殼寡糖浸種對(duì)馬鈴薯微型薯芽生長(zhǎng)和內(nèi)源激素含量的影響

冶楠，朱艷，趙元壽，朱建寧，門(mén)佳偉，陳富，孔德媛，張衛(wèi)兵，宗元元，李永才

1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730070；2蘭州工業(yè)研究院食品工業(yè)研究室，蘭州 730000；3甘肅省藥品監(jiān)督管理局審評(píng)認(rèn)證中心，蘭州 730070；4甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所，蘭州 730070

0 引言

【研究意義】我國(guó)是全球最大的馬鈴薯生產(chǎn)國(guó)，馬鈴薯作為重要的糧菜兼用農(nóng)作物，其種植面積和產(chǎn)量分別約占世界的25%和19%[1]。為了提高馬鈴薯的產(chǎn)量，馬鈴薯播種前一般進(jìn)行拌種催芽處理，以提高塊莖發(fā)芽率、促進(jìn)芽健壯生長(zhǎng)、增加抗逆性，并控制土傳病害對(duì)種薯的影響[2]。馬鈴薯生產(chǎn)中常用的拌種劑有化學(xué)農(nóng)藥、生物菌劑以及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等[2-3]。然而，化學(xué)農(nóng)藥的不合理使用可導(dǎo)致農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染，生物菌劑也存在廣譜性窄、效果不穩(wěn)定、不易推廣的局限性，因此，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑作為拌種劑具有較好的應(yīng)用前景[1]。目前已有報(bào)道，赤霉素GA3、生長(zhǎng)素 IAA、油菜素內(nèi)酯 BR等可作為拌種劑改善植物種子的發(fā)芽，穆紅梅等[4]報(bào)道，GA3和IAA浸種處理可提高多種植物種子的發(fā)芽率，促進(jìn)萌發(fā)，調(diào)控植物的生長(zhǎng)和發(fā)育。烯效唑浸種處理西瓜種子，增強(qiáng)西瓜幼苗的生長(zhǎng)勢(shì)，并有效控制西瓜“高腳苗”[5]。然而，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的使用濃度控制不當(dāng)易引起植物內(nèi)源激素水平變化，導(dǎo)致異常苗形態(tài)。黃濤等[6]發(fā)現(xiàn)，GA和BR浸種處理不當(dāng)可導(dǎo)致馬鈴薯內(nèi)源GA含量升高，使細(xì)胞形態(tài)細(xì)長(zhǎng)，苗細(xì)弱和瘋長(zhǎng)，抗逆性降低。棉花播種前，浸種處理不當(dāng)導(dǎo)致“高腳苗”，幼苗子葉期莖長(zhǎng)苗弱，苗生長(zhǎng)勢(shì)差，對(duì)低溫等逆境脅迫的能力降低，最終影響產(chǎn)量[7]。因此，不合理的浸種處理可引起芽細(xì)長(zhǎng)、瘋長(zhǎng)和抗逆能力降低。殼寡糖（chitosan oligosaccharides，COS）又稱(chēng)寡聚氨基葡萄糖，是天然產(chǎn)物殼聚糖降解后形成的聚合度在2—20個(gè)氨基葡萄糖的低聚糖，對(duì)生態(tài)環(huán)境無(wú)污染[8]。COS具有調(diào)節(jié)植物免疫及誘導(dǎo)植物抗逆性增強(qiáng)的作用，可用于浸種處理[9]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】秦燕霞[10]研究發(fā)現(xiàn)，100 mg·L-1COS溶液浸種大麥種子，可使大麥發(fā)芽率提高12.82%，麥芽中淀粉酶和α-氨基氮的含量也被有效提高，使麥苗生長(zhǎng)力增強(qiáng)。孫學(xué)花等[11]發(fā)現(xiàn)，COS浸種處理提高了小麥種子的萌發(fā)和生長(zhǎng)能力以及麥苗的抗病能力。COS浸種和葉面噴施處理均可降低 20% PEG干旱脅迫下小麥體內(nèi)的超氧陰離子和丙二醛含量，從而緩解PEG脅迫對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)和種子萌發(fā)產(chǎn)生的抑制效應(yīng)[12]。鐘碧萍等[13]發(fā)現(xiàn)，COS溶液浸種水稻種子，可提高水稻幼苗抗冷能力，在低溫下幼苗存活率提高了15.54%。低溫脅迫前，‘赤霞珠’葡萄葉片噴施COS溶液，使低溫脅迫后葉片中可溶性糖和脯氨酸的含量提高，降低了細(xì)胞的滲透勢(shì)和冰點(diǎn)，增強(qiáng)葡萄葉片耐受低溫的能力[14]?？翟破G等[15]在菜薹中的研究發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的COS浸種處理調(diào)節(jié)菜薹葉片內(nèi)源IAA、ABA和乙烯的水平，并誘導(dǎo)菜薹獲得系統(tǒng)抗性，降低了立枯病的發(fā)病率?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】盡管已有COS作為植物免疫生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育并誘導(dǎo)提高植物抗逆性的報(bào)道，但是COS處理對(duì)馬鈴薯塊莖芽生長(zhǎng)發(fā)育及內(nèi)源植物激素的影響尚未有報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本試驗(yàn)通過(guò) COS浸種處理馬鈴薯微型薯，以芽長(zhǎng)和芽直徑為指標(biāo)，篩選有效促進(jìn)微型薯塊莖萌發(fā)的COS濃度，并測(cè)定該濃度下塊莖萌發(fā)過(guò)程中頂芽分生組織細(xì)胞的形態(tài)、內(nèi)源植物激素水平的變化，評(píng)價(jià) COS浸種處理對(duì)馬鈴薯塊莖芽生長(zhǎng)的影響，為馬鈴薯浸種促芽提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于 2020年在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院采后生物與技術(shù)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 材料

供試‘費(fèi)烏瑞它’馬鈴薯脫毒微型薯 (Solanum tuberosumL.cv.Favorita)，于2020年9月購(gòu)自甘肅省一航薯業(yè)科技有限公司。從脫毒微型薯種植大棚內(nèi)采收，晾曬4 h后于24 h內(nèi)低溫運(yùn)輸至冷藏庫(kù)存放待用，貯藏溫度（4±1）℃、相對(duì)濕度（80±5）%。

供試殼寡糖（脫乙酰度≥90%），AR級(jí)，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；赤霉素 GA3（Gibberellin acid 3），BR級(jí)，純度大于90.0%，購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司）；石蠟（熔點(diǎn)范圍：50.0—52.0℃），購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；番紅染液（沙黃）（番紅濃度0.5%），購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司；植物內(nèi)源激素檢測(cè)用 ELASA試劑盒，購(gòu)自上海恒遠(yuǎn)生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制 分別準(zhǔn)確稱(chēng)取殼寡糖10、50和200 mg，用少量蒸餾水溶解后定容至1 000 mL，配制為10、50和200 mg·L-1（w/v）濃度的穩(wěn)定溶液；稱(chēng)取GA3純品15 mg，用少量蒸餾水溶解后定容至1 000 mL；配制為濃度15 mg·L-1（w/v）的溶液。溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 浸種處理 微型薯采收后置于相對(duì)濕度（80±5）%、貯藏溫度（4±1）℃條件下黑暗貯藏，待休眠期解除后進(jìn)行浸種處理[16-17]。選取外觀整齊，大小一致，無(wú)病蟲(chóng)害，無(wú)機(jī)械損傷，無(wú)發(fā)芽的微型薯塊莖，用自來(lái)水洗滌，并用 0.1%次氯酸鈉溶液（v/v）浸泡消毒后，取出晾干。分別用濃度為10、50和200 mg·L-1的殼寡糖溶液浸泡15 min，自然晾干后于黑暗、常溫條件下貯藏于濕潤(rùn)濾紙的保鮮盒內(nèi)，定期測(cè)量馬鈴薯塊莖發(fā)芽指標(biāo)并取樣。參照李海珀等[18]、鄭順林等[19]的方法并略作修改，以15 mg·L-1赤霉素（GA3）溶液浸泡15 min作為陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)以蒸餾水浸泡處理為陰性對(duì)照。

1.2.3 生理指標(biāo)測(cè)定

1.2.3.1 芽生長(zhǎng)指標(biāo) 浸種后定點(diǎn)間隔24 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)定芽直徑、芽長(zhǎng)。芽長(zhǎng)為塊莖最長(zhǎng)芽的長(zhǎng)度，芽直徑為最長(zhǎng)芽距塊莖芽眼組織2 mm處的直徑[20]。每組處理共21個(gè)塊莖，隨機(jī)將7個(gè)塊莖分為1組，共3組，每組測(cè)定芽長(zhǎng)和芽直徑后取平均值，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3.2 發(fā)芽率 參考王潔等[21]的方法測(cè)定處理后7 d內(nèi)微型薯的發(fā)芽率，以塊莖至少有一個(gè)芽長(zhǎng)達(dá) 2 mm定義為發(fā)芽，重復(fù)3次。

根據(jù)以下公式計(jì)算：

1.2.3.3 發(fā)芽勢(shì) 參考任艷芳等[22]的方法并略作修改，測(cè)定處理后微型薯5 d內(nèi)的發(fā)芽勢(shì)。根據(jù)以下公式計(jì)算：

1.2.4 內(nèi)源激素含量測(cè)定 參考鐘蕾等[23]的方法并修改，將浸種處理后微型薯塊莖芽生長(zhǎng)定義為4個(gè)時(shí)期：浸種處理前定義為處理前期（before treatment peroid，BT），微型薯芽長(zhǎng)≤2 mm時(shí)期定義為萌發(fā)前期（before germination stage，BGS），微型薯芽長(zhǎng)約2—10 mm定義為萌發(fā)期（germination stage，GS），微型薯芽長(zhǎng)≥10 mm時(shí)期定義為伸長(zhǎng)期（vigorous growth period，VG）。分別在4個(gè)時(shí)期取樣，切取塊莖頂芽分生組織及芽眼處深度5 mm以?xún)?nèi)的組織，液氮速凍后置于-80℃冰箱中保存，采用酶聯(lián)免疫法進(jìn)行內(nèi)源激素含量的測(cè)定[24]。每個(gè)時(shí)期每個(gè)處理選取 70個(gè)大小重量相近（（10±2）g）的塊莖，隨機(jī)以10個(gè)為1組作為1個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共7個(gè)重復(fù)。

1.2.5 頂芽分生組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察 參照王茜茹等[25]的方法，并略作修改，采用常規(guī)石蠟切片法，經(jīng)番紅染色，用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.2.5.1 包埋切片 切取GS期微型薯塊莖幼芽頂端的分生組織（芽尖2—5 mm），浸入70% FAA固定液（5 mL 40%甲醛，5 mL冰醋酸，90 mL 70%乙醇）固定3 d。將固定后的樣品分別用70%、80%、90%、100%濃度乙醇梯度脫水，采用無(wú)水乙醇及二甲苯透明，至二甲苯完全透明，以除盡乙醇。然后將樣品浸蠟包埋，使用輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)切片（型號(hào)：KD-202），厚度約8 μm，將切好的蠟片在37℃左右的溫水中展開(kāi)鋪平，用載玻片撈出，置于40℃烘箱中烘干備用。

1.2.5.2 染色觀察 將干燥完全的蠟片浸于番紅染液中染色2 h，無(wú)菌水沖洗3次，洗去染液，于40℃恒溫干燥箱中干燥完全，顯微鏡觀察并拍照。

1.2.5.3 分生組織細(xì)胞長(zhǎng)度和厚度的量化 參照李寶軍等[26]的方法，利用IS capture軟件對(duì)馬鈴薯微型薯頂芽分生組織石蠟切片的染色結(jié)果進(jìn)行細(xì)胞長(zhǎng)度和厚度的量化。

1.3 數(shù)據(jù)分析

以上數(shù)據(jù)采用 Excel 2016計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤（±SE），采用SPSS 24.0進(jìn)行Duncan’s顯著性分析和Pearson相關(guān)性分析（P＜0.05），采用Origin 2020繪圖。

2 結(jié)果

2.1 殼寡糖浸種處理對(duì)馬鈴薯微型薯芽生長(zhǎng)的影響

芽長(zhǎng)和芽直徑是反映植物細(xì)胞沿維管束縱向和徑向方向生長(zhǎng)速度的重要指標(biāo)。不同浸種處理對(duì)馬鈴薯微型薯塊莖的芽長(zhǎng)和芽直徑影響顯著（圖1-A—C）（P＜0.05）。與陰性對(duì)照組（Con）相比，濃度分別為10、50和200 mg·L-1的 COS溶液浸泡處理均可促進(jìn)馬鈴薯微型薯塊莖的萌發(fā)。在BGS期，Con組織塊莖芽眼未萌發(fā)，而COS處理組和陽(yáng)性對(duì)照GA3處理組的塊莖芽眼已啟動(dòng)萌發(fā)，以GA3組萌芽最長(zhǎng)。浸種6 d后（GS期），微型薯塊莖芽均萌發(fā)生長(zhǎng)至2—10 mm，其中Con處理組芽粗短，GA3處理組芽最長(zhǎng)，COS處理組以 50 mg·L-1濃度浸種處理芽生長(zhǎng)速度最快。在VG期，COS和GA3浸種處理較Con組芽長(zhǎng)增加顯著，且 GA3處理芽長(zhǎng)增加最顯著，殼寡糖浸種處理以COS50處理組芽長(zhǎng)最長(zhǎng)，且芽較粗壯；不同濃度COS處理組與Con組相比，芽直徑粗細(xì)無(wú)顯著差異性，但GA3處理后芽直徑顯著低于Con及 COS處理，表現(xiàn)為芽細(xì)長(zhǎng)。說(shuō)明COS浸種處理有效促進(jìn)了微型薯塊莖芽的萌發(fā)及伸長(zhǎng)，同時(shí)未出現(xiàn)陽(yáng)性對(duì)照組GA3浸種處理后芽細(xì)長(zhǎng)的現(xiàn)象，且以50 mg·L-1的殼寡糖處理效果較好。

圖1 不同浸種處理對(duì)芽生長(zhǎng)狀態(tài)的影響Fig.1 Effects of different seed soaking treatments on sprouts growth

2.2 浸種處理對(duì)微型薯發(fā)芽率及發(fā)芽勢(shì)的影響

發(fā)芽率是衡量塊莖發(fā)芽力的重要指標(biāo)。不同浸種處理后，馬鈴薯微型薯塊莖發(fā)芽率差異顯著（圖2-A）（P＜0.05）。浸種處理第 2—5天，COS50處理微型薯發(fā)芽率顯著高于GA3組和Con組，COS50處理組在浸種后第5天，所有塊莖均發(fā)芽，發(fā)芽率達(dá)到100%，而Con組發(fā)芽率為90.0%，GA3組發(fā)芽率為95.0%，Con組發(fā)芽率最低，且COS處理組塊莖芽長(zhǎng)相近，出芽整齊。浸種處理第6天后，GA3組發(fā)芽率達(dá)到100%，Con組發(fā)芽率為96.7%。浸種處理第7天后，Con組塊莖發(fā)芽率才達(dá)到 100%。上述結(jié)果表明，在浸種處理5 d內(nèi)，COS50處理顯著提高了微型薯的發(fā)芽率。

發(fā)芽勢(shì)反映種子發(fā)芽的快慢程度，是衡量種子活力的重要參考。如圖2-B所示，不同浸種處理后微型薯塊莖的發(fā)芽勢(shì)均隨發(fā)芽時(shí)間的增加而提高，且各處理間發(fā)芽勢(shì)差異顯著（P＜0.05）。浸種處理第5天時(shí)，微型薯發(fā)芽塊莖數(shù)達(dá)到最大，COS50處理組微型薯發(fā)芽勢(shì)顯著高于GA3組和Con組，分別提高了28.6%和80.0%。說(shuō)明COS50處理顯著促進(jìn)了馬鈴薯微型薯發(fā)芽勢(shì)的提高，使種子活力增加，塊莖出芽早且芽長(zhǎng)勢(shì)一致。

圖2 不同浸種處理對(duì)微型薯發(fā)芽率及發(fā)芽勢(shì)的影響Fig.2 Effects of different seed soaking treatments on the germination rate and energy of minitubers

2.3 浸種處理對(duì)微型薯萌發(fā)期間頂芽分生組織內(nèi)源激素含量的影響

由圖3可知，不同浸種處理的微型薯頂芽組織中內(nèi)源激素含量差異明顯。與Con組和GA3組相比，COS50處理組可有效控制塊莖頂芽分生組織中內(nèi)源GA以及ABA的穩(wěn)定水平，調(diào)節(jié)CTK和IAA在塊莖萌發(fā)過(guò)程中的含量變化，并顯著增加內(nèi)源PA的含量。赤霉素（GA）能促進(jìn)細(xì)胞分裂伸長(zhǎng)，從而引起苗增長(zhǎng)。由圖3-A可以看出，不同浸種處理后，內(nèi)源GA含量隨芽萌發(fā)過(guò)程呈上升趨勢(shì)，且各個(gè)萌發(fā)期GA3處理組的內(nèi)源GA含量顯著高于其他處理組；在VG期，COS50處理組的塊莖GA含量顯著高于Con組（P＜0.05），提高了2.5%，但比GA3組含量顯著低2.0%（P＜0.05）。上述結(jié)果表明，COS50和外源GA3浸種處理均可導(dǎo)致塊莖萌發(fā)過(guò)程中GA含量的顯著升高，但COS50處理未引起微型薯塊莖芽萌發(fā)過(guò)程中內(nèi)源GA濃度的顯著激增。細(xì)胞分裂素（CTK）可調(diào)控植物細(xì)胞的分裂與分化，根莖的生長(zhǎng)等。由圖3-B可知，在浸種處理后微型薯塊莖萌芽過(guò)程中，CTK含量逐漸升高，在BGS期，3種處理引起的 CTK含量未表現(xiàn)顯著差異，在GS期和VG期，GA3浸種處理組CTK水平顯著升高，分別高于COS50組7.5%和8.4%；而COS50處理組與Con相比，CTK含量分別提高了4.3%和2.7%。上述結(jié)果表明，COS50浸種處理促進(jìn)了萌發(fā)芽組織中內(nèi)源CTK的產(chǎn)生，但CTK含量的升高水平顯著低于GA3處理組。生長(zhǎng)素（IAA）具有促進(jìn)植物細(xì)胞分化與伸長(zhǎng)、側(cè)根形成、生長(zhǎng)發(fā)育的作用。由圖3-C可看到，在BGS期，Con處理組塊莖芽眼組織中IAA含量激增到較高水平后逐漸降低，伴隨塊莖芽的萌發(fā)和伸長(zhǎng)COS50和GA3處理組的IAA含量整體呈上升趨勢(shì)，在VG期，COS50及GA3處理組IAA含量顯著高于Con處理組，分別提高了11.4%和17.1%，但COS50處理組芽組織的IAA含量顯著低于GA3處理組5.1%，說(shuō)明COS50浸種處理可調(diào)控微型薯芽伸長(zhǎng)過(guò)程中IAA的含量，穩(wěn)定內(nèi)源 IAA的水平。多胺（PA）是生物體內(nèi)的小分子含氮堿，具有調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育、增強(qiáng)抗逆性的作用。從圖3-D可以看出，不同浸種處理后塊莖萌發(fā)過(guò)程中，馬鈴薯頂芽中PA含量總體呈現(xiàn)先上升后降低再升高的趨勢(shì)，其中，COS50處理后內(nèi)源PA含量顯著增加，分別較GA3處理組與Con處理組提高了2.8%和7.0%，說(shuō)明COS50浸種處理有利于微型薯塊莖中PA的大量積累。脫落酸（ABA）是一種抑制植物生長(zhǎng)的激素，具有促進(jìn)馬鈴薯塊莖形成、芽眼進(jìn)入休眠狀態(tài)等作用。由圖3-E可知，不同浸種處理下微型薯塊莖萌芽組織中 ABA含量整體均呈先下降后上升再下降的趨勢(shì)。BT期時(shí)，微型薯處于休眠狀態(tài)，ABA含量保持較高的水平。在GS期，COS50處理組塊莖中ABA含量顯著低于Con組和GA3處理組，分別低4.9%和6.1%。而VG期，COS50處理組與陽(yáng)性對(duì)照組的 ABA含量沒(méi)有顯著差異，但均顯著低于 Con組，COS50處理組ABA含量較Con組低3.2%，說(shuō)明COS50浸種處理后降低了 ABA含量的水平。IAA與GA濃度之和與ABA濃度的比值常表示促生長(zhǎng)激素和抑制生長(zhǎng)的激素調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育的平衡關(guān)系。從圖 3-F可知，在萌發(fā)前期，不同浸種處理后馬鈴薯微型薯頂芽分生組織中（IAA+GA）/ABA的值呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢(shì)。BGS期時(shí)，COS50處理后（IAA+GA）/ABA的比值顯著低于GA3處理及Con處理，COS50處理有利于穩(wěn)定馬鈴薯塊莖芽萌發(fā)前內(nèi)源促生長(zhǎng)激素與抑制生長(zhǎng)激素間的濃度平衡；GS期時(shí)，各處理中（IAA+GA）/ABA的比值差異性較小，且含量較低，頂芽生長(zhǎng)緩慢；VG期時(shí)，頂芽生長(zhǎng)速度加快，（IAA+GA）/ABA的值再次升高，COS50及GA3處理后（IAA+GA）/ABA的值較Con處理分別提高了1.1%和1.3%，說(shuō)明COS50處理可平衡馬鈴薯微型薯在萌發(fā)過(guò)程中內(nèi)源促生長(zhǎng)激素與抑制生長(zhǎng)激素的濃度，從而調(diào)控微型薯芽的萌發(fā)。

圖3 不同浸種處理對(duì)微型薯頂芽組織中內(nèi)源激素含量的影響Fig.3 Effects of different seed soaking treatments on the content of endogenous hormones in the terminal bud tissue of minitubers

2.4 馬鈴薯塊莖頂芽分生組織細(xì)胞形態(tài)的差異

選擇萌發(fā)期（GS）微型薯塊莖頂芽分生組織進(jìn)行石蠟切片染色觀察。由圖4可知，不同浸種處理對(duì)塊莖頂芽分生組織的細(xì)胞形態(tài)影響較大。Con處理組頂芽細(xì)胞大小均勻，形狀規(guī)則且排列緊密；COS50處理組的頂芽細(xì)胞較Con組細(xì)胞膨大較大、排列疏松；而GA3處理組頂芽細(xì)胞形態(tài)扁平細(xì)長(zhǎng)。通過(guò) IS capture量化微型薯頂芽分生組織的單細(xì)胞長(zhǎng)度和厚度，結(jié)果表明，GA3處理的細(xì)胞長(zhǎng)度最長(zhǎng)，其次為COS50處理，陰性對(duì)照的細(xì)胞長(zhǎng)度最短（圖 5-A）。GA3處理的芽細(xì)胞扁長(zhǎng)，表現(xiàn)為芽細(xì)長(zhǎng)瘋長(zhǎng)；單細(xì)胞厚度的表現(xiàn)趨勢(shì)與細(xì)胞長(zhǎng)度相反（圖 5-B）；細(xì)胞長(zhǎng)度和厚度均表現(xiàn)出顯著差異（P＜0.05），COS50處理后分生組織單細(xì)胞較大，表現(xiàn)為芽粗壯，未出現(xiàn)陽(yáng)性對(duì)照GA3處理的塊莖芽細(xì)長(zhǎng)及瘋長(zhǎng)現(xiàn)象。

圖4 不同浸種處理的微型薯頂芽分生組織細(xì)胞形態(tài)Fig.4 Sections of potato terminal bud tissue cells under different seed soaking treatments

圖5 不同浸種處理對(duì)馬鈴薯頂芽分生組織細(xì)胞大小的影響Fig.5 Effects of different seed soaking treatments on cell size of potato terminal buds

2.5 殼寡糖浸種處理引起的微型薯萌發(fā)與內(nèi)源激素的相關(guān)性分析

表1相關(guān)性分析表明，COS50處理后，馬鈴薯微型薯的芽長(zhǎng)與芽直徑、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率以及GA、CTK的含量均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.729、0.911、0.827、0.906、0.935，與PA含量呈顯著正相關(guān)（r=0.674，P＜0.05）；同時(shí)，芽直徑與發(fā)芽勢(shì)呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與發(fā)芽率、GA、CTK均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.651、0.577、0.702。而內(nèi)源激素ABA與PA之間存在較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)性（r=-0.785，P＜0.01）。以上結(jié)果說(shuō)明馬鈴薯微型薯芽的增長(zhǎng)、增粗、發(fā)芽率以及發(fā)芽勢(shì)的提高與COS50處理誘導(dǎo)促生長(zhǎng)激素GA、CTK、PA含量的升高正相關(guān)，因此，適當(dāng)濃度的殼寡糖可以調(diào)控內(nèi)源植物激素，以促進(jìn)馬鈴薯微型薯的芽的生長(zhǎng)及發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率。

表1 COS50處理引起馬鈴薯微型薯塊莖頂芽生長(zhǎng)與內(nèi)源激素水平變化的相關(guān)性分析Table 1 Correlation between terminal bud growth and hormones in potato minitubers under COS50 treatment

3 討論

3.1 殼寡糖浸種處理影響馬鈴薯微型薯芽的生長(zhǎng)及頂芽分生組織細(xì)胞形態(tài)

殼寡糖作為植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，可促進(jìn)植物生長(zhǎng)、提高產(chǎn)量、誘導(dǎo)抗逆、以及改善農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)等作用[27]。本研究結(jié)果也表明，不同濃度的殼寡糖浸種處理可促進(jìn)‘費(fèi)烏瑞它’馬鈴薯微型薯塊莖的發(fā)芽、芽粗壯，加快芽生長(zhǎng)速度，使出芽整齊，以50 mg·L-1濃度的殼寡糖溶液浸種處理效果最佳。這與COS拌種處理后引起亞麻種子、番茄種子及滇油杉種子萌發(fā)、生長(zhǎng)的趨勢(shì)相同[28-30]。

值得注意的是，有研究發(fā)現(xiàn)赤霉素處理可使具有休眠期的植物休眠期大大縮短，提早發(fā)芽，但內(nèi)源赤霉素濃度過(guò)高易引起芽徒長(zhǎng)，苗細(xì)弱而出現(xiàn)“高腳苗”[31]。本研究結(jié)果表明，15 mg·L-1的外源 GA3浸種處理引起了‘費(fèi)烏瑞它’馬鈴薯微型薯塊莖芽的細(xì)長(zhǎng)和瘋長(zhǎng)，與上述研究結(jié)果相符。同時(shí)，通過(guò)石蠟切片染色發(fā)現(xiàn)，COS50處理的芽分生組織細(xì)胞均勻膨大，未表現(xiàn)GA3處理的芽細(xì)胞沿維管束方向縱向拉伸、細(xì)胞扁平細(xì)長(zhǎng)的現(xiàn)象，說(shuō)明COS50浸種處理可避免植株出現(xiàn)苗細(xì)弱的現(xiàn)象。

3.2 殼寡糖浸種處理影響馬鈴薯微型薯發(fā)芽過(guò)程中內(nèi)源植物激素水平

外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑可引起植株內(nèi)源激素水平的改變，干擾植物內(nèi)源激素的穩(wěn)態(tài)平衡，從而達(dá)到調(diào)控植物生長(zhǎng)的目的[32-33]。前人研究認(rèn)為，馬鈴薯微型薯在萌芽過(guò)程中，促進(jìn)生長(zhǎng)的內(nèi)源激素（如GA、CTK、IAA等）含量上升，抑制生長(zhǎng)的激素（如ABA）含量下降[34]，本研究用50 mg·L-1（w/v）的殼寡糖浸種處理可以促進(jìn)馬鈴薯塊莖發(fā)芽過(guò)程中 IAA、CTK、GA和PA的產(chǎn)生，促進(jìn)馬鈴薯微型薯芽的萌發(fā)及生長(zhǎng)，與前人研究結(jié)果相符。說(shuō)明適宜濃度的殼寡糖浸種處理具有植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的作用，可調(diào)節(jié)馬鈴薯塊莖發(fā)芽過(guò)程中內(nèi)源植物激素的變化。

ABA作為抑制生長(zhǎng)的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)激素，在馬鈴薯塊莖休眠狀態(tài)下含量最高，其濃度在塊莖浸種處理前含量最高，伴隨塊莖休眠期的結(jié)束，在芽萌發(fā)前期，ABA激素水平顯著降低，為萌發(fā)做準(zhǔn)備。這表明在微型薯頂芽生長(zhǎng)中，ABA激素水平顯著降低，是塊莖休眠解除的表現(xiàn)，但在芽萌發(fā)期時(shí)含量略有上升，這可能是因?yàn)?ABA與其他內(nèi)源激素相互作用的關(guān)系，具體還有待進(jìn)一步研究。

IAA的生理作用具有兩重性，高濃度的IAA抑制生長(zhǎng)，低濃度的IAA促進(jìn)生長(zhǎng)[35]。而本研究發(fā)現(xiàn)，在芽萌發(fā)初期，Con組和GA3處理組的內(nèi)源IAA含量均顯著高于COS50處理組，而在微型薯萌發(fā)早期，COS50處理可維持IAA含量在較為穩(wěn)定的低濃度水平，而相關(guān)性分析表明COS50處理后的IAA水平也達(dá)到了與芽生長(zhǎng)指標(biāo)之間的負(fù)相關(guān)性，說(shuō)明微型薯芽萌發(fā)過(guò)程中內(nèi)源 IAA的含量達(dá)到了抑制芽生長(zhǎng)的較高濃度，但COS50處理可調(diào)控IAA處于較低濃度穩(wěn)態(tài)水平，調(diào)節(jié)芽的萌發(fā)。

PA是調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的含氮堿，是重要的潛在植物激素，且可增加生長(zhǎng)組織的滲透壓，從而提高芽的抗逆能力[36]。本研究結(jié)果表明，在微型薯芽萌發(fā)初期，COS50處理后的PA含量上升到最大，而此時(shí)的ABA含量降到了最低水平；芽萌發(fā)期時(shí)，ABA含量升高，PA含量表現(xiàn)一定程度的下降；而在芽快速伸長(zhǎng)期時(shí)，ABA含量下降，PA含量顯著上升，PA濃度增高刺激芽點(diǎn)細(xì)胞生長(zhǎng)，且增強(qiáng)芽細(xì)胞的抗逆能力。同時(shí)，COS50處理后微型薯塊莖在發(fā)芽過(guò)程中內(nèi)源PA的含量均高于Con和GA3處理組，說(shuō)明COS50處理有利于誘導(dǎo)增強(qiáng)抗逆性的PA含量顯著增高。相關(guān)性分析表明，COS50誘導(dǎo)的芽萌發(fā)過(guò)程中 PA與ABA濃度呈極顯著負(fù)相關(guān)（表1），PA可能與ABA拮抗，調(diào)控微型薯芽的萌發(fā)及芽細(xì)胞的抗逆能力。張靈等[37]報(bào)道，PA處理浸泡的種子可以顯著提高種子的萌發(fā)能力，調(diào)節(jié)分生組織細(xì)胞的滲透壓，從而增強(qiáng)幼苗在逆境下的生長(zhǎng)能力。劉彥超等[38]也發(fā)現(xiàn)，PA處理能改善蘋(píng)果幼苗的光合性能，促進(jìn)糖類(lèi)等有機(jī)物質(zhì)的積累，增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，增強(qiáng)吸水能力，從而提高幼苗的抗旱性；朱大恒等[39]的研究表明，外源施用IAA、GA和CTK均促進(jìn)多胺的生物合成，這與本研究用COS50的處理引起PA含量增高的結(jié)果一致，說(shuō)明COS處理可通過(guò)調(diào)節(jié)PA的水平來(lái)調(diào)控芽的生長(zhǎng)能力及抗逆能力。一定濃度的赤霉素能促進(jìn)生長(zhǎng)素的合成和細(xì)胞分裂膨大，從而提高發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率[19]。在本研究中，15 mg·L-1的赤霉素處理顯著提高了CTK及IAA的含量，這與前人研究結(jié)果相一致，但是該濃度引起了馬鈴薯微型薯芽的細(xì)長(zhǎng)及瘋長(zhǎng)，這可能與外源 GA3處理引起塊莖內(nèi)源 GA的大量積累有關(guān)。

3.3 殼寡糖浸種處理影響馬鈴薯微型薯發(fā)芽過(guò)程中促生長(zhǎng)激素與抑制生長(zhǎng)的激素間平衡

內(nèi)源激素在植物體內(nèi)的平衡狀況是植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)的基礎(chǔ)，通過(guò)調(diào)節(jié)植物激素的平衡狀態(tài)，可以調(diào)控植物的生長(zhǎng)與發(fā)育。馬鈴薯塊莖萌芽并不是單一激素作用的結(jié)果，而是不同類(lèi)型激素之間處于一種平衡狀態(tài)時(shí)對(duì)其協(xié)同作用的結(jié)果[23]，本研究中，不同處理下（IAA+GA）/ABA的值對(duì)馬鈴薯微型薯芽的影響存在差異。在萌發(fā)前期，陰性對(duì)照及外源GA處理后頂芽（IAA+GA）與ABA的比值較高，這可能與Con處理中高濃度的IAA有關(guān)，同時(shí)，外源GA也會(huì)促進(jìn)內(nèi)源GA的合成。由于IAA作為植物激素發(fā)揮作用具有濃度效應(yīng)，推測(cè)此時(shí)馬鈴薯微型薯芽的生長(zhǎng)勢(shì)沒(méi)有 COS50處理生長(zhǎng)勢(shì)好的原因，是由于高濃度的IAA抑制了芽的生長(zhǎng)，而適當(dāng)濃度的COS處理后可抑制IAA的高濃度效應(yīng)，調(diào)控芽的生長(zhǎng)狀態(tài)。說(shuō)明外源殼寡糖處理可調(diào)節(jié)馬鈴薯微型薯發(fā)芽過(guò)程中促生長(zhǎng)激素與抑制生長(zhǎng)的激素間平衡，最終調(diào)控馬鈴薯微型薯芽的萌發(fā)和生長(zhǎng)。

4 結(jié)論

殼寡糖處理可提高馬鈴薯微型薯的發(fā)芽率、芽長(zhǎng)、芽粗，以50 mg·L-1殼寡糖處理效果較好，可提高塊莖芽眼及芽分生組織中CTK、IAA、PA及GA的含量，降低ABA的含量。同時(shí)，50 mg·L-1殼寡糖處理后，馬鈴薯微型薯塊莖頂芽分生組織的細(xì)胞膨大均勻，未表現(xiàn)出GA3處理后細(xì)胞的扁平和細(xì)長(zhǎng)狀態(tài)。綜上，50 mg·L-1的殼寡糖浸種處理可提高微型薯芽眼及芽分生組織中PA、GA、CTK、IAA含量的提高，促進(jìn)馬鈴薯微型薯的發(fā)芽，芽長(zhǎng)且粗壯，不細(xì)長(zhǎng)及瘋長(zhǎng)，增加芽的生長(zhǎng)勢(shì)，降低塊莖苗細(xì)弱而導(dǎo)致的馬鈴薯“高腳苗”現(xiàn)象。