鞣花酸干預膜性腎病大鼠模型的實驗研究*

周翔 劉志文 成平 張三勇 許向青 姜文玲 唐程遠 賀理宇

(中南大學湘雅二醫(yī)院腎內科·腎臟疾病與血液凈化學湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410011)

膜性腎病(Membranous nephropathy，MN)是一種免疫復合物沉積于腎小球基底膜并伴基底膜增厚等病理改變?yōu)樘卣鞯哪I小球疾病[1-2]，根據(jù)病因分類，大約有五分之四的患者無明確病因稱之為特發(fā)性膜性腎病(Idiopathic membranous nephropathy，IMN)，另外20%的MN常常繼發(fā)于其他疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、血管炎、類風濕性關節(jié)炎、乙型病毒性肝炎等，稱之為繼發(fā)性膜性腎病。此外，藥物、毒物、腫瘤或環(huán)境因素等也可以引起繼發(fā)性膜性腎病[3]。鞣花酸(Ellagic acid，EA)是一種存在于各種軟質水果、堅果和其他植物組織中的天然多酚，有研究[4-5]證實，EA在潰瘍性結腸炎、結腸癌等多種疾病中具有抗氧化和抗炎等作用。在腎臟疾病中，亦有研究[6]報道，EA可以通過抑制腎組織氧化應激而對STZ誘導的糖尿病大鼠發(fā)揮腎臟保護作用。哺乳動物不育系20樣激酶(Mammalian sterile 20-like kinase 1，MST1)基因是Hippo信號通路中的關鍵基因[7]，核因子E2相關因子2(NF-E2-related factor 2，Nrf2)是一種重要的細胞抗氧化轉錄因子[8]。且已有文獻[9]報道，Mst1-Nrf2通路可以調控機體的氧化應激，既往采用丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、還原型谷胱甘肽(Reduced glutathione，GSH)和過氧化酶(Catalase，CAT)這3個比較公認的機體抗氧化能力作為監(jiān)測指標的研究[10]提示，EA可能通過Mst1- Nrf2通路抑制炎癥反應和氧化應激從而緩解阿霉素誘導的大鼠局灶節(jié)段性腎小球硬化。EA是否可通過Mst1- Nrf2通路改善MN的腎臟損傷尚少文獻報道。通過尾靜脈注射陽離子化牛血清白蛋白(Cationic bovine serum albumin，C-BSA)構建的MN大鼠模型是應用廣泛且成熟的動物模型之一[11-12]，本研究中利用此模型來評估EA在MN干預治療中可能的作用和機制，以期為臨床MN的治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠(SPF級、8周齡)購自于湖南斯萊克景達公司，在保證正常飲食飲水、晝夜規(guī)律等適宜其生長的常規(guī)環(huán)境中飼養(yǎng)。實驗動物的飼養(yǎng)和處理均遵循醫(yī)院醫(yī)學實驗動物倫理委員會的規(guī)范和條例。

1.2 主要試劑及儀器 鞣花酸購自于美國Sigma公司；C-BSA購自于美國Chondrex公司；GSH-PX測試盒、GSH檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒和CAT檢測試劑盒購自于南京建成生物公司；HE染色液、蘇木素分色液、多聚甲醛等購自于武漢塞維爾生物公司；cDNA 合成試劑盒、SYBR green QPCR擴增試劑盒購自于TaKaRa公司。使用的主要儀器包括美國Roche公司生產的實時熒光定量PCR儀、美國賽默飛公司生產的NanoDrop 2000 分光光度計、美國MD公司生產的多功能酶標儀、重慶博士泰生產的全自動特定蛋白分析儀、德國徠卡公司生產的熒光顯微鏡及石蠟切片機等。

1.3 方法

1.3.1 膜性腎病大鼠模型的構建、藥物干預及標本處理 將剛購置的大鼠隨機分為對照組、模型組、實驗組，實驗組和模型組各8只，對照組6只。MN大鼠模型制備過程如下：①預免疫處理：將1 mg C-BSA與0.5 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)和等量弗氏不完全佐劑充分震蕩，得到混合液體。之后每次將0.1 mL混合液體注射于模型組和實驗組大鼠的腹股溝、腋下等皮下部位，隔日一次，共注射3次，對照組不注射C-BSA，其余處理同模型組。②正式免疫處理：將2.5 mg C-BSA與1 mL的PBS充分混勻得到混合液體，實驗組和模型組大鼠注射0.5 mL混合液體，對照組大鼠單純注射同劑量PBS。都通過大鼠尾靜脈注射，且注射頻率為連續(xù)4周、每周3次。4周后通過特定蛋白分析儀測定的各組大鼠24 h尿蛋白定量結果，若模型組結果大于20 mg/L則考慮構建成功。③藥物干預：造模成功后，實驗組按200 mg/kg體重腹腔注入鞣花酸，注射頻率為每日一次、持續(xù)4周，模型組注入等體積生理鹽水。④四周后各組大鼠行異氟烷麻醉后處死,收集24 h尿液，常溫下2000 rpm、離心10 min，取上清液-80℃凍存。通過腹主動脈收集血液，常溫下4000 rpm、離心10 min，取上層血清-80℃凍存。摘取腎臟標本剪成小塊后分為兩份，一份用多聚甲醛固定后，石蠟包埋；其余分裝后-80℃凍存。

1.3.2 生化指標檢測方法 ①利用全自動生化儀測定血清膽固醇(Cholesterol，CHO)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、白蛋白(Alb)。②利用重慶博士泰全自動特定蛋白分析儀檢測尿總蛋白(Urinary total protein n，UTP)、尿白蛋白(Urinary albumin，Ualb)、尿1-MG、尿2-MG、尿NAG、尿NGAL和尿RBP等。③采用TBA法按試劑盒說明書步驟測定腎組織中MDA。④采用DTNB法按試劑盒說明書步驟測定腎組織中GSH。⑤采用鉬酸銨法按試劑盒說明書步驟測定腎組織中CAT的活性。

1.3.3 石蠟切片的免疫 熒光腎組織石蠟包埋后切片，按常規(guī)免疫組化操作順序脫蠟、水化、封閉、加抗體、封片等步驟后，使用熒光顯微鏡觀察。

1.3.4 實時熒光定量PCR 腎組織用Trizol處理后提取總RNA并測定RNA濃度，再用常規(guī)PCR儀反轉錄為cDNA，再根據(jù)試劑說明書流程采用RT-PCR檢測，使用Roche專業(yè)軟件進行相對定量法分析。

2 結果

2.1 鞣花酸對C-BSA誘導的大鼠膜性腎病模型常用臨床指標的改善作用 分別檢測3組大鼠模型的Scr、BUN、Alb、24 h UTP、CHO和腎小管性尿蛋白各指標水平(α1-MG、β2-MG、RPB、NAG和NGAL)。與對照組相比，模型組大鼠的Scr、BUN、Alb、24 h UTP及CHO水平均明顯惡化加重(P<0.05)。但當使用了鞣花酸干預后，與模型組大鼠相比，實驗組大鼠各項指標均顯著好轉(P<0.05)(見表1)。對于腎小管性尿蛋白，與對照組相比，模型組大鼠的尿α1-MG、尿β2-MG、尿RBP、尿NAG和尿NGAL水平均明顯升高(P<0.05)，但當使用了鞣花酸干預后，與模型組相比，實驗組大鼠各項指標均明顯下降(P<0.05)。見表2。

表1 3組大鼠模型血肌酐、尿素氮、血清白蛋白、24 h尿總蛋白和血膽固醇檢測結果Table 1 Results of serum creatinine,blood urea nitrogen,serum albumin,24-hour urine protein and blood cholesterol in rat models of the three groups

表2 3組大鼠模型腎小管性尿蛋白檢測結果Table 2 Results of renal tubular urinary protein in rat models of the three groups

2.2 鞣花酸緩解C-BSA誘導的大鼠膜性腎病的腎臟病理損傷 各組采用HE染色和IgG免疫熒光檢測來衡量其病理損傷程度。結果顯示，對照組大鼠腎臟組織中腎小球和腎小管結構完整清晰，免疫熒光染色IgG沉積較少；模型組大鼠腎小球體積明顯增大，部分腎小管萎縮消失；免疫熒光染色示IgG沿系膜區(qū)及毛細血管壁呈顆粒樣沉積。但當使用了鞣花酸干預后，上述病理損傷明顯減輕。見圖1。

圖1 鞣花酸緩解C-BSA誘導的大鼠膜性腎病的腎臟病理損傷(400×)Figure 1 Ellagic acid alleviates renal pathological damage induced by C-BSA in rats with MN注：A.HE染色；B.IgG的免疫熒光

2.3 鞣花酸緩解C-BSA誘導的大鼠膜性腎病的氧化應激 模型組MDA含量明顯高于對照組(P<0.05)，實驗組MDA水平較模型組明顯降低(P<0.05)。與對照組相比，模型組的GSH和CAT的水平均顯著降低，抗氧化能力減弱(均P<0.05)，而在使用了鞣花酸干預后，GSH和CAT的水平均顯著上調(P<0.05)。說明使用鞣花酸干預后可以顯著提升C-BSA誘導的大鼠膜性腎病的抗氧化能力。見表3。

表3 3組大鼠模型血清丙二醛、谷胱甘肽和過氧化氫酶檢測結果Table 3 Results of serum malondialdehyde,glutathione and catalase in rat models of the three groups

2.4 鞣花酸可抑制Mst1的表達，促進Nrf2的表達 與對照組比較，模型組Mst1 mRNA表達升高，Nrf2 mRNA表達下降(均P<0.05)，但當使用了鞣花酸干預后，與模型組相比，Mst1 mRNA表達下降，Nrf2 mRNA表達升高(均P<0.05)。同時，通過蛋白免疫印跡也進一步確定鞣花酸治療可以抑制MN大鼠MST1蛋白表達、促進NRF2蛋白表達(P<0.05)。提示鞣花酸可能通過Mst1-Nrf2通路對C-BSA誘導的MN大鼠發(fā)揮腎臟保護作用。見圖2。

圖2 鞣花酸可抑制Mst1的表達，促進Nrf2的表達(n=4)Figure 2 Ellagic acid inhibited the expression of Mst1 and promoted the expression of Nrf2注：A.RT-PCR檢測Mst1 mRNA的表達;B.RT-PCR檢測Nrf2 mRNA的表達;C.蛋白免疫印跡檢測MST1和NRF2蛋白的表達。GAPDH作為內對照。與模型組比較，①P<0.05

2.5 Mst1和 Nrf2 mRNA表達與MN大鼠腎臟氧化應激指標的相關性分析 為進一步明確Mst1 和 Nrf2 mRNA表達與MN大鼠腎臟氧化應激的相關性，分別分析了MN大鼠Mst1和 Nrf2 mRNA表達與氧化應激指標MDA、GSH和CAT的相關性。Spearman's相關分析顯示，Mst1 mRNA表達與MDA呈正相關(r=0.7539 )(見圖3A)，與GSH和CAT呈負相關(r=-0.9117和r=-0.8478)(見圖3B、圖3C)。Nrf2 mRNA表達與MDA呈負相關(r=-0.7267)(見圖3D),與GSH和CAT呈正相關(r=0.8012和r=0.7423)(見圖3E、圖3F)。結果提示Mst1和Nrf2參與調控了C-BSA誘導的MN大鼠的氧化應激。

圖3 Mst1和 Nrf2 mRNA表達與MN大鼠腎臟氧化應激指標的相關性分析Figure 3 Correlation analysis of Mst1 and Nrf2 mRNA expression and renal oxidative stress index in MN rats注：A～C.Mst1 mNA表達與氧化應激指標MDA、GSH和CAT的相關性分析 ；D～F.Nrf2 mRNA表達與氧化應激指標MDA、GSH和CAT的相關性分析

3 討論

膜性腎病臨床通常伴隨有大量蛋白尿，其他表現(xiàn)為沒有癥狀或不是腎臟疾病引起的蛋白尿[13-14]。目前在臨床上IMN的治療十分困難，預后不佳，因此，找到一個切實可行的治療方案具有十分重要的意義[15]。盡管關于IMN的發(fā)病機制截至目前也沒有被完全闡明，但既往已有研究證實氧化應激在IMN的進程中有重要價值[16-17]。有研究[18]證實，Mst1缺乏可以減輕細胞氧化應激，Nrf2基因激活后能夠抑制線粒體活性氧(ROS)和炎癥因子的產生[19]，所以Mst1-Nrf2通路參與了細胞氧化應激和炎癥反應等多種生物學反應[20]。盡管目前關于Mst1-Nrf2通路介導的抗氧化作用的研究得到了很大的進展，但關于Mst-Nrf2通路在膜性腎病中的作用尚不明確。

鞣花酸是植物天然多酚化合物，已有研究[21-23]證實，EA在多種疾病中具有抗氧化和抗炎等作用。在腎臟疾病中，有文獻[6]報道，鞣花酸可以通過抑制腎組織氧化應激而對STZ誘導的糖尿病大鼠發(fā)揮腎臟保護作用。既往研究[10]也提示鞣花酸可能通過Mst1- Nrf2通路抑制炎癥反應和氧化應激從而緩解阿霉素誘導的大鼠局灶節(jié)段性腎小球硬化。那么EA是否可通過Mst1- Nrf2通路抑制氧化應激和炎癥反應而改善MN的腎臟損傷尚未有研究證實。

在本研究中，采用了應用廣泛且成熟的膜性腎病大鼠模型[11-12]，待模型構建成功后，通過鞣花酸的干預進而分析鞣花酸MN大鼠的治療作用。結果發(fā)現(xiàn)與膜性腎病大鼠組相比，鞣花酸干預組的Scr、BUN、Alb、總蛋白定量、CHO和腎小管性尿蛋白各組分均顯著好轉。同時，通過免疫熒光檢測等也發(fā)現(xiàn)通過鞣花酸的干預治療對減輕膜性腎病大鼠的腎臟病理損傷作用明顯。此外，實驗組腎組織GSH和CAT的水平均顯著上調，而MDA水平降低，說明使用鞣花酸干預后可以顯著提升C-BSA誘導的大鼠膜性腎病的抗氧化能力。在機制上分析，與模型組相比，發(fā)現(xiàn)實驗組大鼠Mst1 mRNA表達下降，Nrf2 mRNA表達增加，提示鞣花酸可能通過Mst1-Nrf2通路對膜性腎病大鼠發(fā)揮腎臟保護作用。但是本實驗研究僅僅檢測了Mst1和Nrf2的轉錄水平變化，關于鞣花酸是否真正通過Mst1-Nrf2通路而發(fā)揮腎臟保護作用尚需進一步的研究。

4 結論

本研究結果提示，鞣花酸可能通過Mst1-Nrf2通路減輕腎組織的氧化應激從而緩解C-BSA誘導的膜性腎病大鼠的腎臟病變，在膜性腎病的防治中具備潛在臨床運用價值，但其具體的作用機制仍需進一步深入研究。