四川某奶牛場犢牛腹瀉主要病原微生物的PCR檢測

卜 嫻，湯 承，岳 華

(西南民族大學，四川成都 610041)

犢牛腹瀉是常見病，一年四季均可發(fā)生，常發(fā)于初春及夏末初秋氣候多變季節(jié)[1]，腹瀉犢牛臨床上表現(xiàn)為嚴重腹瀉，并伴隨嘔吐、機體脫水和生長發(fā)育不良等癥狀，嚴重時還會引起死亡，未斷奶犢牛超過50%的死亡與腹瀉相關[2]，是造成全球養(yǎng)牛業(yè)經(jīng)濟損失的最重要原因。犢牛腹瀉是一種多因素疾病，可分為感染性因素和非感染性因素，造成犢牛腹瀉的主要原因為感染性因素。有研究表明，與犢牛腹瀉相關的常見病毒有牛A群輪狀病毒(Bovine Rotavirus A，BRVA)、牛冠狀病毒(Bovine coronavius，BCoV)、牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)、牛諾如病毒(Bovine norovirus，BNoV)、紐布病毒(Nebovirus，NeV)和牛環(huán)曲病毒(Bovine torovirus，BToV)[3]，常見細菌有產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌(enterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)和沙門氏菌(Salmonella)。

四川省某奶牛場有5 000多頭成年牛，犢牛常年發(fā)生腹瀉，是影響犢牛成活率的主要因素，為了解該奶牛場犢牛腹瀉的原因，本文采用PCR方法對該場犢牛腹瀉進行病原學檢測，結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 發(fā)病情況 2021年春季該場300多頭犢牛在2月齡內(nèi)發(fā)生腹瀉，表現(xiàn)為精神沉郁，喜臥，嗜睡，采食量下降，鼻鏡干燥，體溫升高，排出灰白色或淡黃色粥樣糞便，肌肉注射抗菌藥物無效，病死率約30%。無菌棉拭子采集腹瀉糞便樣本22份作為待檢病料。

1.1.2 主要試劑 TrizolTMReagent、Prime ScriptTMRT、2×TaqPCR Master Mix、DNA標準DL 2 000，TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 LifeECO基因擴增儀，杭州博日科技有限公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)、核酸蛋白電泳儀，Bio-Rad公司產(chǎn)品；高速離心機5804，Eppendor公司產(chǎn)品。

1.1.4 病原核酸 BRVA、BCoV、BVDV、NeV、BNoV、BToV、ETEC及Salmonella病原核酸，均由西南民族大學動物醫(yī)學實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 核酸提取 待檢病料分別與PBS緩沖液按1∶5的比例充分重懸混勻，分成2份，1份5 000 r/min 4 ℃離心10 min，上清按照Trizol試劑盒 (RNAiso Plus) 說明書提取總RNA，用Prime ScriptTMRT試劑盒反轉錄成cDNA；另1份用酚-氯仿法提取DNA。

1.2.2 PCR檢測 參照文獻報道的PCR方法[4-11]分別檢測待檢樣本中的BRVA、BCoV、BVDV、NeV、BNoV、BToV、ETEC及Salmonella，取PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像系統(tǒng)進行檢測，并用SPSS21.0軟件對檢測結果進行統(tǒng)計學分析。引物由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成，引物信息見表1。

表1 PCR檢測引物信息

1.2.3 BRVA基因型分型 采用RT-PCR方法，按照Gomara M I等[12]與Abe M等[13]報道的引物(表2)擴增BRVA陽性樣本中的VP7、VP4基因片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)成像，PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，用輪狀病毒分型軟件(https://www.viprbrc.org/brc/rvaGenotyper.)根據(jù)測序結果確定BRVA的G型和P型。

表2 VP7、VP4基因片段擴增引物信息

2 結果

2.1 腹瀉相關病原PCR檢測

從22份犢牛腹瀉糞便樣本檢出BRVA、BCoV、NeV和BToV 4種病毒的特異性條帶，檢出率分別為81.82%、31.82%、27.27%和13.64%(圖1)，其余4種病原均未檢出。

2.2 混合感染情況

對檢測結果分析可見，該場犢牛腹瀉主要由BRVA、BCoV、NeV和BToV 4種病毒感染所致，總陽性率為86.36%。在19份陽性樣本中有12份存在2種及以上病毒混合感染的情況，總混合感染率為63.16%，混合感染病毒組合有BRVA+BCoV、BRVA+NeV、BRVA+BToV、BRVA+BCoV+NeV，混感率分別為33.33%、25%、16.67%、25%(表3)。

2.3 BRVA基因型

從檢測結果可見，BRVA的感染率最高，基因分型結果顯示，從18份陽性樣本中擴增出15個VP7基因片段，均為G10型，擴增出7個VP4基因片段，其中4個為P[1]型、3個為P[11]型，從7個陽性樣本中同時擴增出VP7和VP4基因片段，為4個G10P[1]型和3個G10P[11]型。由此得知，該奶牛場至少存在1種G型(G10型)和2種P型(P[1]、P[11])BRVA。

M.DNA標準DL 2 000；1～22.被檢樣本；P.陽性對照；N.陰性對照；A.牛A群輪狀病毒；B.牛冠狀病毒；C.紐布病毒；D.牛環(huán)曲病毒M.DNA Marker DL 2 000；1-22.Samples；P.Positive control；N.Negative control；A.BRVA；B.BCoV；C.NeV；D.BToV

表3 病毒混合感染

3 討論

犢牛腹瀉嚴重影響犢牛早期的生長發(fā)育和后期生產(chǎn)性能的發(fā)揮。本研究從犢牛腹瀉糞便中檢出BRVA、BCoV、NeV和BToV 4種病毒，證實BRVA等4種病毒是造成該奶牛場犢牛腹瀉的主要原因。產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌及沙門氏菌均未檢出，這可能與奶牛場大量使用抗菌藥物有關。大量報道顯示，上述4種病毒感染是造成我國奶牛場犢牛腹瀉的常見原因。李然等[14]的研究表明遼寧省某奶牛場的犢牛BRVA感染率為83.3%；阿比克哈莫[15]對國內(nèi)部分省區(qū)奶牛進行了BCoV的病原流行病學調(diào)查，平均陽性率為18.95%；NeV和BToV作為國內(nèi)犢牛腹瀉的新發(fā)病原，廣泛流行于我國多個省份的奶牛中，檢出率分別為48.1%[16]和5.56%～21.73%[9,17]，表明NeV和BToV與犢牛腹瀉密切相關；張亮等[18]表明BVDV是致山東省奶犢牛腹瀉的主要病毒。盡管在本研究中細菌未檢出，但是有報道表明其在某些養(yǎng)殖場中仍較為常見，例如，張迪等[19]發(fā)現(xiàn)黑龍江某奶牛場存在較為嚴重的大腸埃希氏菌及隱孢子蟲感染，感染率分別為75%和25%。由此可見，導致犢牛腹瀉的病原種類較多，其中病毒是主要病原，且不同地區(qū)、不同牛場致病原有較大差異，這提示我們應該根據(jù)每個場的具體發(fā)病情況來制定相應的疾病防治方案。

犢牛感染了BRVA之后，當存在與其他病毒的混合感染或繼發(fā)細菌感染時，動物發(fā)病更急，病程更短，病死率更高[20]。在該奶牛場中，存在BRVA+BCoV、BRVA+NeV、BRVA+BToV和BRVA+BCoV+NeV 4種不同組合的混合感染，感染率分別為33.33%、25%、16.67%和25%，混合感染組合并不具有規(guī)律性。從文獻報道可見，奶牛場存在多種不同的混合感染組合，例如BRVA+BCoV、BRVA+BCoV+BVDV、BRVA+BCoV+Salmonella[14,21-23]。奶犢牛腹瀉中BRVA+BCoV混合感染組合較為常見，多種病原混合感染可能會增加臨床表現(xiàn)的嚴重程度，給犢牛腹瀉的診斷帶來困難。因此，在診斷的過程中需要同時對多種常見病原進行檢測，以便為更加精準的防治提供科學依據(jù)。

由于在該場中BRVA檢出率最高，因此對其進行了基因型分型，從中得出該奶牛場BRVA基因型有G10、P[1]和P[11]型，基因型組合有G10P[1]和G10P[11]。在我國BRVA中，主要流行的G型有G6和G10，P型有P[1]、P[5]和P[11][24]，不同年份流行株毒株的優(yōu)勢基因型組合是不一樣的，約2年更換一次[25]，最常見的基因型組合是G6P[5]、G10P[5]、G6P[11]和G6P[1][26-27]。由此可知，BRVA的G、P基因型具有豐富的遺傳多樣性，而不同基因型毒株之間的交叉免疫保護性低，這給疫苗的研發(fā)帶來了極大的困難。因此，對BRVA進行基因型分型，及時監(jiān)測毒株的遺傳多樣性對輪狀病毒病的防控尤為重要。

針對多種病原的混合感染，目前大部分病原都沒有有效的疫苗進行防控，且從該奶牛場可見，飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生較差是引起犢牛腹瀉的主要原因。因此，在犢牛養(yǎng)殖過程中綜合防控仍然是最主要的手段，特別是犢牛舍的環(huán)境衛(wèi)生，要保持干燥、通風，同時需要做好保溫防寒工作。此外，目前對于輪狀病毒特異性抗體治療的效果較好[28]，對于其他病原也可以研發(fā)類似的治療性抗體，這可能是一個有效的防治手段。