紅曲中紅曲菌的鑒定及優(yōu)質(zhì)菌的篩選

周康熙，陳思鵬，王澤楠，吳 俐，呂旭聰，倪 莉*

（1 福州大學(xué)石油化工學(xué)院 福州 350108 2 福州大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)研究所 福建省食品生物技術(shù)創(chuàng)新技術(shù)研究中心 福州 350108）

紅曲又稱“丹曲”，以熟米為原料經(jīng)紅曲菌發(fā)酵而成，在中國已有上千年的食用和藥用歷史，現(xiàn)今常作為著色劑、發(fā)酵劑、功能性添加劑和食品防腐劑[1-2]。 紅曲菌對有益代謝物的代謝能力決定了紅曲的應(yīng)用價值，因此優(yōu)質(zhì)紅曲菌的選育尤為重要。福建省是紅曲的重要產(chǎn)區(qū)，為中國市場提供了85%以上的紅曲，然而，這些紅曲多采用古法技藝制備，其質(zhì)量參差不齊[2-4]。

為提高紅曲質(zhì)量，需對紅曲菌進(jìn)行分離鑒定并篩選優(yōu)質(zhì)菌株。然而，當(dāng)前紅曲菌的分類鑒定和優(yōu)質(zhì)菌株篩選方法尚有不足。 紅曲菌泛指紅曲菌屬（Monascus），在分類學(xué)中屬于真菌門（Eumycophyta）、子囊菌亞門（Ascomycotina）、不整囊菌綱（Plectomycetes）、散囊菌目（Eurotiales）、紅曲菌科（Monascaceae），是紅曲菌科中唯一的隸屬分類單元[5]。 紅曲菌的鑒定主要在于種水平的鑒定。 紅曲菌的鑒定方法較多，常用的是形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定，由于不同鑒定方法的原理和標(biāo)準(zhǔn)不同，因此對紅曲菌的物種分類不盡相同，容易造成鑒定分類上的混淆，進(jìn)而可能對某一類菌種的特性造成誤判[6-8]。此外，紅曲色素是紅曲菌分泌的應(yīng)用價值較高的次級代謝產(chǎn)物，具有著色、保健、防腐等功效[9]。 在篩選高產(chǎn)紅曲色素的優(yōu)質(zhì)紅曲菌時，還要考慮真菌毒素桔霉素的產(chǎn)量[10]。 色素與桔霉素的前端代謝通路相同，在合成四酮體之后分化為2 條代謝通路[11-13]，使得色素產(chǎn)量與桔霉素產(chǎn)量間并無直接關(guān)聯(lián)。 如何合理地篩選高產(chǎn)紅曲色素而低產(chǎn)桔霉素的優(yōu)質(zhì)紅曲菌成為研究重點(diǎn)。

本研究以福建省紅曲主產(chǎn)區(qū)收集的紅曲為樣本，研究快速分離純化紅曲菌的方法，構(gòu)建福建省區(qū)域紅曲菌菌株庫。 采用紅曲菌形態(tài)學(xué)鑒定、ITS分子生物學(xué)鑒定和18S 分子生物學(xué)鑒定3 種方法鑒定紅曲菌，將鑒定結(jié)果數(shù)字化并進(jìn)行相關(guān)性分析，為紅曲菌的分類、鑒定提供數(shù)據(jù)支持。 最后對所分離的菌株進(jìn)行色素和桔霉素測定，結(jié)合產(chǎn)量換算方法篩選出優(yōu)質(zhì)紅曲菌，為紅曲菌種質(zhì)資源的挖掘提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅曲，福建省各產(chǎn)區(qū)的紅曲廠；米粉，由福州市閩侯縣上街鎮(zhèn)糧油站購置的秈米，經(jīng)過磨粉，過100 目篩而得；馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、察氏瓊脂培養(yǎng)基（CYA）、麥芽浸膏瓊脂培養(yǎng)基（MEA）、麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基（Wa）等紅曲菌培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；25%甘油硝酸鹽瓊脂（G25N）是在察氏瓊脂培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加了25%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的甘油配制而成； 真菌DNA 提取試劑盒、引物、PCR 試劑盒、DNA Maker，上海生物工程有限公司；其它試劑均購自國藥集團(tuán)，分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHJH-C1112B 型超凈工作臺、ZWY-2102C型搖床，上海智城；SHP-150 型生化培養(yǎng)箱，上海精宏；TC-512 型PCR 儀，TECHNE 公司； 瓊脂糖水平板電泳儀，北京六一；JS-380C 型凝膠成像系統(tǒng)，上海培清；SpectraMax i3x 型酶標(biāo)儀，美谷分子；Ultimate 3000 UHPLC 液相色譜儀，美國賽默飛。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 紅曲菌的快速分離純化 取紅曲樣品于限制性液態(tài)培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r/min 培養(yǎng)24 h 后，在PDA 培養(yǎng)基中涂布分離，挑取形態(tài)不同的紅曲菌進(jìn)行菌種保藏。所述限制性液態(tài)培養(yǎng)基包含15 g/L 米粉、5 g/L 葡萄糖、3.98%體積分?jǐn)?shù)的乳酸、6.24%體積分?jǐn)?shù)的乙醇和0.1 g/L 氯霉素。

1.3.2 紅曲菌的形態(tài)學(xué)鑒定 將已分離純化的紅曲菌分別在PDA、CYA、MEA、G25N、Wa 中進(jìn)行菌種點(diǎn)樣，于25 ℃中培養(yǎng)7 d，并拍照觀察。

1.3.3 紅曲菌的分子生物學(xué)鑒定 用真菌DNA提取試劑盒對紅曲菌進(jìn)行DNA 提取，提取后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳，檢測擴(kuò)增效果，將擴(kuò)增后的PCR 產(chǎn)物送至上海生工進(jìn)行DNA 測序。所測片段為ITS 序列和18S 序列，其中，ITS 序列引物為ITS1 （5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），18S序列引物為NS1 （5'-GTAGTCATATGCTTGTC TC-3'） 和FR1 （5'-AGCCATTCAATCGGTAGT-3'），PCR 反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序參照文獻(xiàn)[14]中的方法執(zhí)行。 測序結(jié)果于美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行核酸序列比對，并選取同源性高的菌株的ITS rDNA 序列和18S rDNA 序列，利用MEGA 6.0 軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 形態(tài)學(xué)鑒定與分子生物學(xué)鑒定數(shù)據(jù)的數(shù)字化轉(zhuǎn)化和關(guān)聯(lián)性分析 形態(tài)學(xué)的數(shù)字化轉(zhuǎn)化采用積分制。 將鑒定培養(yǎng)基中紅曲菌的菌落形態(tài)與李鐘慶等[15]的紅曲菌分類檢索表進(jìn)行比對，參考顏色與形態(tài)規(guī)律2 個因素，每個因素符合描述積0.5分，不符合描述積0 分，使已分離的紅曲菌與形態(tài)分類學(xué)中的標(biāo)準(zhǔn)菌株之間形成形態(tài)學(xué)數(shù)字矩陣，對該數(shù)字矩陣用R 語言軟件繪制帶聚類分析的熱圖。

分子生物學(xué)鑒定的數(shù)字化轉(zhuǎn)化亦采用積分制。 以1.3.3 節(jié)中構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹為數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，以系統(tǒng)發(fā)育樹中的同源性參考菌株為參照物，根據(jù)親緣關(guān)系親疏進(jìn)行積分，親緣關(guān)系最近的前5株參考菌株分別積5，4，3，2，1 分，形成分子生物學(xué)數(shù)字矩陣。

最后用形態(tài)學(xué)數(shù)字矩陣與分子生物學(xué)數(shù)字矩陣進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，用R 語言軟件繪制相關(guān)性熱圖。

1.3.5 紅曲菌代謝產(chǎn)物的測定 用生理鹽水將PDA 平板中已純化的紅曲菌孢子轉(zhuǎn)接至液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，接種量為10%體積分?jǐn)?shù)，孢子懸液濃度1×106CFU/mL，液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基包含40 g/L 米粉和4 g/L 甘油，發(fā)酵參數(shù)30 ℃，200 r/min，7 d。 發(fā)酵結(jié)束后取0.5 mL 發(fā)酵液加5 mL 的75%體積分?jǐn)?shù)的乙醇，于60 ℃中提取色素和桔霉素，提取時間120 min，提取結(jié)束后4 500 r/min 離心15 min，取上清液過0.45 μm 濾膜，作為色素和桔霉素的待測液。色素的測定方法參照文獻(xiàn)[16]的方法執(zhí)行，桔霉素的測定方法參照國標(biāo)《GB 5009.222-2016 食品中桔青霉素的測定》中第一法關(guān)于紅曲類產(chǎn)品中桔青霉素的HPLC 測定方法執(zhí)行[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 福建紅曲菌菌株庫的構(gòu)建

福建紅曲產(chǎn)區(qū)地理位置分布較為集中，以寧德市為主，福州、南平、泉州、龍巖等地少量分布[2-3]。所收集的紅曲樣品來源于寧德、福州、泉州、南平四市，且重點(diǎn)涵蓋了屏南、古田兩縣的紅曲主產(chǎn)區(qū)（圖1），表明樣品來源的可靠性。 紅曲菌對乳酸和乙醇具有良好的耐受性[18-19]，在米漿培養(yǎng)基中，添加一定濃度的乳酸和乙醇能實(shí)現(xiàn)紅曲菌的定向分離、純化[20]，基于此方法快速地從紅曲中獲得了148 株紅曲菌（表1）。由于曲坊多沿用傳統(tǒng)技藝制曲，紅曲的制作過程并未嚴(yán)格控菌，因此單個紅曲中可能會出現(xiàn)多種紅曲霉（圖2），表1 中紅曲菌數(shù)遠(yuǎn)大于紅曲樣品數(shù)也證明了這一點(diǎn)。

表1 紅曲及所分離紅曲菌的數(shù)量區(qū)域分布Table 1 Regional and quantitative distribution of Hongqu samples and their Monascus

圖1 紅曲樣品產(chǎn)區(qū)分布Fig.1 Production area of Hongqu samples

圖2 紅曲BHQ44 中的紅曲菌Fig.2 Monascus species in Hongqu BHQ44

2.2 紅曲菌的鑒定方案

2.2.1 紅曲菌的形態(tài)學(xué)鑒定 由于不同紅曲菌對不同底物的利用能力不同，因此它們在不同鑒定培養(yǎng)基中所呈現(xiàn)的形態(tài)也不同，基于此可直接從紅曲菌的形態(tài)來區(qū)分不同的紅曲菌。 在形態(tài)學(xué)鑒定方面，李鐘慶等[15]在前人的基礎(chǔ)上改進(jìn)了紅曲菌形態(tài)學(xué)鑒定方法（聯(lián)合使用MEA、CYA、G25N、Wa、PDA 中的4 種培養(yǎng)基，不同菌所用的鑒定培養(yǎng)基略有差異），完善了紅曲菌的形態(tài)學(xué)分類檢索表，被許多學(xué)者認(rèn)可[21-23]。 對所分離的148 株紅曲菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)分型，可得到45 種形態(tài)不同的紅曲菌（圖3）。 將這45 株紅曲菌與李鐘慶等[15]的紅曲菌形態(tài)學(xué)分類檢索表中的標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行對照并數(shù)字化積分，可得圖4。 由圖3 及圖4 可知，所分離的紅曲菌的形態(tài)均與標(biāo)準(zhǔn)菌株的形態(tài)差異較大，形態(tài)學(xué)積分滿分為4 分，而實(shí)際上的得分均不超過2 分。通過積分聚類得知，大多數(shù)紅曲菌與紫色紅曲菌（M.purpureus）、橙色紅曲菌（M.aurantiacus）及叢毛紅曲菌（M.pilosus）形態(tài)相似。 然而單獨(dú)使用形態(tài)學(xué)鑒定難以判斷紅曲菌的物種類別，還需要結(jié)合分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定。

圖3 紅曲菌的形態(tài)學(xué)分型Fig.3 Morphological typing of Monascus

圖4 紅曲菌的形態(tài)學(xué)積分聚類熱圖Fig.4 Clustered heatmap of morphology scores for Monascus

2.2.2 紅曲菌的分子生物學(xué)鑒定 紅曲菌的分子生物學(xué)鑒定方法有兩種，即DNA 測序分析和DNA 標(biāo)記分析。DNA 標(biāo)記分析的目標(biāo)基因組范圍較廣，對標(biāo)記的序列進(jìn)行擴(kuò)增后通過序列的多態(tài)性來區(qū)分不同物種[24]。 然而該技術(shù)需要將分析物種與參照物種同時進(jìn)行基因標(biāo)記，才能準(zhǔn)確分析目標(biāo)物種的親緣關(guān)系，在實(shí)際操作過程中，將面臨參照物種價格高昂，非保守序列遺傳不穩(wěn)定等問題。 現(xiàn)今常用的DNA 測序分析通過測定和比對rDNA 上的保守序列來判斷物種的親緣關(guān)系，所需的參照物種的基因序列信息能在基因數(shù)據(jù)庫中便捷獲取[25]。 在DNA 測序分析過程中，紅曲菌常用的是ITS rDNA 和18S rDNA 測序。對45 株不同形態(tài)學(xué)分型的紅曲菌進(jìn)行DNA 序列比對（圖5 和圖6），測序片段不同可能會導(dǎo)致不同的鑒定結(jié)果，例如紅曲菌（Monascus）MZT15 在ITS rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹中與白色紅曲菌（M.albidulus）CGMCC 3.568 親緣關(guān)系最近，而在18S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹中與煙色紅曲菌（M.fuliginosus）Q5 親緣關(guān)系最近；此外，紅曲菌（Monascus）MZT15 的形態(tài)學(xué)分型又與紫色紅曲菌 （M.purpureus）、橙色紅曲菌 （M.aurantiacus） 和巴克紅曲菌（M.barkeri）較為接近（圖4），多種鑒定方法難以統(tǒng)一，這使得紅曲菌的鑒定變得復(fù)雜。

圖5 基于ITS rDNA 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree constructed based on ITS rDNA sequences

圖6 基于18S rDNA 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree constructed based on 18S rDNA sequences

2.2.3 紅曲菌的形態(tài)學(xué)鑒定與分子生物學(xué)鑒定的對比分析 紅曲菌的形態(tài)學(xué)鑒定、ITS rDNA序列比對及18S rDNA 序列比對3 種鑒定方法難以統(tǒng)一，其原因除了鑒別原理存在顯著差別外，另一個重要原因是3 種方法的參照菌株庫不相重合。 由表2 可知，形態(tài)學(xué)鑒定、ITS rDNA 鑒定和18S rDNA 鑒定的參照菌株庫中紅曲霉的種類分別為13，19，5 種，形態(tài)學(xué)鑒定和ITS rDNA 鑒定中的參照菌株種類較多，且重合度較高，而18S rDNA 鑒定參照菌株的物種數(shù)量偏少。菌株庫的不重合除了體現(xiàn)在種類上，還體現(xiàn)在同一種類的數(shù)量上。在形態(tài)學(xué)鑒定中，各參照菌株均使用首次發(fā)現(xiàn)的模式菌株，因此各菌數(shù)量僅有1 株，而ITS rDNA 鑒定和18S rDNA 鑒定中的參照菌株不局限于模式菌株，基因庫中的基因序列來自于全球各研究機(jī)構(gòu)所分離鑒定的菌株，因此會出現(xiàn)對比庫中某些紅曲霉同種多株的情況。 早期在Hawksworth 等[26]的紅曲菌分類檢索表中紅曲菌僅有叢毛紅曲菌（M.pilosus）、紫色紅曲菌（M.purpureus）和紅色紅曲菌（M.ruber）3 種，后來陸續(xù)發(fā)現(xiàn)紅曲菌新種，分類檢索表不斷更新，然而從表2中可看出這3 種紅曲菌較為常見，也使用較為頻繁，未知紅曲菌在鑒定時被匹配到這3 種的可能性較大。

為了更好地對比分析紅曲菌的3 種鑒定方法，將所分離的45 株紅曲菌的形態(tài)學(xué)數(shù)字矩陣和分子生物學(xué)數(shù)字矩陣進(jìn)行相關(guān)性分析（圖7）。 盡管所測的ITS rDNA 和18S rDNA 是不同的基因片段，但兩種分子生物學(xué)鑒定方法具有較好的正相關(guān)性。 此外，ITS rDNA 序列分析相比于18S rDNA 序列分析更接近于形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果，這可能與ITS rDNA 序列分析中參照紅曲菌的種類和數(shù)量較為豐富有關(guān)。結(jié)合圖7 和表2 的結(jié)果，大部分菌株適用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)合鑒定，由于形態(tài)學(xué)鑒定易受培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)環(huán)境的影響，當(dāng)兩類鑒定方法存在沖突時，建議優(yōu)先選擇分子生物學(xué)鑒定的結(jié)果，尤其是ITS rDNA 序列分析的結(jié)果。

圖7 形態(tài)學(xué)鑒定與分子生物學(xué)鑒定的相關(guān)性分析Fig.7 Correlation analysis of morphological identification and molecular biological identification

表2 不同紅曲菌鑒定方法的參照菌株的種類及其數(shù)量對比Table 2 Comparison of species and quantity of reference strains in different identification methods of Monascus

2.3 高產(chǎn)色素低產(chǎn)桔霉素優(yōu)質(zhì)菌的篩選

對45 株紅曲菌進(jìn)行色素和桔霉素的測定，并根據(jù)其含量高低進(jìn)行分級，用不同顏色進(jìn)行等級區(qū)分。 由圖8a 和圖8b 中可知，Monascus MZT23和Monascus MZT01 為高產(chǎn)色素菌，Monascus MZT20、Monascus MZY15 和Monascus MZT24 為低產(chǎn)桔霉素菌，而色素產(chǎn)量與桔霉素產(chǎn)量之間并不存在直接關(guān)系，很難從圖8a 和圖8b 中尋找高產(chǎn)色素低產(chǎn)桔霉素的優(yōu)質(zhì)菌。日本對桔霉素的限量以紅曲色素為基準(zhǔn)，即色價超過500 U/g 的紅曲中桔霉素含量不得超過0.2 mg/kg[27]，借鑒此方法，以色素產(chǎn)量為基準(zhǔn)，對桔霉素產(chǎn)量進(jìn)行換算，可得圖8c。 對圖8a～8c 的前3 個最優(yōu)等級的菌進(jìn)行分析，可發(fā)現(xiàn)Monascus MZT27 為高產(chǎn)色素、低產(chǎn)桔霉素的目標(biāo)菌，其色素產(chǎn)量為83.3 U/mL，桔霉素產(chǎn)量為81.5 ng/mL。 此外，當(dāng)前紅曲色素市場對紅曲黃色素需求巨大[28]，優(yōu)選高產(chǎn)黃色素的紅曲菌也具有現(xiàn)實(shí)意義。 再次使用產(chǎn)量換算方法，計(jì)算45 株紅曲菌的黃色素產(chǎn)量與總色素產(chǎn)量的比值，由圖8d 可知Monascus MZT39 為高產(chǎn)黃色素的紅曲菌 （黃色素占比為70.06%），其紅曲色素乙醇提取液基本為黃色（圖9），說明此換算方法符合實(shí)際，并能用于目標(biāo)菌株的篩選。

圖8 45 株紅曲菌的色素及桔霉素產(chǎn)量Fig.8 Pigment and citrinin production of 45 Monascus strains

圖9 高產(chǎn)色素菌與高產(chǎn)黃色素菌的色素提取液Fig.9 Pigment extracts of high-yield pigment Monascus and high-yield yellow pigment Monascus

3 結(jié)論

福建紅曲中紅曲菌種類豐富，由于沿襲了傳統(tǒng)紅曲制備技藝，單個紅曲中可能包含多株紅曲菌。對福建紅曲中的紅曲菌進(jìn)行分離純化，構(gòu)建了包含45 個不同形態(tài)學(xué)分型共計(jì)148 株紅曲菌的菌株庫。對菌株庫中45 株不同形態(tài)學(xué)分型的紅曲菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定（ITS rDNA 序列分析和18S rDNA 序列分析），這些鑒定方法的結(jié)果并不一致，可能是鑒定原理和參照菌株庫不同所致。 將形態(tài)學(xué)分析、ITS rDNA 序列分析和18S rDNA 序列分析的結(jié)果轉(zhuǎn)化為數(shù)字矩陣并做相關(guān)性分析，大部分菌株適用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)合鑒定，且兩種分子生物學(xué)鑒定方法相關(guān)性程度較高，由于形態(tài)學(xué)鑒定易受干擾、18S rDNA 序列分析參照菌株庫較少，當(dāng)多種鑒定方法之間存在沖突時，建議優(yōu)選ITS rDNA 鑒定結(jié)果。最后，采用產(chǎn)量換算方法對45 株形態(tài)不同的紅曲菌進(jìn)行優(yōu)質(zhì)菌的篩選，對所有檢測指標(biāo)進(jìn)行分級，取色素產(chǎn)量、 桔霉素產(chǎn)量和色素產(chǎn)量與桔霉素產(chǎn)量的比值這3 個指標(biāo)的前3 個最優(yōu)等級進(jìn)行比較分析，可獲得高產(chǎn)色素、 低產(chǎn)桔霉素的優(yōu)質(zhì)菌Monascus MZT27，同時還能再次通過產(chǎn)量換算方法可獲得高產(chǎn)黃色素的紅曲菌Monascus MZT39。