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    小龍蝦凍藏期間的品質(zhì)變化

    2023-03-07 11:43:20桑燕菲楊立錢鑫萍姜紹通陸劍鋒林琳
    現(xiàn)代食品科技 2023年2期
    關(guān)鍵詞:蝦肉巰基變性

    桑燕菲,楊立,錢鑫萍,姜紹通,3,陸劍鋒,3,4,林琳,3,4*

    (1.合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,安徽合肥 230601)(2.安徽富煌三珍食品集團(tuán)有限公司,安徽巢湖 238000)(3.安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點實驗室,安徽合肥 230601) (4.農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心,安徽合肥 230601)

    小龍蝦,學(xué)名克氏原螯蝦(Procambarusclarkii),最近十幾年已成為我國淡水蝦類中的一種重要資源。2020年和2019年我國小龍蝦產(chǎn)量分別239.37萬t和208.96萬t,與2018年相比,分別增加了46.07%和27.52%[1]。小龍蝦養(yǎng)殖量的快速增長,為小龍蝦加工提供了充足的原料,2020年我國小龍蝦總加工量為5.66萬t,較2019年增加了11.01%[1]。新鮮小龍蝦營養(yǎng)豐富且水分含量高,容易腐敗變質(zhì)且季節(jié)性很強(qiáng),市場價格隨季節(jié)呈巨大波動。目前小龍蝦多以鮮銷或冷凍粗加工為主,產(chǎn)品主要有蝦仁、整蝦、蝦尾等,附加值低,導(dǎo)致加工企業(yè)效益較低,與小龍蝦養(yǎng)殖量的快速增長不匹配。

    冷凍加工和貯藏在食品工業(yè)中普遍應(yīng)用,成本較低、效果好。在冷凍過程中,冷凍速度和溫度直接影響冰晶大小和數(shù)量以及冰晶在細(xì)胞和細(xì)胞間的分布。凍藏過程中的蝦肉質(zhì)量下降主要是冰晶的升華和重結(jié)晶的形成,引起蛋白質(zhì)的氧化、變性,表現(xiàn)為蝦肉脫水、質(zhì)量損失、變硬、微生物污染、風(fēng)味變壞和自溶等[2]。水產(chǎn)品在冷凍貯藏過程中受到溫度變化的影響,會發(fā)生生化反應(yīng),如氨基酸側(cè)鏈殘基的修飾、巰基的氧化、細(xì)胞質(zhì)的濃度增加等[3],這些將導(dǎo)致產(chǎn)品的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的氧化或變性[4],而這些變化一般會隨著冷凍貯藏時間的延長而加劇。最近關(guān)于新鮮小龍蝦冷凍的研究表明,冷凍和儲存的溫差以及冷凍速度都對小龍蝦產(chǎn)品的最終質(zhì)量有影響。實驗室先前的工作也發(fā)現(xiàn)了小龍蝦短期凍藏過程中蛋白質(zhì)的氧化,腐敗以及質(zhì)構(gòu)的變差[4]。在實際生產(chǎn)過程中,原料供給、加工能力、市場銷售以及疫情等突發(fā)事件會不同程度延長小龍蝦的冷凍貯藏時間,而長期凍藏過程中水產(chǎn)蛋白的變化目前研究較少。本論文研究了鮮活與蒸煮預(yù)加工后的小龍蝦,在48周(1年左右)冷凍貯藏過程中蝦肉蛋白質(zhì)相關(guān)指標(biāo)的變化情況,并初步探討凍藏期間的蝦肉肉質(zhì)改變及蛋白冷凍變性機(jī)理,為小龍蝦的加工和貯藏提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    市售鮮活小龍蝦,產(chǎn)區(qū)為江蘇省泗洪縣,保活運至實驗室。

    鹽酸、三氯乙酸、2-硫代巴比妥酸、EDTA、1,1,3,3-四乙氧基丙烷、硼酸、氧化鎂、溴酚藍(lán)、考馬斯亮藍(lán)、冰醋酸、甲醇、戊二醛、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、無水乙醇等,均為分析純;總巰基含量檢測試劑盒,羰基含量試劑盒,購自Solarbio公司;HEPES體系預(yù)制膠C621104,5x上樣緩沖液(含少量DTT),購自生工生物工程有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    FJ-200高速分散均質(zhì)機(jī),上海標(biāo)本模型廠;K9840自動凱氏定氮儀,山東海能科學(xué)儀器有限公司;CT15RT臺式高速冷凍離心機(jī),上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司;JEM1400透射電鏡,日本電子;TA-XT plus物性儀,英國Stable Micro System公司;Epoch全波長酶標(biāo)儀,BioTek Instruments;Nicolet 6700傅里葉紅外光譜儀,美國Thermoelectric Group。

    1.3 樣品處理

    選取新鮮小龍蝦,體質(zhì)量(30.00±5.00)g/只,隨機(jī)分為兩組(每組350只):鮮活蝦直接冷凍組(FX)和蒸煮預(yù)處理后冷凍組(FS),冷凍溫度-18 ℃。FX組直接將鮮活蝦清洗后瀝干表面水分,裝入包裝袋置于-18 ℃冰箱冷凍貯藏;FS組將活蝦清洗后,置于沸水中煮制4 min,流水冷卻至室溫,瀝干表面水分,放入冰箱凍藏。定時取樣品檢測,通過實驗室之前的工作[4],發(fā)現(xiàn)短期凍藏蝦肉變化較快。故而本次試驗前期檢測更為頻繁,而后檢測間隔逐步拉長。檢測時,將蝦肉流水解凍后去頭、去蝦線,取蝦肉測定各指標(biāo)。

    1.4 指標(biāo)測定

    1.4.1 揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)

    TVB-N測定參照GB 5009.228-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中揮發(fā)性鹽基氮》[5]的測定進(jìn)行。

    1.4.2 肌肉微觀結(jié)構(gòu)觀察

    使用蘇木精-伊紅染色(H&E)和透射電鏡(TEM)來比較和評估凍藏過程中小龍蝦肌肉組織的微觀結(jié)構(gòu)變化。H&E染色是根據(jù)Davidovich等[6]的方法進(jìn)行的,TEM參考Alvarez-Cirerol等[7]的方法進(jìn)行。

    1.4.3 質(zhì)構(gòu)

    參照江楊陽[8]的方法。取小龍蝦蝦尾的2~3節(jié),將其切割成8 mm×8 mm×6 mm的方塊,用物性儀對樣品的TPA指標(biāo)進(jìn)行測定。參數(shù)設(shè)定為:觸發(fā)類型Auto(自動)、測試速率為1 mm/s、返回速率為1 mm/s、測試形變量50%、觸發(fā)力5 g,兩次壓縮之間的停留時間為5 s。使用不銹鋼P/36R圓柱形壓縮探頭。每個樣品做6次重復(fù),記錄硬度、彈性、咀嚼性、內(nèi)聚力。

    1.4.4 SDS-PAGE電泳

    參考江楊陽[8]的方法。

    1.4.5 硫代巴比妥酸值(TBARS)

    參照GB 5009.181-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中丙二醛的測定》[9]執(zhí)行,TBARS值以每千克脂質(zhì)氧化樣品溶液中丙二醛(MDA)的質(zhì)量表示(mg/kg)。

    1.4.6 羰基含量測定

    稱取約0.4 g蝦肉,加入4 mL試劑盒內(nèi)蛋白提取液,充分勻漿后于4 ℃,5 000 r/min離心10 min,取上清,采用試劑盒給定方法測定。

    1.4.7 表面疏水度測定

    參考Park等[10]的方法。向小龍蝦蝦肉糜中加入4倍體積蛋白提取液(0.1 mol/L NaCl、0.002 mol/L MgCl2、0.001 mol/L EDTA-2Na、0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液,pH值7.0),11 000 r/min勻漿25 s,4 ℃、 5 000 r/min離心15 min,棄上清液,留沉淀,再加入蛋白提取液重復(fù)上述操作2次得粗蛋白。將所得粗蛋白與4倍體積0.1 mol/L NaCl溶液混合,勻漿25 s,4 ℃、5 000 r/min離心15 min,棄上清液,留沉淀,再加入NaCl溶液重復(fù)上述操作2次,沉淀即為小龍蝦蝦肌原纖維蛋白分散液。用適量0.6 mol/L NaCl溶解蛋白,過濾,取濾液。采用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)濃度,以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品。

    參考Chelh等[11]的方法。向1 mL肌原纖維蛋白分散液(5 mg/mL)中加入200 μL 1 mg/mL溴酚藍(lán)(Bromophenol Blue,BPB)(去離子水溶解)??瞻捉M用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH值6.0)替代。室溫下充分振蕩10 min,5 000 r/min離心15 min。取上清液稀釋10倍后在595 nm波長處測吸光度A。疏水性用BPB結(jié)合量表示,計算如下式所示。

    式中:

    B——BPB結(jié)合量,μg;

    A0——空白組在595 nm波長處測得的吸光度;

    A1——樣品組在595 nm波長處測得的吸光度。

    1.4.8 傅立葉紅外光譜

    參考Kaewprachu等[12]的方法。先將蝦肉樣品冷凍干燥,研磨成粉末,然后使用壓片機(jī)將其壓在透明載玻片上,并放置在ATR晶體的表面。消除背景干擾后,收集了400~4 000 cm-1之間的光譜,4 cm-1分辨率下掃描32次。測試后,對光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行傅立葉去卷積,并使用多重高斯曲線擬合及二階導(dǎo)數(shù)計算。根據(jù)其相應(yīng)峰的面積的相對百分比,計算不同二級結(jié)構(gòu)的組成。使用軟件OMNIC 8.2.0.387分析圖譜。

    1.4.9 總巰基含量

    稱取約0.5 g蝦肉,制備成10%的勻漿,8 000g常溫離心10 min,取上清液,按試劑盒微量法進(jìn)行測定。

    1.5 數(shù)據(jù)分析

    每組試驗至少重復(fù)3次,數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,質(zhì)構(gòu)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示,用Microsoft Excel 2019和Graphpad Prism 8進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、繪圖和Pearson相關(guān)性分析。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 凍藏期間小龍蝦蝦肉揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)的變化

    TVB-N是蛋白質(zhì)在酶和微生物的作用下被分解產(chǎn)生氨類堿性含氮揮發(fā)性物質(zhì),可用于評價水產(chǎn)品新鮮度[8]。如圖1,F(xiàn)X組和FS組的蝦肉TVB-N值在冷凍貯藏期間均呈逐漸增長的趨勢。FX和FS組蝦肉凍藏48周時的TVB-N值分別為22.93和11.90 mg/100 g,均未超過我國的水產(chǎn)品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)30 mg/100 g的限 量[13],仍可安全食用。整個貯藏期內(nèi),F(xiàn)X組與FS組小龍蝦的TVB-N值,分別上升332%和62.57%。FS組增幅更小,是因為小龍蝦經(jīng)熱燙預(yù)處理后能夠有效地殺死一定量微生物,進(jìn)而減緩蛋白質(zhì)被破壞速率[14]。

    圖1 小龍蝦凍藏過程中揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)含量的變化Fig.1 The change of total volatile basic nitrogen (TVB-N) content during the frozen storage of crayfish

    2.2 凍藏期間小龍蝦蝦肉微觀結(jié)構(gòu)變化

    從蝦肉組織切片的HE染色圖和TEM圖(圖2)可以看出,新鮮蝦肉(X0)的肌絲緊密,肌絲間隔小,肌節(jié)結(jié)構(gòu)清晰,Z線、M線完整。經(jīng)煮制后的蝦肉(S0)肌節(jié)排列紊亂,融合,Z線、M線消失,結(jié)構(gòu)破壞比較嚴(yán)重,肌絲略微水腫,這是由于蒸煮后,肌絲膨潤,蛋白發(fā)生不均勻聚集,三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)無序,致密。相比于新鮮蝦肉(X0),經(jīng)煮制后的蝦肉(S0)的肌絲間隔更小,表明蒸煮處理會使肌絲膨潤。

    凍結(jié)過程中,主要形成胞外冰晶,一方面通過肌膜兩側(cè)滲透壓的改變來促進(jìn)細(xì)胞脫水[15](圖2a白色區(qū)域),另一方面,冰晶的體積膨脹[16],擠壓破壞肌球蛋白頭部[17],蝦肉肌節(jié)Z線、M線降解,肌節(jié)縮短(圖2b),也表現(xiàn)為蝦肉彈性在前四周顯著降低 (P<0.05)(圖3)。蒸煮后凍藏48周的蝦肉(FS48),蝦肉肌節(jié)破壞嚴(yán)重,肌絲間隔更大,是由于蒸煮使蛋白分子間的靜電斥力減小,不利于維持原有蛋白三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),導(dǎo)致肌絲密度下降,結(jié)構(gòu)松散。另外,冷凍貯藏期間肌節(jié)的縮短(圖2b),會對高溫蒸煮后蛋白的變性造成影響[18],導(dǎo)致凍藏過的蝦烹飪后口感變差。

    圖2 小龍蝦凍藏0周和48周的微觀結(jié)構(gòu)的變化Fig.2 Changes in microstructure of crayfish frozen for 0 and 48 weeks

    2.3 凍藏期間小龍蝦蝦肉質(zhì)構(gòu)的變化

    如圖3為凍藏過程中小龍蝦的質(zhì)構(gòu)變化情況,從圖中可以看出,隨著凍藏時間的延長,F(xiàn)X組的彈性、咀嚼性、凝聚性均有顯著性降低,在0~4周下降速度較快,硬度有所降低,但變化不顯著性。FS組蝦肉質(zhì)構(gòu)變化波動較大,彈性在0~4周顯著性降低,硬度在36周開始顯著性降低,同時伴隨著彈性降低,凝聚力升高,咀嚼性無顯著性變化。

    圖3 小龍蝦凍藏過程中質(zhì)構(gòu)的變化Fig.3 Changes in texture of crayfish during frozen storage

    凍藏對新鮮蝦肉的形變影響不明顯,但對煮熟蝦肉有明顯影響,可能因為熟制蝦肉蛋白間靜電作用斥力減小,凍結(jié)后,肌肉結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性變差[3]。Shi等[19]研究凍藏小龍蝦,24周時發(fā)現(xiàn)肌肉組織在解凍后變成令人不快的糊狀。本實驗觀察到FX組蝦肉經(jīng)長期凍藏后外表發(fā)白,出現(xiàn)水分的不均勻干耗(圖4),可能對蝦肉凝聚力下降有影響,但對硬度影響不明顯。凝聚力被定義為內(nèi)部鍵的強(qiáng)度,凝聚力和彈性有相同趨勢,值越高,口感更好[20]。有研究指出,在短期冷凍儲存期間,肌原纖維蛋白會從規(guī)則的絲狀網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)變?yōu)楦叨染奂慕Y(jié)構(gòu),變性的肌原纖維蛋白會產(chǎn)生具有更多球狀微觀結(jié)構(gòu)的凝膠[21],這種蛋白間靜電作用斥力降低的表現(xiàn),可能是凍藏過程中FX組凝聚力顯著降低的原因。當(dāng)?shù)鞍鬃冃猿潭雀邥r,解凍后的冰晶不會被重新吸收,肌肉細(xì)胞也不會恢復(fù)[22,23]。FX組的咀嚼性在0~2周下降最快,其后較為穩(wěn)定,表明凍藏初期蛋白三級結(jié)構(gòu)的破壞較大;而煮熟后凍藏的FS組,由于熱變性使蛋白亞基重新結(jié)合,三級結(jié)構(gòu)更致密,并且酶被高溫滅活,所以凍藏對其結(jié)構(gòu)影響較小[16]。

    圖4 小龍蝦凍藏過程中肌肉損傷模式圖Fig.4 Damage pattern during freezing and storage of crayfish

    2.4 凍藏期間小龍蝦蝦肉蛋白質(zhì)成分變化

    小龍蝦蝦肉蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜中主要包括7個條帶(圖5):肌球蛋白重鏈(MHC,200 ku)、副肌球蛋白(Paramyosin,105 ku)、未知蛋白(75 ku)、肌動蛋白(Actin,48 ku)、肌鈣蛋白亞基(原肌球蛋白結(jié)合亞基)(Troponin T,TnT,37 ku)、原肌球蛋白(Tropomysin,Tm,35 ku)、肌球蛋白輕鏈(MLC,17~20 ku)。從圖4中可以看出,凍藏期間肌球蛋白頭部(MHC和MLC)條帶變窄,表明其發(fā)生降解或者交聯(lián)[8],同時發(fā)現(xiàn)上樣孔處蛋白聚集。FX鮮蝦組170 ku左右的條帶,在凍藏后消失,表明該處蛋白可能對冷敏感;副肌球蛋白可能降解成87 ku左右的新條帶;75 ku蛋白也發(fā)生降解。FS熟蝦組MHC有輕微降解;170 ku條帶也消失,說明該處蛋白可能同時具有熱敏感性,在加熱蒸煮過程中消失。

    圖5 小龍蝦凍藏不同天數(shù)的全蛋白條帶變化Fig.5 Changes in protein fraction of crayfish frozen for different days

    綜合來看,冷凍使蝦肉肌纖維的細(xì)絲和粗絲蛋白變性,導(dǎo)致高分子量蛋白聚集,或水解成小分子蛋白。MHC通過共價鍵和非共價鍵發(fā)生交聯(lián),并且蛋白質(zhì)的交聯(lián)會增加水分損失和使肉質(zhì)口感變差[24]。Kaewprachu等[12]研究發(fā)現(xiàn)凍藏期間肌原纖維蛋白可能通過二硫鍵交聯(lián),MLC的SHa亞基團(tuán)也會參與MHC的氧化和其二聚體的形成[25]。肌動蛋白與肌球蛋白頸部(Tm,TnT)在凍藏期間較為穩(wěn)定。蒸煮后冷凍的熟蝦肉蛋白質(zhì)電泳條帶變化不明顯,可能是由于上樣緩沖液中DTT對二硫鍵的還原作用導(dǎo)致無法觀察到交聯(lián)作用。

    2.5 凍藏期間小龍蝦蝦肉脂質(zhì)氧化變化

    肌肉凍藏過程中,發(fā)生的脂肪氧化會對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能性產(chǎn)生不利的影響。冷凍會損害細(xì)胞結(jié)構(gòu),尤其是膜脂,從而造成肉類氧化,并且脂質(zhì)氧化是一種自催化反應(yīng),其中一些中間和最終氧化產(chǎn)物自由基具有促氧化作用,能促進(jìn)蛋白氧化。如圖6所示,F(xiàn)X組蝦肉的TBARS值在0~5周呈上升趨勢(0.07~ 0.24 mg/kg樣品),特別是在凍藏前2周,上升速度較快,在2~5周期間變化不顯著,第5周達(dá)到最大值后開始下降(0.24~0.11 mg/kg樣品)。FS組蝦肉的TBARS值在前5周保持緩慢增加,同樣在第5周達(dá)到最高值(0.33 mg/kg樣品)。丙二醛(MDA)是脂質(zhì)氧化過程中的中間副產(chǎn)品,隨脂肪氧化,MDA逐漸增多,然后被進(jìn)一步氧化成其他有機(jī)酸和醇,導(dǎo)致TBARS值下降[26]。

    圖6 小龍蝦凍藏過程中硫代巴比妥酸值(TBARS)的變化Fig.6 Changes in thiobarbituric acid values (TBARS) during frozen storage of crayfish

    2.6 凍藏期間小龍蝦蝦肉蛋白羰基含量的變化

    如圖7所示,凍藏過程中,F(xiàn)X組和FS組蝦肉的蛋白氧化持續(xù)發(fā)生,F(xiàn)X組蝦肉羰基含量從0.028增加至0.094 μmol/g,F(xiàn)S組蝦肉羰基含量從0.009增加至0.042 μmol/g。FX組羰基含量增長速率高于FS組,且在0~4周上升速率較快,后期較為平穩(wěn)。FS組增長速度較為穩(wěn)定。說明鮮蝦組初期蛋白氧化變性較快,后期氧化變性更為緩慢,熟蝦組的氧化變性恒速進(jìn)行[3]。熟制后凍藏的蝦肉羰基增量小于鮮蝦凍藏組,可能是由于熟蝦蛋白聚集嚴(yán)重,大部分羰基被包裹與蛋白疏水性內(nèi)側(cè)。

    圖7 小龍蝦凍藏過程中羰基含量的變化Fig.7 Changes in carbonyl content of crayfish during frozen storage

    2.7 凍藏期間小龍蝦蝦肉蛋白質(zhì)表面疏水性變化

    疏水相互作用在維持蛋白質(zhì)構(gòu)象中起著主要的作用,由于蒸煮后的蝦肉蛋白發(fā)生嚴(yán)重不可逆變性,而無法提取肌原纖維蛋白[14],沒有測得其表面疏水性變化。如圖8,在凍藏前3周,F(xiàn)X組蝦肉蛋白質(zhì)的表面疏水度緩慢上升,然后緩慢下降,整個凍藏期,表面疏水度下降了44.25%(97.09~54.13 BPB結(jié)合量/μg)(P<0.05)。凍結(jié)使疏水相互作用變?nèi)醵鴼滏I變強(qiáng)[5],蛋白質(zhì)內(nèi)核中埋藏非極性殘基的穩(wěn)定降低是蛋白冷變性的原因[27]。凍藏期間,蝦肉蛋白首先解折疊,然后聚集。凍藏前3周,蛋白質(zhì)的展開占主導(dǎo)地位,蛋白與水的氫鍵作用增強(qiáng),蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)打開并逐漸伸展,使埋藏在分子內(nèi)部的疏水性氨基酸殘基暴 露[28],例如疏水性脂肪族和芳香族氨基酸的暴露[14]。隨后,蛋白質(zhì)的聚集占主導(dǎo)地位。一方面,活性基團(tuán)的暴露引起蛋白分子間作用增強(qiáng),蛋白質(zhì)分子的再聚集導(dǎo)致更多疏水性殘基被包裹于更加疏水的分子內(nèi)部,從而引起肌原纖維蛋白的表面疏水度下降[29]。另一方面,凍藏過程發(fā)生的蛋白質(zhì)側(cè)鏈氧化,這引起蛋白中極性和非極性基團(tuán)數(shù)量改變,減少了靜電作用力[30],蛋白與蛋白的氫鍵作用增強(qiáng),疏水作用力增強(qiáng),使得蛋白表面疏水度和溶解度下降[31]。

    圖8 小龍蝦凍藏過程中表面疏水度的變化Fig.8 Changes in surface hydrophobicity of crayfish during frozen storage

    2.8 凍藏期間小龍蝦蝦肉蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化

    酰胺Ⅰ帶被認(rèn)為是研究蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中最有價值的區(qū)域,其中1 600~1 639 cm-1被認(rèn)為歸屬于β-折疊結(jié)構(gòu),1 640~1 650 cm-1歸屬于無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu),1 651~1 660 cm-1歸屬于α-螺旋結(jié)構(gòu),1 661~1 700 cm-1歸屬于β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)[32]。從圖9可以看出,凍藏期間,F(xiàn)X組和FS組蝦肉蛋白質(zhì)的α-螺旋和無規(guī)卷曲有向β-折疊與β-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)變的趨勢。肌球蛋白主要由α-螺旋構(gòu)成,α-螺旋的降低和疏水基團(tuán)的暴露,常伴隨著β-折疊的增加[33]。α-螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定主要由單肽鏈上羰基(C=O)與氨基(N-H)間形成的鏈內(nèi)氫鍵維持,β-折疊結(jié)構(gòu)則依賴蛋白質(zhì)分子肽鏈間的氫鍵形成[34]。凍藏過程中,α-螺旋的減少和β-折疊的增多,對應(yīng)說明蛋白分子間靜電斥力減小,疏水相互作用增強(qiáng),蛋白與水間的氫鍵作用力變小,蛋白與蛋白分子間氫鍵增多,蛋白可能發(fā)生聚集[35]。相對來看,F(xiàn)S組的β-結(jié)構(gòu)波動較小,僅在4和8周明顯體現(xiàn),程麗娜 等[34]研究認(rèn)為冷凍對分子間作用力,如疏水作用力影響較大,可能是由于高溫蒸煮使蛋白不可逆變性,蛋白與蛋白間的氫鍵作用很強(qiáng),所以凍藏對熟制蝦肉的分子間疏水作用力改變較小。

    圖9 小龍蝦凍藏過程中蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化Fig.9 Changes in protein secondary structure during frozen storage of crayfish

    2.9 凍藏期間小龍蝦蝦肉蛋白質(zhì)總巰基含量變化

    巰基氧化是以自由基為媒介的蛋白質(zhì)氧化反應(yīng)。如圖10所示,F(xiàn)X組蝦肉蛋白質(zhì)在凍藏48周后,總巰基的含量降低41%。巰基含量降低表明蛋白發(fā)生了變性,或者通過形成分子間的二硫鍵而聚集,或者發(fā)生了氧化。二硫鍵主要參與蛋白質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成,它可以在凍結(jié)、冷凍儲存或解凍過程中形成,然后蛋白質(zhì)的疏水鍵和親水鍵再在分子內(nèi)和分子間發(fā)生重排形成穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[15]。凍藏期間,F(xiàn)S組的總巰基含量在0.26~0.81 μmol/g樣品范圍波動變化,可能是因為熟肉中總巰基含量較低,初始值僅為0.61 μmol/g樣品,多數(shù)已經(jīng)通過高溫氧化交聯(lián),并由于蛋白變性而被埋藏在蛋白疏水內(nèi)部,DTNB不能進(jìn)入內(nèi)部與游離巰基反應(yīng),因此在整個凍藏期間,總巰基含量在較低的范圍內(nèi)波動,這與Dai等[16]研究短期凍藏預(yù)蒸煮豬肉,巰基穩(wěn)定下降結(jié)果不同。

    圖10 小龍蝦凍藏過程中總巰基含量的變化Fig.10 Changes in total sulfhydryl content during frozen storage of crayfish

    2.10 凍藏期間小龍蝦蝦肉蛋白質(zhì)不同指標(biāo)間的相關(guān)性分析

    由圖11可見,F(xiàn)X鮮蝦組,羰基含量與內(nèi)聚力呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),與咀嚼性、硬度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),表明蛋白氧化顯著影響蝦肉口感;TVB-N和表面疏水性呈著負(fù)相關(guān)(P<0.05);質(zhì)構(gòu)參數(shù)之間有相互影響,表現(xiàn)為內(nèi)聚力與硬度呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),與硬度呈顯著正相關(guān)(P<0.05),咀嚼性與硬度呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),與硬度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。

    圖11 小龍蝦凍藏過程中不同測定指標(biāo)之間Pearson相關(guān)系數(shù)熱圖Fig.11 Heat map of Pearson correlation coefficients between different measured indicators during frozen storage of crayfish

    FS熟蝦組,硬度與內(nèi)聚力呈極顯著負(fù)相關(guān) (P<0.01),表明細(xì)胞間作用力顯著影響蝦肉硬度;羰基含量與內(nèi)聚力、TVB-N呈顯著正相關(guān)(P<0.05),與咀嚼性呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),表明蛋白氧化顯著影響蛋白降解和蛋白間作用力;TVB-N與TBARS呈顯著正相關(guān)(P<0.05),表明脂質(zhì)氧化顯著影響蛋白降解。

    3 結(jié)論

    鮮活凍結(jié)和蒸煮后凍結(jié)的小龍蝦在冷凍貯藏48周后,TVB-N值分別為22.93和11.90 mg/100 g,均未超過安全限值,但蝦肉質(zhì)構(gòu)相關(guān)指標(biāo)的顯著變化。隨著凍藏時間的延長,肌原纖維蛋白發(fā)生降解和聚集,蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化,α-螺旋和無規(guī)卷曲向β-折疊與β-轉(zhuǎn)角發(fā)生轉(zhuǎn)變。蛋白疏水相互作用變?nèi)醵鴼滏I變強(qiáng),蛋白質(zhì)側(cè)鏈和脂肪的氧化也改變了體系的靜電作用力,表面疏水度從97.09升至122.16 BPB結(jié)合量/μg,再下降至82.79 BPB結(jié)合量/μg,蛋白質(zhì)和脂肪的氧化作用持續(xù)發(fā)生。

    鮮活凍結(jié)和蒸煮后凍結(jié)的小龍蝦相比,各項指標(biāo)的變化趨勢相似,蝦肉在凍藏期間的質(zhì)構(gòu)劣化和TVB-N值上升與肌肉蛋白質(zhì)的羰基含量、表面疏水性、TBARS值具有顯著相關(guān)性。熟蝦在長期冷凍貯藏期間蛋白質(zhì)理化指標(biāo)與活蝦冷凍組相比波動較小,主要是因為蒸煮使蝦肉蛋白完全變性,蝦肉脫水、滅酶,減少了凍藏期間冰晶對肌肉纖維的機(jī)械損傷和氧化作用。所以建議小龍蝦進(jìn)行蒸煮處理后再進(jìn)行冷凍貯藏。

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