氣調(diào)貯藏對(duì)瑞雪蘋果的保鮮效果與果皮褐變機(jī)制的初探

高名月，趙政陽(yáng)，王燕，梅振芳，牛軍鵬，王雷存，惠偉,3*

1(陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安，710000)2(西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西 咸陽(yáng)，712000)3(陜西師范大學(xué) 西部果品資源高值利用教育部工程研究中心，陜西 西安，710000)

瑞雪蘋果(Malusdomesticacv Ruixue)是西北農(nóng)林科技大學(xué)以秦富1號(hào)和粉紅女士雜交培育的黃色晚熟蘋果新品種，豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、抗逆性強(qiáng)、肉質(zhì)細(xì)脆、酸甜可口、果面潔凈、香氣誘人，是內(nèi)外品質(zhì)兼優(yōu)的上等果[1]。瑞雪在陜西省已經(jīng)推廣栽培10萬(wàn)畝，售價(jià)是富士蘋果的2～4倍，未來(lái)具有巨大的發(fā)展?jié)摿?。不套袋的瑞雪耐貯藏，套袋瑞雪果面潔凈，呈黃綠色，具有引人注目的品相。但套袋瑞雪在采收前后，有部分果實(shí)梗洼處出現(xiàn)果皮褐變，冷藏過(guò)程中也有進(jìn)一步發(fā)展趨勢(shì)，影響了這一新品種的推廣[2]。因此，為控制套袋瑞雪果皮的褐變現(xiàn)象，降低其造成的損失，尋找合適的貯藏方式具有重要意義。同時(shí)，探究套袋瑞雪貯藏期間果皮褐變的原因，可為減少瑞雪果皮褐變提供理論依據(jù)。

目前我國(guó)蘋果主要以冷藏(cold storage，CS)方式貯藏保鮮，氣調(diào)貯藏(controlled atmosphere，CA)占比在10%以下，發(fā)達(dá)國(guó)家的蘋果氣調(diào)貯藏占總貯藏量的40%以上[3]。冷藏僅通過(guò)控制溫度和濕度來(lái)延緩果實(shí)衰老，而氣調(diào)貯藏是在冷藏的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步控制環(huán)境中的二氧化碳和氧氣的比例濃度，具有比冷藏更顯著的保鮮效果[4]。在蘋果、梨、獼猴桃、四季豆等多種果蔬上的研究發(fā)現(xiàn)，氣調(diào)貯藏可以有效抑制果蔬的呼吸強(qiáng)度，維持較高的抗氧化酶活性，從而提高貯藏品質(zhì)[5]。目前生產(chǎn)中，蘋果氣調(diào)貯藏O2體積分?jǐn)?shù)一般為2%～4%，CO2體積分?jǐn)?shù)為3%～5%，但富士蘋果對(duì)CO2較為敏感，前人研究表明，冷藏條件下控制環(huán)境中CO2體積分?jǐn)?shù)不超過(guò)2%，方可顯著延緩果實(shí)衰老，保持貯藏品質(zhì)，如果CO2>4%，則會(huì)出現(xiàn)不可逆的CO2傷害[6]。任小林等[7]認(rèn)為富士蘋果果肉致密，不利于氣體交換，因此不耐高CO2，氣調(diào)貯藏時(shí)的CO2濃度要始終低于O2濃度。瑞雪蘋果為富士芽變株系秦富1號(hào)的子代，繼承了果肉致密的特點(diǎn)，因此推測(cè)瑞雪蘋果也不耐高CO2，本研究參照富士蘋果的氣調(diào)貯藏條件來(lái)研究氣調(diào)貯藏對(duì)瑞雪果皮褐變的影響。

目前學(xué)術(shù)界初步認(rèn)為瑞雪果皮褐變是一種生理性病害，根據(jù)其發(fā)病時(shí)機(jī)和表現(xiàn)，初步認(rèn)為與果皮抗氧化能力下降有關(guān)。研究表明，果皮褐變主要是酚類物質(zhì)在多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)的催化下被氧化為醌，隨后進(jìn)一步被氧化成醌衍生物，最后積聚成不溶性黑色聚合物所導(dǎo)致[8]。此外，果皮褐變與抗氧化物質(zhì)含量和抗氧化酶活性降低密切相關(guān)，由于果皮細(xì)胞膜系統(tǒng)受到自由基攻擊，細(xì)胞的區(qū)域化結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致貯藏期果皮發(fā)生褐變[9-10]。李靜[11]發(fā)現(xiàn)，瑞雪果皮褐變可能與類黃酮含量降低、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和過(guò)氧化物酶(peroxidase, POD)活性降低相關(guān)。

由于瑞雪蘋果是新品種，在不同貯藏條件下的貯藏潛力尚未報(bào)道，氣調(diào)貯藏的低O2、高CO2環(huán)境對(duì)控制蘋果的虎皮病等果皮褐變有顯著效果。目前關(guān)于套袋瑞雪果皮褐變的研究主要集中在采前套袋類型的影響方面[2,11]，并未涉及采后貯藏保鮮技術(shù)對(duì)貯藏期果皮褐變影響的研究，也未見(jiàn)有關(guān)瑞雪蘋果氣調(diào)貯藏的報(bào)道。因此，本研究對(duì)比了冷藏(0 ℃)和氣調(diào)貯藏2種方式對(duì)瑞雪蘋果采后果實(shí)貯藏期生理品質(zhì)、果皮褐變的影響，同時(shí)關(guān)注果皮褐變與抗氧化能力的變化規(guī)律，為初步揭示瑞雪果皮褐變機(jī)理提供證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

于2018年10月22日，在陜西省白水縣商業(yè)果園采收套袋的瑞雪蘋果，采摘時(shí)挑選大小均勻、成熟度一致、無(wú)機(jī)械損傷和無(wú)病蟲(chóng)害的果實(shí)。果實(shí)采后當(dāng)日運(yùn)至陜西華圣果業(yè)有限公司，次日放于氣調(diào)庫(kù)和冷庫(kù)中。由于瑞雪蘋果為富士芽變株系秦冠的子代，因此本研究氣調(diào)貯藏指標(biāo)參考富士蘋果氣調(diào)貯藏指標(biāo)，具體指標(biāo)如下：2%～3% O2+1%～1.5% CO2，(0±0.5) ℃，相對(duì)濕度為90%～95%；冷藏指標(biāo)是(0±0.5) ℃，相對(duì)濕度為90%～95%。

在210 d貯藏期，各處理每30 d隨機(jī)取8個(gè)蘋果，重復(fù)3次。取出后立即帶回實(shí)驗(yàn)室，測(cè)定常規(guī)生理指標(biāo)后將果實(shí)果皮(厚度約0.5 mm)、果肉分開(kāi)，并用液氮把果皮速凍，然后保存到-80 ℃冰箱，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 儀器和設(shè)備

FT-327型果實(shí)硬度計(jì)，意大利Effegi公司；PAL-1數(shù)顯手持糖度計(jì)，日本ATAGO公司；TU-1810分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Fresco17臺(tái)式離心機(jī)，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 果皮褐變率和褐變指數(shù)的測(cè)定

在2種貯藏條件下各隨機(jī)挑選50個(gè)果實(shí)用來(lái)統(tǒng)計(jì)瑞雪果皮的褐變率和褐變指數(shù)。

果皮褐變率計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

果皮褐變指數(shù)參考DUAN等[12]，根據(jù)蘋果果實(shí)的褐變程度(褐變面積占整個(gè)果實(shí)表面積的百分比)，可將褐變蘋果的嚴(yán)重性分為4個(gè)等級(jí)：0級(jí)為果實(shí)無(wú)褐變情況；1級(jí)為果實(shí)褐變面積≤25%；2級(jí)為果實(shí)褐變面積為25%～50%；3級(jí)為果實(shí)褐變面積>50%。果皮褐變指數(shù)計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

1.3.2 品質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定

硬度：使用FT-327型硬度計(jì)測(cè)定果肉硬度，將蘋果靠近果體赤道部位對(duì)稱的兩個(gè)部位去皮，將直徑為1.1 cm的探頭刺入蘋果果肉深0.8 cm，讀數(shù)顯示果肉硬度值。

失重率：采用果實(shí)稱重法，每個(gè)貯藏庫(kù)分別隔30 d選取50個(gè)果實(shí)做好標(biāo)記，測(cè)定結(jié)果，測(cè)定完放回庫(kù)中，根據(jù)公式(3)計(jì)算：

(3)

可溶性固形物(soluble solids content，SSC)：使用PAL-1型數(shù)顯手持糖度計(jì)測(cè)定單果赤道兩對(duì)稱面果汁SSC含量。

可滴定酸(titratable acid,TA)：參照GINé-BORDONABA等[13]的酸堿指示劑滴定法，測(cè)定貯藏期間瑞雪蘋果果肉可滴定酸含量變化。

1.3.3 總酚含量和PPO活性的測(cè)定

參照高俊鳳[14]的Folin-Ciocalteu比色法并稍作修改測(cè)定瑞雪蘋果果皮總酚含量。

總酚提?。?%(體積分?jǐn)?shù))鹽酸-甲醇溶液中加入適量液氮研磨的果皮粉末，添加70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液，超聲45 min，避光浸提24 h，10 000 r/min離心15 min，留上清液。用福林酚法測(cè)定樣品中的總酚含量，每個(gè)樣品取3次重復(fù)。

果皮PPO的活性參考高俊鳳[14]的測(cè)定方法并稍作修改，取液氮保護(hù)下研磨好的果皮組織混樣2 g，添加0.1 mol/L PBS (pH 6)定容至25 mL，然后轉(zhuǎn)移到20 ℃水浴浸提30 min。于4 ℃下將該混合液，經(jīng)11 180×g離心15 min，取上清液(酶提取液)。反應(yīng)體系包含4.5 mL PBS、1 mL 0.1 mol/L焦兒茶酚和0.5 mL上清液。將反應(yīng)混合液置于37 ℃恒溫水浴槽中反應(yīng)15 min，在525 nm下測(cè)定吸光度，單位為U/(mg prot·min)。

1.3.4 類黃酮含量的測(cè)定

參照陳瑋琦等[15]，取研磨后的果皮凍樣于1%的鹽酸-甲醇溶液中，避光浸提24 h，70 ℃超聲波提取60 min，9 000 r/min離心10 min，取上清液用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測(cè)定果皮類黃酮含量，每個(gè)樣品取3次重復(fù)。

1.3.5 抗氧化酶活力的測(cè)定

果皮SOD的活性參考高俊鳳[14]的NBT法進(jìn)行測(cè)定，單位為U/(mg prot·min)。使用南京建成生物工程研究所的過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)可見(jiàn)光試劑盒測(cè)定CAT活性，單位為U/(mg prot·min)。

1.3.6 DPPH清除率的測(cè)定

參照陳瑋琦等[15]的方法并加以作改進(jìn)，測(cè)定DPPH自由基清除率，向0.5 mL不同濃度梯度的樣品甲醇溶液中加入4.5 mL DPPH-甲醇溶液，振蕩后靜置30 min，室溫下于517 nm處測(cè)定反應(yīng)液的吸光度值變化，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有果實(shí)處理和測(cè)定的指標(biāo)均重復(fù)3次，采用Graphpad Prism 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和作圖，SPSS 20.0軟件數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 氣調(diào)貯藏對(duì)瑞雪果皮褐變的影響

如圖1所示，新采收的瑞雪果面潔凈、雪白亮黃色、梗洼處未發(fā)生褐變。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，貯藏至120 d時(shí)，冷藏的果實(shí)發(fā)生了不同程度的褐變，且果面暗黃色，但氣調(diào)貯藏的果實(shí)還未褐變。貯藏至210 d時(shí)冷藏的果實(shí)褐變面積加大，發(fā)病情況加重，但氣調(diào)貯藏的果實(shí)褐變程度較輕，褐變面積小，不明顯。從直觀結(jié)果得出，相比于冷藏，氣調(diào)貯藏能顯著抑制果皮的褐變。

a-0 d;b-120 d;c-210 d

隨后，本研究對(duì)2種貯藏方式下瑞雪果皮的褐變率和褐變指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。如圖2所示，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，2種貯藏方式下瑞雪果皮的褐變率和褐變指數(shù)均逐漸增加，但氣調(diào)貯藏的褐變率和褐變指數(shù)始終低于冷藏，其中在貯藏60 d后，2種貯藏方式的果皮褐變率、褐變指數(shù)差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。該結(jié)果表明，氣調(diào)貯藏下瑞雪果皮褐變控制效果更好。

a-果皮褐變率；b-果皮褐變指數(shù)

2.2 氣調(diào)貯藏對(duì)瑞雪品質(zhì)的影響

2.2.1 氣調(diào)貯藏對(duì)瑞雪果實(shí)硬度和失重率的影響

貯藏過(guò)程中，果實(shí)硬度和失重率的變化在很大程度上直觀地反映了貯藏效果的好壞，是衡量果實(shí)商品性的重要指標(biāo)。由圖3-a可見(jiàn)，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，2種貯藏方式下瑞雪硬度均呈下降趨勢(shì)，氣調(diào)貯藏的瑞雪果實(shí)硬度顯著高于冷藏(P<0.05)。由圖3-b可見(jiàn)，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)果實(shí)失重率均不斷上升，但在貯藏60～180 d氣調(diào)貯藏瑞雪失重率顯著低于冷藏(P<0.05)。

a-硬度；b-失重率

2.2.2 氣調(diào)貯藏對(duì)瑞雪果實(shí)SSC、TA的影響

果實(shí)SSC、TA含量影響果實(shí)的風(fēng)味，與果實(shí)采后貯藏特性密切相關(guān)。由圖4-a可見(jiàn)，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，2種貯藏方式下瑞雪果實(shí)的SSC變化呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，氣調(diào)較冷藏提前30 d達(dá)到SSC峰值。貯藏期，氣調(diào)的瑞雪SSC始終顯著高于冷藏(P<0.001)。由圖4-b可見(jiàn)，在整個(gè)貯藏期間，TA呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，氣調(diào)貯藏果實(shí)的TA下降更緩慢，且在60 d后顯著高于冷藏(P<0.05)。相比于冷藏，氣調(diào)貯藏能夠延緩瑞雪果實(shí)SSC、酸度的降低，較好地保持果實(shí)品質(zhì)。

a-可溶性固形物；b-可滴定酸

2.3 氣調(diào)貯藏對(duì)瑞雪果皮抗氧化能力的影響

2.3.1 氣調(diào)貯藏對(duì)總酚含量及PPO酶活性的影響

果皮總酚含量和PPO酶活性的動(dòng)態(tài)變化，與貯藏過(guò)程中果皮的褐變密切相關(guān)。如圖5-a所示，在整個(gè)貯藏期間，總酚含量在2種貯藏方式下的變化趨勢(shì)基本一致，均為先升高后降低，且在120 d時(shí)均達(dá)到峰值。整個(gè)貯藏期，氣調(diào)貯藏的果皮總酚含量顯著高于冷藏(P<0.05)。如圖5-b所示，在整個(gè)貯藏期，氣調(diào)貯藏的PPO活性極顯著低于冷藏(P<0.01)。結(jié)果表明，氣調(diào)貯藏顯著抑制PPO活性的升高和酚類物質(zhì)的消耗。

a-總酚；b-PPO活性

2.3.2 氣調(diào)貯藏對(duì)類黃酮含量、DPPH自由基清除率的影響

類黃酮是植物重要的酚類次生代謝物，可以抑制脂類過(guò)氧化、清除自由基，是果實(shí)品質(zhì)的重要指標(biāo)；DPPH自由基清除率是反映果皮的抗氧化能力變化的重要指標(biāo)。如圖6-a所示，貯藏期間，2種貯藏方式下果皮類黃酮含量變化趨勢(shì)一致，貯藏第1個(gè)月降低，之后，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，果皮類黃酮含量呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，在120 d達(dá)到峰值。在貯藏60～210 d氣調(diào)貯藏的類黃酮含量顯著高于冷藏(P<0.05)。如圖6-b所示，2種貯藏方式下，DPPH自由基均隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)降低，氣調(diào)貯藏抑制了DPPH自由基清除率的降低，在60～210 d，氣調(diào)貯藏顯著高于冷藏(P<0.05)。

a-類黃酮；b-DPPH自由基清除率

2.3.3 氣調(diào)貯藏對(duì)抗氧化酶活性的影響

SOD、CAT是果皮中的活性氧清除酶，可以維持果皮活性氧代謝平衡。如圖7所示，在整個(gè)貯藏期，瑞雪果皮中SOD、CAT活性均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在120 d達(dá)到峰值。如圖7-a所示，在整個(gè)貯藏期，氣調(diào)貯藏方式的瑞雪果皮SOD活性均顯著高于冷藏(P<0.05)。如圖7-b所示，在整個(gè)貯藏期，氣調(diào)貯藏顯著抑制CAT活性降低，差異顯著(P<0.05)。結(jié)果表明，氣調(diào)貯藏能更好地保持瑞雪的SOD、CAT酶活性，維持其抗氧化能力。

a-SOD；b-CAT

2.4 貯藏期間瑞雪果皮褐變與各個(gè)抗氧化指標(biāo)的相關(guān)性

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性分析，如表1所示，瑞雪果皮褐變率與類黃酮含量、CAT酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與DPPH自由基呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與總酚含量、SOD酶活性呈負(fù)相關(guān)；瑞雪果皮褐變率與PPO酶活性呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。瑞雪果皮褐變指數(shù)與DPPH自由基和類黃酮含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與總酚含量、CAT活性、SOD活性呈負(fù)相關(guān)，同時(shí)褐變指數(shù)與PPO酶活性呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)果表明，瑞雪的果皮褐變與抗氧化能力有關(guān)系。

表1 瑞雪褐變與生理指標(biāo)的相關(guān)性

3 討論

本研究對(duì)比了冷藏和氣調(diào)貯藏對(duì)套袋瑞雪蘋果的保鮮效果。結(jié)果表明，氣調(diào)貯藏能夠減緩瑞雪蘋果果實(shí)硬度、TA、SSC、失重率的降低，減少貯藏?fù)p失。這可能是因?yàn)椋啾壤洳?，氣調(diào)貯藏不僅可以控制貯藏溫度還可以嚴(yán)格控制氣體成分，進(jìn)而有效抑制果實(shí)的代謝速率，減緩果實(shí)的成熟衰老[4]。

本文也對(duì)果實(shí)褐變的機(jī)制進(jìn)行初步探究。本文結(jié)果顯示，貯藏60 d以后，氣調(diào)貯藏較冷藏顯著抑制瑞雪蘋果的果皮褐變率和褐變指數(shù)(P<0.01)，表明氣調(diào)貯藏更好地維持了瑞雪的商品性，保鮮效果顯著提升。這和前人在蘋果、梨虎皮病上的研究結(jié)果類似，果皮褐變是蘋果、梨虎皮病的直觀癥狀，研究發(fā)現(xiàn)氣調(diào)貯藏能顯著抑制虎皮病的果皮褐變，在冷藏條件下，大部分蘋果、梨的貯藏期約為5個(gè)月，但氣調(diào)貯藏可將貯藏期延長(zhǎng)至10個(gè)月[16-17]。已有研究表明，大部分果皮褐變是貯藏后期果皮細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)失衡導(dǎo)致[18]。

SOD、CAT等抗氧化酶通過(guò)清除細(xì)胞內(nèi)活性氧，維持細(xì)胞氧化平衡，抑制活性氧對(duì)果皮細(xì)胞膜的攻擊，抗氧化物質(zhì)多酚、類黃酮等具有超強(qiáng)的活性氧清除力，參與抵抗植物脅迫應(yīng)答，從而減少果皮褐變發(fā)生[19-20]。本研究結(jié)果顯示，整個(gè)貯藏期，氣調(diào)貯藏的瑞雪果皮中總酚含量和SOD、CAT活性均顯著高于冷藏(P<0.05)；在貯藏60～210 d，氣調(diào)貯藏的果皮類黃酮含量和DPPH自由基清除率顯著高于冷藏(P<0.05)；整個(gè)貯藏期，氣調(diào)貯藏的果皮PPO活性極顯著低于冷藏(P<0.01)。這表明氣調(diào)貯藏減緩了抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)的降低，這和前人在石榴、芒果、蘋果上的研究結(jié)果類似[21-23]，即氣調(diào)貯藏的果實(shí)抗衰老、防褐變能力更強(qiáng)。此外，本研究分析表明瑞雪蘋果果皮褐變率和褐變指數(shù)與抗氧化相關(guān)指標(biāo)DPPH自由基、CAT活性、類黃酮含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，而與氧化指標(biāo)PPO活性呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。在果實(shí)的成熟衰老過(guò)程中，果實(shí)抗氧化能力逐漸降低，延緩果實(shí)中抗氧化酶活性的降低和抗氧化物質(zhì)含量的減少則抑制果實(shí)衰老，降低果實(shí)生理性病害發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。因此，本研究認(rèn)為氣調(diào)貯藏能夠減緩貯藏期果皮抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)的降低，抵御活性氧積累引起的衰老進(jìn)程，從而抑制瑞雪果皮褐變。

4 結(jié)論

相比冷藏，氣調(diào)貯藏能夠更好地維持套袋瑞雪蘋果的貯藏品質(zhì)，減緩套袋瑞雪蘋果果皮抗氧化能力降低，同時(shí)抑制PPO的活性。本研究得出，套袋瑞雪蘋果果皮褐變與果皮抗氧化能力下降密切相關(guān)，相比于冷藏，套袋瑞雪蘋果更適合氣調(diào)貯藏。本研究?jī)H初步明確氣調(diào)貯藏是套袋瑞雪保鮮的較好形式，未對(duì)不同氣調(diào)貯藏條件進(jìn)行比較，未來(lái)可以從氣調(diào)具體指數(shù)著手，尋找最佳的氣體成分組合，有效抑制套袋瑞雪的果皮褐變。