GABA旁路在阪崎克羅諾桿菌耐干燥脅迫中的作用

黎麗，曹怡芳，張艷，肖性龍

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

阪崎克諾桿菌是一種桿狀的革蘭氏陰性能嚴(yán)重危 害特定人群生命安全的條件致病菌[1]。它可導(dǎo)致新生兒嚴(yán)重的腦膜炎、小腸結(jié)腸炎、敗血癥和菌血癥，死亡率高達(dá)27%[2]。出生后兩個(gè)月內(nèi)的新生兒，尤其是體重不足的早產(chǎn)兒[3]，胃酸較少，免疫能力不足，他們的細(xì)菌感染風(fēng)險(xiǎn)更高[4]，病死率可達(dá)到40%~80%[5]。相對于其它常見食源性致病菌大腸桿菌O157:H7、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌，阪崎克羅諾桿菌具有更強(qiáng)耐干燥脅迫能力[6]。在高溫干燥的生產(chǎn)環(huán)境中，阪崎克羅諾桿菌在PIF基質(zhì)成分的保護(hù)作用下，依舊能表現(xiàn)出較強(qiáng)的存活能力[7]，PIF在生產(chǎn)過程中通常采用巴氏殺菌，PIF生產(chǎn)設(shè)施中與克羅諾桿菌污染較高相關(guān)的區(qū)域包括噴霧干燥器、流化床和空氣過濾設(shè)施[8]，巴氏滅菌只能在PIF生產(chǎn)的早期階段滅活阪崎克羅諾桿菌，但在控制來自下游成分、過濾器、噴霧干燥塔和其他加工設(shè)備的污染方面無效，阪崎克羅諾桿菌能在噴霧干燥中存活并長期存在[9]。由此可能形成巨大的食品安全隱患，成為食品微生物污染與控制的難點(diǎn)。綜上所述，研究阪崎克羅諾桿菌耐干燥，最重要的一個(gè)原因是其污染的傳播途徑是水分活度低級(jí)的食品-PIF，因此研究阪崎克羅諾桿菌耐干燥特性有重要意義。

γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric Acid，GABA）是一種廣泛存在于微生物和動(dòng)物、植物中的非蛋白氨基酸。γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶基因gabT是阪崎克羅諾桿菌代謝GABA分支的關(guān)鍵基因之一。在植物方面，在高等植物中，很多研究報(bào)導(dǎo)表明GABA旁路是植物耐受干旱脅迫的重要機(jī)制，逆境脅迫會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)大量積累GABA[10]。Bao等[11]通過沉默番茄中g(shù)abT基因，導(dǎo)致番茄中GABA含量增加，琥珀酸含量降低，提高番茄耐鹽性。Renault等[12]研究表明，gabT是耐鹽擬南芥GABA代謝調(diào)控的關(guān)鍵。GABA代謝旁路在微生物對環(huán)境脅迫如耐酸[13]、應(yīng)激反應(yīng)[14]和致病性細(xì)菌毒力[15]的響應(yīng)中起著重要作用。研究表明，突變的gabT基因降低了丁香假單胞菌[16]的致病性。Hu等[17]通過使用iTRAQ等蛋白組學(xué)方法系統(tǒng)性研究了阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544的耐干燥脅迫機(jī)制，發(fā)現(xiàn)在干燥脅迫下腐胺（Putrescine）代謝相關(guān)的酶PuuR、PuuA、PuuD大幅上調(diào)表達(dá)，表明菌體內(nèi)GABA的合成被大幅激活，因而顯示了腐胺等多胺降解積累的GABA可能是阪崎克羅諾桿菌耐干燥脅迫的重要機(jī)制，合成路徑如圖1所示。因此，GABA對生物體耐受逆境脅迫有重要作用，然而相關(guān)研究多見于植物，但在細(xì)菌方面的研究很少。gabT基因是否能通過調(diào)節(jié)GABA代謝影響阪崎克羅諾桿菌的活性，干燥應(yīng)激環(huán)境對GABA合成量有什么影響尚不清楚。

鑒于阪崎克羅諾桿菌較其他腸桿菌具有較強(qiáng)的干燥環(huán)境耐受性，能夠長期生存于PIF中，且對新生兒有潛在的危害性，因此對于阪崎克羅諾在干燥環(huán)境耐受機(jī)制的研究有重大意義。為了探究gabT基因是否能通過調(diào)節(jié)GABA代謝影響阪崎克羅諾桿菌的活性，干燥應(yīng)激環(huán)境對GABA合成量的影響，本研究通過基因敲除技術(shù)獲得阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544的gabT基因缺失株即ΔgabT菌株，以阪崎克羅諾桿菌野生株WT 和ΔgabT菌株為研究對象，開展干燥逆境脅迫下菌體存活率測定、細(xì)胞內(nèi)GABA含量測定實(shí)驗(yàn)，同時(shí)借助掃描電子顯微鏡分析干燥脅迫條件下野生株WT和ΔgabT菌株的形態(tài)變化，從而驗(yàn)證GABA代謝旁路在阪崎克羅諾桿菌耐干燥脅迫響應(yīng)中的重要作用。為阪崎克羅諾桿菌中基于GABA旁路的靶向調(diào)控奠定了基礎(chǔ)，從而為阪崎克羅諾桿菌防控提供新思路。

1 材料與方法

1.1 原料

1.1.1 原料與試劑

惠氏嬰幼兒配方奶粉，上?；菔?；無水乙醇（分析純）、2.5%戊二醛固定液（電鏡專用）均購于上海艾妍生物科技有限公司；GABA試劑盒（項(xiàng)目編號(hào)69-99842）購于Merck Biotech公司。

1.1.2 培養(yǎng)基及菌種

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；ΔgabT突變株在實(shí)驗(yàn)中獲得；菌種均在37 ℃，180 r/min搖床TSB中培養(yǎng)活化24 h，調(diào)整菌懸液濃度為6 lg CFU/mL后備用。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

XW-80A微型漩渦混合儀，上海瀘西分析儀器廠有限公司；UV-7500紫外可見分光光度計(jì)，上海棱光技術(shù)有限公司；LRH-250A-2恒溫培養(yǎng)箱，韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；LEO1530VP掃描電子顯微鏡，德國Zeiss公司；HZQ-F100恒溫振蕩培養(yǎng)箱，哈爾濱市東聯(lián)儀器有限公司；5424小型離心機(jī)，德國Eppendorf公司；YXQ-LS-100Ⅱ立式壓力蒸汽滅菌器，鄭州南北儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因敲除突變體的構(gòu)建

利用Luo等[18]的方法構(gòu)建了阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544的gabT敲除突變體，敲除位點(diǎn)如圖1所示。使用表1中的引物。將gabT基因上下游DNA片段進(jìn)行PCR融合，克隆到自殺載體質(zhì)粒pLP12cm中。將重組自殺載體從β2163轉(zhuǎn)移到阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544進(jìn)行同源重組。用0.4% L-阿拉伯糖篩選gabT基因突變體。用相同的引物對進(jìn)行測序，通過PCR確認(rèn)缺失突變體。在含有20 μg/mL氯霉素（Chloramphenicol，Cm）和0.3% D-葡萄糖的LB平板上，選擇整合質(zhì)粒到特定染色體位點(diǎn)的阪崎克羅諾桿菌單交叉細(xì)胞。在添加0.4% L-阿拉伯糖的反選擇LB平板上選擇雙交叉重組突變體。缺失突變體檢測采用兩種外部引物分別錨定gabT基因的上下游區(qū)域。

圖1 敲除基因位置示意圖Fig.1 Schematic diagram of knockout gene location

表1 基因敲除的引物設(shè)計(jì)Table 1 Primer design

1.2.2 干燥脅迫下WT和ΔgabT突變菌株存活率測定

將106CFU/mL的WT和ΔgabT突變株菌懸液重懸于復(fù)配嬰幼兒乳粉中，惠氏嬰幼兒配方奶粉（上?；菔希┮寻凑誈B 4789.40-2016所述檢測，證明無阪崎克羅諾桿菌污染。在無菌培養(yǎng)皿中制備0.5 mL點(diǎn)重懸的細(xì)菌培養(yǎng)物。將無蓋培養(yǎng)皿置于含脫水硅膠的40 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，干燥后蓋上蓋，在干燥皿中25 ℃保存。每隔一周用平板計(jì)數(shù)法測定存活細(xì)胞數(shù)量。本研究以 37 ℃ TSB培養(yǎng)12 h的阪崎克羅諾桿菌為對照樣品。

式中：

A——存活率，%；

n1——實(shí)驗(yàn)組菌落數(shù)；

n0——對照組菌落數(shù)。

1.2.3 干燥脅迫下WT和ΔgabT菌株GABA含量的測定

GABA含量按照GABA試劑盒操作說明進(jìn)行。試劑盒購于Merck Biotech公司（項(xiàng)目編號(hào)69-99842）。本試劑盒采用酶聯(lián)免疫吸附法測定標(biāo)本中GABA含量。GABA抗體、GABA與辣根過氧化物酶（HRP） 標(biāo)記的GABA抗體形成抗體-抗原-酶標(biāo)記的抗體復(fù)合物，經(jīng)徹底洗滌后與底物四甲基聯(lián)苯胺（TMB）著色。TMB經(jīng)辣根過氧化物酶（HRP）催化，在酸的作用下轉(zhuǎn)化為藍(lán)色和最終的黃色。顏色的深度與GABA呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀檢測培養(yǎng)物的OD450根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中GABA的濃度。

1.2.4 干燥脅迫對WT和ΔgabT菌株細(xì)胞形態(tài)的影響

參照Paula等[19]的方法，使用掃描電子顯微鏡觀察干燥脅迫對WT和ΔgabT突變菌株細(xì)胞膜形態(tài)的影響。使用生理鹽水溶出方法1.2.2中干燥后的蓋玻片上的細(xì)胞，加入2.5%的戊二醛溶液中固定過夜（4 ℃）。后用不同濃度梯度（10%、30%、50%、70%、90%、100%）的乙醇溶液依次洗脫菌體，每次10 min。真空干燥后，將蓋玻片粘貼在掃描電鏡專用載物臺(tái)上，待樣品脫水鍍金后，在Zeiss掃描電子顯微鏡下觀察細(xì)胞微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用和Origin 2021軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并繪圖，使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05為顯著差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 干燥脅迫對WT菌株和ΔgabT菌株存活率的影響

實(shí)驗(yàn)前已證明，ΔgabT菌株在適宜環(huán)境中能正常生長。通過平板計(jì)數(shù)法測定WT和ΔgabT菌株干燥后的存活率，如圖2所示，WT與ΔgabT菌株在干燥條件處理一周后的存活率均顯著下降。干燥一周后野生株存活率為1.57%，ΔgabT菌株存活率為28.64% （P＜0.05），可以看出，在干燥條件脅迫后，ΔgabT菌株存活率更高。隨著干燥時(shí)間的增加，在干燥第二周后，WT菌株存活率下降至0.18%，ΔgabT菌株存活率下降至20.66%（P＜0.05），由此可見，隨著干燥時(shí)間的增加，ΔgabT菌株存活率情況更顯優(yōu)勢，且證明在干燥環(huán)境中，阪崎克羅諾桿菌具有一定的存活能力并且能夠長期存活，這與易萌等[20]研究結(jié)果一致。在此之后，菌株的存活情況維持在較穩(wěn)定的狀態(tài)，干燥五周后WT和ΔgabT菌株存活率分別為0.15%和19.34%（P＜0.05）。說明gabT基因的缺失使得阪崎克羅諾桿菌在干燥脅迫條件下更易存活，且存活率相比野生型菌株大幅提升，表明gabT基因的缺失可能在一定程度上有助于細(xì)胞抵御干燥環(huán)境。

圖2 干燥處理后細(xì)菌存活率的變化Fig.2 Changes of bacterial survival rate after drying treatment

2.2 干燥脅迫對WT和ΔgabT菌株中GABA含量的影響

ΔgabT菌株和WT菌株中GABA含量結(jié)果如圖3所示，干燥兩周后，ΔgabT菌株GABA含量由 6.54 μmol/L增加到8.54 μmol/L（P＜0.05），WT菌株GABA含量由4.41 μmol/L增加到5.56 μmol/L （P＜0.05），在應(yīng)對干燥條件脅迫時(shí)，ΔgabT菌株和WT菌株中GABA含量都有所增加。干燥被認(rèn)為是一種高滲透的脅迫狀態(tài)，對于阪崎克羅諾桿菌在干燥環(huán)境中的調(diào)控機(jī)制由兩級(jí)相應(yīng)完成，第一級(jí)主要的反應(yīng)是積累電解質(zhì)，如鉀，谷氨酸等，由轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，通過提高細(xì)胞內(nèi)離子濃度使?jié)B透壓升高來抵消升高的外部滲透壓[21]。但長時(shí)間的維持較高的離子濃度可能會(huì)對細(xì)胞造成高濃度離子毒害作用，因此第二級(jí)反應(yīng)是基于吸收或合成其他種類具對細(xì)胞損傷較小且能長時(shí)間存在于細(xì)胞內(nèi)的相容性物質(zhì)，隨著相容性物質(zhì)的累積，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)滲透壓升高，以此來抵御外界環(huán)境對細(xì)胞的損傷[22]。GABA是一種四碳非蛋白氨基酸，在正常生理pH條件下為兩性離子，易溶于水。它的生化特性類似于小的滲透分子，如脯氨酸和甜菜堿。因此，GABA可以作為一種小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，增加細(xì)胞質(zhì)中的滲透水勢，提高細(xì)胞的保水性能，減緩干燥對細(xì)胞的損害。Shabarinath等[23]的相關(guān)研究表明，干燥環(huán)境下海藻糖在阪崎克羅諾桿菌中積累。且強(qiáng)調(diào)了其他次生滲透物質(zhì)如脯氨酸、膽堿等物質(zhì)在干燥生存中的潛在輔助作用。在干燥環(huán)境下，ΔgabT菌株和WT菌株都可能通過累積GABA來抵御干燥脅迫。

圖3 干燥處理后細(xì)菌GABA含量的變化Fig.3 Changes of GABA content of bacteria after drying

干燥五周后，ΔgabT菌株GABA含量達(dá)到 9.12 μmol/L，WT菌株在干燥2~5周期間GABA含量保持相對穩(wěn)定，在干燥5周后GABA含量為5.13 μmol/L（P＜0.05），由此可見，在干燥脅迫下ΔgabT菌株GABA含量顯著高于WT菌株，ΔgabT菌株由于gabT基因的缺失，其對應(yīng)的GABA轉(zhuǎn)氨酶功能缺失使得其具有更強(qiáng)的GABA累積能力。Du等[22]的研究也表明阪崎克羅諾桿菌的干燥阻力的調(diào)節(jié)機(jī)制與鉀積累和流出以及相容溶質(zhì)的吸收和合成有關(guān)，與相容性物質(zhì)合成與轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的betAB、proVW等基因在耐干燥性強(qiáng)的菌株中的水平高于弱干燥耐受性菌株中的基因水平，這些基因的較高水平可能使菌株對干燥環(huán)境更具抵抗力。在本研究中，ΔgabT菌株在干燥脅迫下積累了更高的GABA（圖3），這一結(jié)果與推測是吻合的。在ΔgabT中，由于gabT基因的缺失，GABA代謝受阻，導(dǎo)致GABA積累。GABA的積累有助于細(xì)胞抵抗干燥脅迫，ΔgabT菌株較于WT菌株更高水平的GABA累積導(dǎo)致ΔgabT的存活率高于WT。

2.3 干燥脅迫對WT和ΔgabT菌株細(xì)胞形態(tài)的影響

通過掃描電子顯微鏡觀察了干燥一周后野生型菌株和ΔgabT突變株菌體形態(tài)的變化，結(jié)果如圖4。從圖4中可以看出，未經(jīng)處理的WT菌體無褶皺，菌體表面光滑（圖4a），菌體形態(tài)輪廓正常；未經(jīng)處理的ΔgabT菌體呈現(xiàn)出輕微皺縮情況（圖4c），經(jīng)干燥條件處理后，野生型菌株與ΔgabT突變株菌體均出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象（圖4b和4d），表面輪廓不完整現(xiàn)象。相比與ΔgabT菌株而言，WT菌體部分出現(xiàn)皺縮、粘連、破裂現(xiàn)象，菌體變形更加嚴(yán)重（圖4b）。上述結(jié)果表明，干燥環(huán)境對于阪崎克羅諾桿菌WT菌株和ΔgabT菌株細(xì)胞形態(tài)會(huì)造成一定的破壞和損傷，但菌體依然具有存活能力，依舊具有一定的危害性。

圖4 干燥處理后細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)的變化Fig.4 Changes of bacterial cell microstructure after drying

由細(xì)胞形態(tài)變化可以發(fā)現(xiàn)，干燥對于ΔgabT突變株菌體形態(tài)影響更小，由此推測出gabT基因的缺失使得細(xì)胞內(nèi)GABA代謝受阻進(jìn)一步累積，維持細(xì)胞內(nèi)滲透壓在一定程度上保護(hù)細(xì)胞膜的完整性。微生物細(xì)胞膜的完整性是保證其維持自身新陳代謝等正常生理活動(dòng)的重要因素[24]。胡心怡等[25]研究發(fā)現(xiàn)百里香酚與肉桂醛通過破壞沙門氏菌細(xì)胞膜的完整，從而抑制了沙門氏菌的增殖。失水干燥引起細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)的滲透性失衡，膨脹壓力的損失導(dǎo)致水在細(xì)胞膜上的位移，并導(dǎo)致細(xì)胞收縮[26]。ΔgabT菌株中GABA的大量累積，在一定程度上保護(hù)了細(xì)胞失水收縮，相對于WT菌株而言使菌體的細(xì)胞膜不易造成破壞和損傷，菌體形態(tài)不易發(fā)生改變。細(xì)胞膜是細(xì)菌與環(huán)境間的半透膜屏障，當(dāng)其結(jié)構(gòu)和完整性被破壞，將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞失去正常的生理代謝活動(dòng)，進(jìn)而使菌體失活和死亡[27,28]，該過程往往伴隨著細(xì)胞膜的通透性的變化以及胞內(nèi)成分的流失[29]。因此，在干燥條件下GABA的累積在有助于維持阪崎克羅諾桿菌的胞內(nèi)滲透壓，維持菌體形態(tài)的基礎(chǔ)上一定程度保證細(xì)胞正常生理代謝活動(dòng)，進(jìn)而防止其因細(xì)胞膜通透性變化導(dǎo)致的內(nèi)容物泄露以及細(xì)胞收縮導(dǎo)致菌體的死亡。

3 結(jié)論

本文通過基因敲除手段，構(gòu)建ΔgabT菌株，同時(shí)對WT菌株和ΔgabT菌株耐干燥能力及GABA含量測定。干燥條件下ΔgabT菌株存活率明顯高于WT菌株，且ΔgabT菌株干燥中GABA含量也遠(yuǎn)高于WT菌株，說明GABA的積累與gabT基因缺失有關(guān)，且GABA累積在耐干燥脅迫中具有關(guān)鍵作用，在干燥條件下通過調(diào)控GABA的代謝，保護(hù)阪崎克羅諾桿菌抵抗干燥脅迫，結(jié)合掃描電子顯微鏡檢測進(jìn)一步證實(shí)了GABA累積有助于阪崎克羅諾桿菌抵御干燥脅迫。故經(jīng)基因敲除手段獲得的ΔgabT菌株由于GABA代謝受阻，GABA累積使得干燥后阪崎克羅諾桿菌更耐干燥?？偨Y(jié)得出gabT基因在干燥脅迫下的功能特性以及GABA含量與菌體耐干燥脅迫關(guān)系，在已有傳統(tǒng)物理化學(xué)致病菌防控手段基礎(chǔ)上為探究阪崎克羅諾桿菌逆境脅迫機(jī)制提供新的思路，為預(yù)防和控制食品（特別是嬰幼兒配方奶粉）中阪崎克羅諾桿菌污染奠定基礎(chǔ)。