4G006250、CsaV3_7G003510、CsaV3_2G034820、CsaV3_4G006240、CsaV3_5G006670、CsaV3_5G026130、CsaV3_1G010290、CsaV3_2G015820、CsaV3_4G006220、CsaV3_5G006660，只在生物脅迫中參與響應(yīng)表達(dá)。

圖9 黃瓜DIR家族基因在非生物和生物脅迫下的表達(dá)模式熱圖Fig.9 The expression patterns heatmap of cucumber DIR gene family under the abiotic and biotic stresses

3 討論

3.1 黃瓜 DIR基因家族的鑒定與表達(dá)分析為后續(xù)深入研究提供借鑒

近年來(lái)，隨著基因組測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展和廣泛應(yīng)用，越來(lái)越多的植物基因組序列信息已經(jīng)公布[50]，許多重要的基因家族鑒定工作也已經(jīng)陸續(xù)開(kāi)展。DIR蛋白幾乎存在于所有維管植物中，往往以基因家族的形式出現(xiàn)，DIR基因家族已經(jīng)在模式植物擬南芥[9]、水稻[10-11]中相繼鑒定，隨后在一些重要蔬菜作物如白菜[14]、辣椒[15]中也有報(bào)道。黃瓜作為在世界范圍內(nèi)廣泛栽培的重要蔬菜作物，其栽培面積僅次于番茄和洋蔥[51]，早在2009年就完成了黃瓜基因組測(cè)序工作，獲得黃瓜ChineseLong_V2版本基因組信息[3]，雖然已有根據(jù)黃瓜 ChineseLong_V2版本基因組信息進(jìn)行DIR家族基因鑒定的報(bào)道[21,31]，但鑒定的 DIR家族基因數(shù)目少于本研究中利用黃瓜ChineseLong_V3版本基因組信息[32]鑒定到的DIR家族基因數(shù)目，表明之前研究中的黃瓜DIR家族基因全基因組鑒定不完全，并且之前的研究沒(méi)有進(jìn)行黃瓜DIR家族基因在響應(yīng)生物脅迫和非生物脅迫過(guò)程中的表達(dá)模式分析，這極大地限制了DIR基因在黃瓜中的生物學(xué)功能研究。因此，本研究利用黃瓜ChineseLong_V3版本基因組信息，對(duì)黃瓜中DIR家族基因成員進(jìn)行鑒定，并基于黃瓜ChineseLong_V3版本基因組信息和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序大數(shù)據(jù)，重新進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，探究黃瓜DIR家族基因在不同組織器官和不同脅迫響應(yīng)過(guò)程中的表達(dá)模式，可為黃瓜 DIR基因的功能深入研究提供參考，并為黃瓜抗性分子育種提供理論依據(jù)。

3.2 DIR基因家族在不同物種間具有保守性

不同植物中DIR家族基因的數(shù)目變化很大，本研究共鑒定到23個(gè)黃瓜DIR家族基因成員，而擬南芥[9]、水稻[10-11]、云杉[5]、白梨[12]、楊樹(shù)[13]、白菜[14]、辣椒[15]、草莓[16]、陸地棉[17]中鑒定的DIR基因數(shù)目分別是25個(gè)、61個(gè)、35個(gè)、35個(gè)、40個(gè)、29個(gè)、24個(gè)、33個(gè)和12個(gè)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析將黃瓜中的23個(gè)DIR基因分為3個(gè)亞族，即a、b/d、e，這與擬南芥[9]、楊樹(shù)[13]、辣椒[15]和陸地棉[17]中DIR家族基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果類似，也與之前利用黃瓜 ChineseLong_V2版本基因組信息進(jìn)行DIR家族基因分析的聚類結(jié)果一致[21]，3個(gè)亞族成員間的基因結(jié)構(gòu)存在明顯差異，每個(gè)亞族中的基因結(jié)構(gòu)和 motif基本一致。通過(guò)對(duì)黃瓜中的DIR家族基因進(jìn)行重復(fù)基因分析，發(fā)現(xiàn)黃瓜DIR基因家族有5對(duì)串聯(lián)重復(fù)基因?qū)?，僅有1對(duì)片段重復(fù)基因?qū)?，可?jiàn)黃瓜中DIR基因的擴(kuò)張主要來(lái)自于串聯(lián)重復(fù)。通過(guò)對(duì)擬南芥、水稻和黃瓜中DIR家族基因的共線性分析，發(fā)現(xiàn)黃瓜中有8個(gè)DIR基因比較保守，其與擬南芥和水稻中的DIR基因都不存在共線性，而另外15個(gè)黃瓜DIR基因與擬南芥和水稻中的DIR基因存在多種共線性關(guān)系，表明各物種以特異的方式進(jìn)行了基因擴(kuò)張，這種現(xiàn)象也普遍出現(xiàn)在其他植物基因家族研究中[52-53]。

3.3 CsaV3_4G023490積極參與黃瓜對(duì)生物和非生物脅迫響應(yīng)的調(diào)控

由于近年來(lái)高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序成本逐漸下降[54]，有很多研究者進(jìn)行了大量的黃瓜轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，形成了黃瓜轉(zhuǎn)錄組測(cè)序大數(shù)據(jù)。因此，利用好這些轉(zhuǎn)錄組測(cè)序大數(shù)據(jù)，不僅能降低研究成本，還能深入挖掘這些數(shù)據(jù)，并且可以結(jié)合不同處理的黃瓜數(shù)據(jù)來(lái)研究黃瓜不同基因家族的分子生物學(xué)功能。本研究發(fā)現(xiàn)23個(gè)黃瓜DIR家族基因中有些基因在所有組織中低表達(dá)甚至不表達(dá)，有些基因在所有組織中均有表達(dá)，有些基因只在部分組織中特異表達(dá)，正是由于這些DIR家族基因在不同組織中的特異表達(dá)，協(xié)同調(diào)控了黃瓜的生長(zhǎng)發(fā)育。通過(guò)分析脅迫響應(yīng)過(guò)程中黃瓜 DIR家族基因表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)黃瓜CsaV3_4G023490在生物和非生物脅迫中均發(fā)生上調(diào)表達(dá)，表明該基因積極響應(yīng)黃瓜脅迫過(guò)程中的抗性調(diào)控，這與前人報(bào)道的CsDIR16（黃瓜ChineseLong_V2版本基因組信息中命名為Csa4G280630）功能一致，在響應(yīng)霜霉威（殺菌劑 Propamocarb）、JA、ABA、PEG、NaCl、黃瓜褐斑病脅迫過(guò)程中均呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)[21]，可見(jiàn)該基因在抵御生物和非生物脅迫過(guò)程中積極響應(yīng)，可進(jìn)行后續(xù)深入研究。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)黃瓜DIR家族基因在生物脅迫和非生物脅迫中的表達(dá)模式也不一樣，在非生物脅迫響應(yīng)過(guò)程中，發(fā)生差異表達(dá)的DIR家族基因數(shù)目較少，除了CsaV3_4G023490上調(diào)表達(dá)，其余大部分基因下調(diào)表達(dá)；而在生物脅迫響應(yīng)過(guò)程中，發(fā)生差異表達(dá)的 DIR家族基因數(shù)目較多，且大多數(shù)差異表達(dá)的 DIR基因上調(diào)表達(dá)，這表明相對(duì)于非生物脅迫，在病原菌侵染黃瓜后，較多的DIR家族基因會(huì)協(xié)同上調(diào)表達(dá)，以積累更多的木質(zhì)素，從而抵御病原菌的侵染。這證實(shí)了植株在病原菌侵染過(guò)程中，侵染部位或侵染點(diǎn)周圍的植物細(xì)胞會(huì)積累木質(zhì)素，從而達(dá)到抵抗病菌侵染和擴(kuò)展的目的[55]。很多研究已經(jīng)證明 DIR基因在植株與病原菌互作過(guò)程中的重要性[56-59]。此外，還有一些黃瓜DIR基因在個(gè)別的非生物脅迫中也發(fā)揮著重要的作用，特別是在低溫、干旱、激素信號(hào)等脅迫下，這與啟動(dòng)子中的cis元件類型相符，其他作物中的DIR家族基因也具有非生物脅迫響應(yīng)調(diào)控功能[11,14,18-21]，但黃瓜中大多數(shù)非生物脅迫響應(yīng)調(diào)控基因?yàn)橄抡{(diào)表達(dá)，這也有待進(jìn)一步探討。

4 結(jié)論

在黃瓜全基因組范圍內(nèi)共鑒定到23個(gè)DIR家族基因，分為3個(gè)亞族。黃瓜DIR家族基因在不同組織器官和脅迫響應(yīng)下的表達(dá)模式具有差異性，協(xié)同調(diào)控了黃瓜的生長(zhǎng)發(fā)育，其中CsaV3_4G023490在非生物和生物脅迫下均呈現(xiàn)出明顯的上調(diào)表達(dá)，表明該基因積極參與逆境脅迫響應(yīng)調(diào)控。