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    CTCs和CTMs在局部晚期鼻咽癌預(yù)后判斷中的臨床應(yīng)用

    2023-02-20 09:22:00蔣婷婷李和沛王丹李燕雛
    西部醫(yī)學(xué) 2023年2期
    關(guān)鍵詞:數(shù)目鼻咽癌亞型

    蔣婷婷 李和沛 王丹 李燕雛

    (四川大學(xué)華西醫(yī)院 1.液體活檢和單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室;2.頭頸腫瘤科;3.腫瘤放療科,四川 成都 610041)

    目前,臨床常用的腫瘤標(biāo)志物和影像學(xué)檢查難以發(fā)現(xiàn)早期腫瘤,而且不能準(zhǔn)確動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)病情發(fā)展,可能導(dǎo)致患者錯(cuò)過最佳治療時(shí)機(jī)。液體活檢作為腫瘤早診、隨訪及預(yù)后判斷中的重要新型手段日漸成熟,當(dāng)腫瘤細(xì)胞從實(shí)體腫瘤的原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶中脫落后進(jìn)入外周循環(huán)系統(tǒng)后即可形成單個(gè)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating tumor cells,CTCs)或循環(huán)腫瘤癌栓(Circulating tumor microembolis,CTMs)。其中,循環(huán)腫瘤癌栓更有利于細(xì)胞之間的生物信息傳遞,更容易在血流剪切壓力下存活,導(dǎo)致惡性腫瘤復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)更高[1-2]?!癈TCs和CTMs”作為液體活檢最重要指標(biāo)之一,其動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)廣泛應(yīng)用于腫瘤的早期篩查、診斷分期、療效評(píng)價(jià)、預(yù)后評(píng)估以及患者的個(gè)體化治療等方面,已在乳腺癌、前列腺癌、胃癌、肺癌等多種實(shí)體腫瘤中得到證實(shí)[3-7]。臨床研究發(fā)現(xiàn),鼻咽癌患者外周血中的CTCs數(shù)目可提示鼻咽癌的病情進(jìn)展程度,動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)CTCs的變化可對(duì)化療的療效進(jìn)行及時(shí)有效的評(píng)估,CTCs不同亞型與化療敏感性和耐藥性相關(guān)[8-9]。另外,研究[10]也發(fā)現(xiàn)CTCs數(shù)量與血漿EBV-DNA表達(dá)量呈正相關(guān)。但目前關(guān)于聯(lián)合檢測(cè)CTCs和CTMs在局部晚期鼻咽癌患者中的臨床意義尚不清楚,本文探討CTCs和CTMs在局部晚期鼻咽癌患者診療中的變化情況,為局部晚期鼻咽癌臨床預(yù)后判斷提供參考。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料 納入四川大學(xué)華西醫(yī)院自2018年6月~2021年1月收治的38 例局部晚期鼻咽癌患者。其中男28 例,女10 例,中位年齡44.1歲,平均(48.56±0.51)歲。病理分期和TNM分期參照美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(American Joint Committee on Cancer,AJCC)第8版,其中納入Ⅲ期患者11例,Ⅳ期患者27例。納入標(biāo)準(zhǔn):①經(jīng)病理確診為局部晚期鼻咽癌。②既往無腫瘤病史,且無放化療治療史。③無血管、嚴(yán)重心臟、腎臟等疾病。④血常規(guī)及血生化參數(shù)在正常參考值范圍內(nèi)。⑤ECOG評(píng)分0~1 分。本研究已獲四川大學(xué)華西醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[倫理編號(hào)為:2015年審(141)號(hào)],且所有受試者均自愿簽訂知情同意書。

    1.2 方法 38例局部晚期鼻咽癌患者,首先接受了0~4周期誘導(dǎo)化療,具體方案為:吉西他濱+順鉑或多西紫杉醇+順鉑+氟尿嘧啶。隨后進(jìn)行適型調(diào)強(qiáng)放射治療(Intensity Modulated Radiotherapy,IMRT),放療期間根據(jù)患者個(gè)體差異情況給予同步化療(Concurrent chemoradiotherapy,CRT),同步周期為0~3周期,使用單藥順鉑或尼妥珠單抗進(jìn)行同步治療。

    1.3 療效評(píng)價(jià) 治療效果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)RECIST 1.1(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors,version 1.1)。完全緩解(Complete Response,CR):腫瘤病灶完全消失。部分緩解(Partial Response,PR):腫瘤病灶直徑之和比基線水平減少30%以上。疾病進(jìn)展(Progressive Disease,PD):腫瘤病灶直徑之和相對(duì)增加20%以上,直徑之和的絕對(duì)值增加5 mm以上,出現(xiàn)1 個(gè)或多個(gè)新病灶。疾病穩(wěn)定(Stable Disease,SD):腫瘤病灶增加程度介于PR與PD兩者之間。疾病控制(Disease Control,DC):治療有效指疾病完全緩解、部分緩解和疾病穩(wěn)定,即治療有效為:CR+PR+SD。治療無效為PD。CTCs療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn):治療有效指治療后外周血中CTCs數(shù)量下降≥1/5治療前的CTCs數(shù)量,治療無效指治療后外周血中CTCs數(shù)量升高或不變>1/5治療前的CTCs數(shù)量[11]。

    1.4 外周血CTCs/CTMs檢測(cè)方法 入組患者在治療前、誘導(dǎo)化療結(jié)束后1周和調(diào)強(qiáng)放射治療結(jié)束1月及1年后四個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別采集患者肘靜脈血6 mL用于CTCs及CTMs檢測(cè),置于含有ACD的抗凝真空管中(Becton,Dickinson and Company,NJ,USA),避光低溫保存,于24 h內(nèi)檢測(cè),檢測(cè)操作過程均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。檢測(cè)試劑盒購(gòu)于賽特生物醫(yī)藥科技有限公司,其試劑盒具體包括SE-CTC試劑盒(Cytointelligen,SanDiego,CA,USA)和iFISH 試劑盒(Cytointelligen,SanDiego,CA,USA)。SE-CTC試劑盒用于分離富集外周血中的CTCs和CTMs,iFISH 試劑盒用于鑒定判別分類CTCs和CTMs。上述實(shí)驗(yàn)操作完成后在自動(dòng)掃描平臺(tái)上進(jìn)行自動(dòng)掃描。CTCs的判讀標(biāo)準(zhǔn):PD-L1+/CD31-/CD45-/DAPI+/CEP8≥2或者PD-L1-/ CD31-/CD45-/DAPI+/CEP8≥2;CTMs 的判讀標(biāo)準(zhǔn):?jiǎn)蝹€(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)量≥2個(gè)的CTCs 聚集成的細(xì)胞團(tuán)[8,12]。在CTCs和CTMs采血的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)血漿 EBV-DNA 水平。

    1.5 隨訪 截止2021年8月1日,入組患者在治療結(jié)束后,門診或電話定期隨訪,治療結(jié)束后半年內(nèi)每個(gè)月隨訪一次,1~3 年內(nèi)每三個(gè)月隨訪一次,3~5 年內(nèi)每半年隨訪一次,5年后每年隨訪一次。隨訪終點(diǎn)為疾病出現(xiàn)進(jìn)展或死亡。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用IBM SPSS 26.0版本對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,計(jì)量資料采用最小值、最大值、中位數(shù)及均數(shù)進(jìn)行描述,計(jì)數(shù)資料之間的相關(guān)分析采用卡方檢驗(yàn),等級(jí)資料采用Spearman相關(guān)系數(shù)分析,定量資料之間的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 局部晚期鼻咽癌患者基線CTCs和CTMs數(shù)目與病理特征的關(guān)系 38例初治局部晚期鼻咽癌患者外周血中檢出CTCs和CTMs細(xì)胞,見圖1,CTCs和CTMs的計(jì)數(shù)基線與患者的臨床病理特征的關(guān)系,見表1?;€分析可見,CTCs和CTMs的陽(yáng)性檢出率與鼻咽癌患者的性別、年齡、ECOG評(píng)分和TNM分期均無關(guān)(P>0.05)。病理分期為Ⅲ期和Ⅳ期患者的外周血中CTCs陽(yáng)性檢出率Ⅳ期比Ⅲ期患者高18.2%?;颊咄庵苎醒獫{EBV-DNA水平范圍為0.0~44700.0 copies/mL。采用Spearman相關(guān)系數(shù)分析CTCs和CTMs與EBV-DNA水平的相關(guān)性顯示,局部晚期鼻咽癌患者與血漿EBV-DNA 表達(dá)水平均無相關(guān)性(P>0.05)。值得關(guān)注的是,納入38例患者中,其中有5例患者EBV-DNA表達(dá)水平陰性,但這5例患者的外周血中均發(fā)現(xiàn)了CTCs,其中1 例患者外周血中還發(fā)現(xiàn)了CTMs,提示CTCs和CTMs可能在外周血中的檢測(cè)靈敏度更高。

    圖1 CTCs和CTMs細(xì)胞Figure 1 CTCs and CTMs cells注:A.EpCAM-/CD45-/DAPI+/8號(hào)染色體≥5體的CTC;B.由兩個(gè)EpCAM+的CTC組成的CTM

    表1 局部晚期鼻咽癌患者基線CTCs和CTMs數(shù)目與臨床病理特征的關(guān)系[n(×10-2)]Table 1 The relationship between the number of baseline CTCs/CTMs and clinicopathological characteristic in patients with locally advanced nasopharyngeal carcinoma

    2.2 局部晚期鼻咽癌患者CTCs和CTMs基線數(shù)目與放療靶區(qū)參數(shù)的相關(guān)性 納入患者在治療前CTCs基線數(shù)目檢出的范圍為0~21 個(gè),治療前CTMs基線數(shù)目檢出的范圍為0~4 個(gè)。36例CTCs陽(yáng)性患者中,腫瘤原發(fā)灶靶區(qū)(GTVnx)范圍為(52.07±30.14) cm3,淋巴結(jié)靶區(qū)(GTVnd)范圍為(30.95±19.94) cm3,大體腫瘤體積(GTV)范圍為(64.90±42.45) cm3;2例CTCs陽(yáng)性患者中,GTVnx范圍為(47.31±26.74) cm3,GTVnd范圍為(13.82±8.16) cm3,GTV范圍為(63.37±27.17) cm3。采用Spearman相關(guān)系數(shù)分析結(jié)果顯示,入組患者治療前CTCs數(shù)目與GTVnx、GTVnd及GTV均無相關(guān)性(P=0.478,P=0.647,P=0.077)。同樣,CTMs與GTVnx、GTVnd及GTV均無相關(guān)性(P=0.254,P=0.687,P=0.082)。

    2.3 局部晚期鼻咽癌患者外周血中CTCs和CTMs與治療效果的關(guān)系 對(duì)在納入患者中20例進(jìn)行了治療前、誘導(dǎo)化療結(jié)束后1周和調(diào)強(qiáng)放射治療結(jié)束1月及1年后進(jìn)行了四個(gè)采血時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。分析20 例患者外周血中CTCs動(dòng)態(tài)變化情況,按照CTCs評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)判定,16 例有效,4 例無效。CTCs數(shù)目在四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的數(shù)目分別為:(9.7±10.3)個(gè)、(5.40±6.4)個(gè)、(2.3±7.1)個(gè)和(1.5±3.4)個(gè),經(jīng)過治療后CTCs總數(shù)較治療前明顯降低(P=0.0241)。進(jìn)一步分析,CTMs數(shù)目四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的數(shù)目分別為:(2.5±2.1) 個(gè)、(2.4±1.5)個(gè)、(0±3.1)個(gè)和(0±0.9)個(gè),經(jīng)過治療后CTMs較治療前降低(P=0.431)。②按照RECIST 1.1標(biāo)準(zhǔn),上述20 例患者中,17 例患者治療后DCR率為85.0%(17/20),PD率為15.0%(3/20)。CR、PR或SD患者CTCs數(shù)目在治療前為(9.8±5.7)個(gè),治療后下降為(2.4±6.2)個(gè);CTMs數(shù)目在治療前為(2.9±1.2)個(gè),治療后下降至(1.4±0.2)個(gè)。另外,3例PD患者CTCs數(shù)目在治療前為(14.2±3.9)個(gè),治療后降為(3.7±4.2)個(gè);CTMs數(shù)目在治療前為(2.9±1.2)個(gè),治療后下降至(1.4±2.2)個(gè)。結(jié)果提示,局部晚期鼻咽癌患者外周血中CTCs和CTMs數(shù)目的動(dòng)態(tài)變化情況與治療后的療效密切相關(guān),PD患者治療后的CTCs和CTMs數(shù)目更高,治療效果更差。③采用Fisher檢驗(yàn)比較CTCs評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)和RECIST 1.1評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),兩種療效評(píng)價(jià)方式差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=3.821,P=0.557)。局部晚期鼻咽癌患者CTCs數(shù)目與治療效果的關(guān)系,見表2。

    表2 局部晚期鼻咽癌患者基線CTCs數(shù)目與治療效果的關(guān)系[n(×10-2)]Table 2 The relationship between baseline CTCs number and treatment effect in patients with locally advanced nasopharyngeal carcinoma

    2.4 局部晚期鼻咽癌患者外周血中CTCs各亞型在治療過程中的分布情況 分析動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的20例患者在治療過程中CTCs各個(gè)亞型變化的情況(見圖2)。三倍體CTCs四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的檢出百分比分別為:75.9%、59.3%、41.3%和5.7%;四倍體CTCs在四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的檢出百分比分別為:68.1%、30.3%、20.1%和18.6%;≥五倍體CTCs在四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的檢出百分比分別為:43.0%、37.0%、20.6%和20.5%。隨訪患者CTCs從治療前到治療后動(dòng)態(tài)變化情況可見,三倍體、四倍體和≥五倍體CTCs分別下降了70.2%、49.5%和22.5%。經(jīng)治患者中,三倍體CTCs對(duì)化療或者放療更為敏感,而≥五倍體的CTCs可能和耐藥相關(guān),具體機(jī)制需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

    圖2 患者外周血中CTCs亞型分布情況統(tǒng)計(jì)圖(n=20)Figure 2 Distribution of CTCs subtypes in patients 注:CTCs各亞型百分比計(jì)算方式為:各亞型個(gè)數(shù)/CTCs總數(shù)×100%

    進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),2例患者在治療前檢出表達(dá)PD-L1陽(yáng)性CTCs,且均為病情進(jìn)展(PD)患者。對(duì)其分型發(fā)現(xiàn),1例患者血液樣本中,有一個(gè)三倍體CTC細(xì)胞表達(dá)PD-L1陽(yáng)性;1 例患者有一個(gè)≥五倍體CTCs細(xì)胞表達(dá)PD-L1陽(yáng)性。上述結(jié)果提示,外周血中出現(xiàn)表達(dá)PD-L1陽(yáng)性CTCs提示預(yù)后不良。

    3 討論

    鼻咽癌常見于中國(guó)南方和東南亞等地區(qū),發(fā)病與環(huán)境、地理位置、遺傳因素、EB病毒等因素有關(guān)[13-14]。據(jù)統(tǒng)計(jì),僅不足1/3鼻咽癌患者可在早期確診,約2/3患者確診已是局部晚期。局部復(fù)發(fā)、局部未控和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致鼻咽癌患者死亡的主要原因。目前,常規(guī)鼻咽癌的診斷及隨訪主要依賴于病理組織、血清腫瘤標(biāo)志物和醫(yī)學(xué)影像等檢查。CTCs/CTMs作為一種新型、敏感監(jiān)測(cè)指標(biāo)有助腫瘤的早期診斷、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)、判斷療效和預(yù)后評(píng)估。

    外周血中CTCs和CTMs是實(shí)體瘤的“液體活檢”的重要組成,具有取材方便、多次反復(fù)取材和無創(chuàng)傷等優(yōu)點(diǎn)[15-17]。既往循環(huán)腫瘤細(xì)胞在鼻咽癌的研究主要集中于外周血中CTCs 的陽(yáng)性率與TNM分期間的相關(guān)性,Zhang等[8]報(bào)道,CTCs陽(yáng)性檢出率與TNM分期無顯著相關(guān)性;He等[18]在納入的33 例鼻咽癌研究中發(fā)現(xiàn)CTCs 計(jì)數(shù)與腫瘤負(fù)荷成正相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn),在入組的38 例局部晚期的鼻咽癌患者中,Ⅲ期和Ⅳ期患者CTCs陽(yáng)性檢出率分別高達(dá)81.8%以上,Ⅳ期患者比Ⅲ期患者CTCs陽(yáng)性檢出率高18.2%,提示腫瘤分期越晚,CTCs計(jì)數(shù)越高,腫瘤的負(fù)荷也越大。另外,本文進(jìn)一步分析納入的38 例治療前局部晚期鼻咽癌患者CTCs陽(yáng)性檢出率與放療靶區(qū)參數(shù)的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)入組患者治療前CTCs和CTMs數(shù)目與GTVnx、GTVnd及GTV均無相關(guān)性。雖然以上述分析均為陰性結(jié)果,但CTCs陽(yáng)性的局部晚期鼻咽癌患者治療前勾畫的GTV范圍均比CTCs陰性的患者勾畫的范圍更廣,提示臨床醫(yī)生可參考CTCs檢出情況來進(jìn)一步作出精準(zhǔn)的范圍選擇。

    Si等[19]研究發(fā)現(xiàn),鼻咽癌患者治療中CR或PR患者,外周血中的CTCs數(shù)目明顯降低。本研究不僅分析20 例局部晚期鼻咽癌患者在治療過程中外周血CTCs和CTMs數(shù)目的動(dòng)態(tài)變化,更進(jìn)一步分析了CTCs的各個(gè)亞型變化情況?;颊呓?jīng)過治療后,發(fā)現(xiàn)局部晚期鼻咽癌患者外周血中CTCs和CTMs數(shù)目的動(dòng)態(tài)變化情況與治療后的療效密切相關(guān),與CR、PR或SD組患者相比較,3 例PD患者治療后的CTCs和CTMs檢出率更高,治療效果更差。上述結(jié)果提示,PD患者治療后CTCs患者更容易產(chǎn)生耐藥,治療結(jié)束后更應(yīng)該加強(qiáng)隨訪,防止腫瘤的復(fù)發(fā)和進(jìn)一步轉(zhuǎn)移。不同的亞型的CTCs具有不同的臨床意義,不同亞型在不同腫瘤中具有明顯異質(zhì)性[20-24]。本研究發(fā)現(xiàn),三倍體、四倍體及≥五倍體CTCs從治療前到治療后逐步下降,各亞型CTCs數(shù)目下降從高到低依次分別是三倍體CTCs、四倍體CTCs和≥五倍體CTCs。上述結(jié)果提示,≥五倍體的CTCs在治療過程中可能存在耐藥。進(jìn)一步可見,本研究中表達(dá)PD-L1 CTCs的兩例患者均出現(xiàn)病情進(jìn)展,提示CTCs中表達(dá)PD-L1可能是預(yù)后不良因素之一。有研究顯示,鼻咽癌病理組織中PD-L1陽(yáng)性率高可95%,癌巢周圍有大量的浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞,因此,針對(duì)PD-L1靶點(diǎn)的PD-1抗體聯(lián)合化療治療鼻咽癌的臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),卡瑞利珠單抗單藥用于PD-L1表達(dá)陽(yáng)性的鼻咽癌患者具有較高的抗腫瘤活性且安全性可控。提示局部晚期鼻咽癌聯(lián)合應(yīng)用PD-1單抗類抗腫瘤藥物具有可期的療效。

    4 結(jié)論

    CTCs和CTMs在局部晚期鼻咽癌病程及治療過程中均有較高的檢出率,并表現(xiàn)出顯著差異,因此CTCs和CTMs可以用于局部晚期鼻咽癌動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)、評(píng)估療效及指導(dǎo)預(yù)后判斷,將可根據(jù)檢測(cè)結(jié)果制定精準(zhǔn)化的治療方案,及早采取對(duì)應(yīng)的臨床干預(yù)措施。

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