禽腺病毒的結(jié)構(gòu)及其血清4型檢測方法研究進展

王凱莉，劉 成，楚肖冉，司振書，路建彪，李玉保，曹勝亮

(聊城大學農(nóng)學院，山東聊城 252000)

血清4型禽腺病毒(Fowl adenovirus serotype-4,FAdV-4)屬于Ⅰ群禽腺病毒的C種，主要引起肝炎-心包積液綜合征(Hepatitis-hydropericardium syndrome，HHS)[1]。1987年巴基斯坦安卡拉地區(qū)最早報道該病，隨后在世界各地如美國、墨西哥、波蘭、匈牙利、智利、日本、印度和中國都有病例報道[2]，給全球家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，對其進行快速檢測和診斷顯得尤為重要，目前檢測FAdV-4的方法主要集中在分子生物學和血清學檢測。分子生物學檢測方法中聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)及實時熒光定量PCR(real-time PCR)是國內(nèi)外學者的研究熱點，血清學診斷方法中酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)報道最多。本文就禽腺病毒的基因組結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)及FAdV-4的檢測方法進行綜述，以期為該病的快速檢測和科學防控提供理論和技術支持。

1 禽腺病毒的基因組結(jié)構(gòu)

禽腺病毒是一種無囊膜的雙股DNA病毒，病毒粒子直徑為70 nm～90 nm，呈20面體對稱結(jié)構(gòu)，基因組大小為45 kb左右[3]。成熟的病毒由衣殼和芯髓組成[1]，其衣殼由主要結(jié)構(gòu)蛋白六鄰體蛋白(Ⅱ)、五鄰體蛋白(Ⅲ)、纖突蛋白(Ⅳ)和次要結(jié)構(gòu)蛋白(Ⅲa、Ⅵ、Ⅷ和Ⅸ)組成。其中，六鄰體蛋白是含量最多的衣殼蛋白[1]。其芯髓包括病毒基因組及其相關蛋白Ⅴ、Ⅶ、mu蛋白和末端蛋白(TP)(圖1)[1-3]。

圖1 (A)禽腺病毒DNA和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)示意圖；(B)腺病毒衣殼結(jié)構(gòu)模式圖

FAdV的基因組分為編碼區(qū)和非編碼區(qū)兩個部分；根據(jù)病毒DNA復制的起始時間不同，編碼區(qū)又分為早區(qū)(E)和晚區(qū)(L)，早區(qū)分為E1-E4 4個區(qū)，晚區(qū)分為L1-L5 5個區(qū)[4]。E1和E2均分為A和B兩部分，E1是病毒基因轉(zhuǎn)錄的起始因子；E2的主要功能是參與和調(diào)節(jié)病毒的復制；E3的產(chǎn)物與病毒逃避宿主的免疫機制有關，是病毒的非必需區(qū)；E4表達產(chǎn)物與病毒復制、晚期基因表達和宿主細胞活動中止等活動有關[5]。早期基因組的表達產(chǎn)物是編碼誘導病毒復制的必需蛋白E1、E2和E4，以及非必需蛋白E3；晚期基因組的表達產(chǎn)物主要是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、pⅧ、pⅥ、核心蛋白、核心蛋白1、DBP、Ⅳa2、52 ku、100 ku)[4-5]。

2 禽腺病毒的蛋白結(jié)構(gòu)

2.1 六鄰體hexon

六鄰體是一種偽六邊形三聚體，位于20面體衣殼的20個面上。衣殼中有240個六鄰體，根據(jù)它們所處的位置不同，將其分為H1、H2、H3和H4 4種六鄰體[6]。其中60個H1與12個頂端的五鄰體相關，也被稱為周圍六鄰體；其余的六鄰體在20面體的20個面上被分為“9組”又稱GONs(group-of-nine)，H2在雙軸上，H3在三軸上，其余的為H4。六鄰體蛋白是FAdV-4的主要衣殼蛋白，含有群、亞群和型特異性抗原決定簇，與致病性關系密切，是禽腺病毒分型的主要依據(jù)[6]。

2.2 五鄰體penton和纖突fiber

五鄰體蛋白在20面體的12個頂角，每個五鄰體蛋白上有一條(Ⅱ 群、Ⅲ 群禽腺病毒)或兩條(Ⅰ 群禽腺病毒)纖維突起，纖突頂端形成頭節(jié)區(qū)(knob)[4]。在Ⅰ 群禽腺病毒中，除血清1型腺病毒長纖突的長度是短纖突的4倍外，其余11個血清型兩條纖突的長度是相似的[4]。纖突蛋白由頭節(jié)區(qū)、桿區(qū)和尾區(qū)三部分構(gòu)成。頭節(jié)區(qū)是纖突蛋白的功能區(qū)，也是腺病毒與細胞表面受體特異性結(jié)合的區(qū)域；桿區(qū)部分由多個重復序列構(gòu)成，具有型特異性；尾區(qū)是氨基酸保守區(qū)[7]。Fiber蛋白上有禽腺病毒的重要抗原，其中Fiber2蛋白具有主要的型特異性和亞屬特異性，能夠識別細胞受體并與之結(jié)合，從而介導病毒感染，同時又能夠刺激機體產(chǎn)生中和抗體，在誘導機體產(chǎn)生免疫反應方面有重要作用[6]。五鄰體蛋白和纖突蛋白的功能彼此關聯(lián)，五鄰體與細胞表面的整聯(lián)蛋白作用，有助于腺病毒的侵入和內(nèi)化，纖突蛋白既能識別細胞膜上特異性受體引起感染，還可以阻斷大分子的合成，抑制病毒增殖，具有抗原性[3-4]。

2.3 五鄰體基質(zhì)penton base

五鄰體基質(zhì)在20面體衣殼頂端占據(jù)重要位置，并通過與相鄰的衣殼粒子、周圍六鄰體和Ⅲa相互作用，在穩(wěn)定衣殼方面發(fā)揮關鍵作用[8]。但其是衣殼中最薄弱的部位，對熱、胰蛋白酶、pH和離子強度變化敏感[9]。Penton base蛋白折疊成2個結(jié)構(gòu)域，一個為單個卷狀，一個為暴露在外部向上的插入域。向上的插入域含有高變環(huán)，高變環(huán)攜帶RGD序列，該序列在病毒粒子內(nèi)化過程中發(fā)揮重要作用[10]。

2.4 其他蛋白結(jié)構(gòu)

蛋白Ⅲa是腺病毒保守的基因之一，但是腺病毒在不同的物種之間有種、屬差異，存在于20面體的每個非對稱單元(asymmetric unit，AU)，總拷貝數(shù)為60[8,11]。其參與病毒的組裝和成熟，也可能在進入細胞中起作用，因為它是病毒粒子最早釋放的成分，也是最不耐熱的衣殼成分之一[8]。多肽Ⅵ是一種多功能的蛋白質(zhì)，在腺病毒感染過程中發(fā)揮多種作用，在病毒進入細胞的過程中，其N端兩親性螺旋的改變使病毒易于進入細胞質(zhì)[8]。RUX J J等認為多肽Ⅵ在衣殼內(nèi)表面錨定5個六鄰體并將衣殼連接到核心[12]。多肽Ⅷ位于內(nèi)衣殼表面，與六鄰體相關并且以每個病毒粒子120個拷貝的形式存在[8]。多肽Ⅸ是位于AdV外衣殼的唯一次要外殼蛋白，在每個病毒粒子中存在240個拷貝，作為黏合劑使每個20面體中心的九個六鄰體聚合在一起[8-9]。Saban S D等[8]研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)Ⅸ的保守N端結(jié)構(gòu)域(氨基酸1-39)是穩(wěn)定腺病毒衣殼所必需的。San M C等[13]通過研究發(fā)現(xiàn)IX可能在調(diào)節(jié)病毒趨向性和/或干擾免疫反應中發(fā)揮作用。Gallardo J等[11]認為蛋白質(zhì)Ⅵ是腺病毒進入宿主細胞的關鍵因素。

3 血清4型禽腺病毒的血清學檢測方法

FAdV-4的血清學檢測方法包括病毒中和試驗(virus neutralization test，VNT)、瓊脂凝膠免疫擴散試驗(agar gel immunodiffusion test，AGIDT)、ELISA和免疫熒光技術(immunofluorescence assay，IFA)。

3.1 病毒中和試驗

病毒中和試驗是根據(jù)病毒抗原與相應抗體結(jié)合后，失去感染能力建立的?？捎糜跈z測中和抗體的效價、鑒定病毒種型和病毒抗原分析。鄒開宇等[14]分別制備了4型、8a、8b和11型禽腺病毒的單因子血清進行交叉中和試驗，結(jié)果表明FAdV-4的血清除能中和其自身血清外還可中和FAdV-11。

3.2 瓊脂凝膠免疫擴散試驗

瓊脂凝膠免疫擴散試驗是可溶性抗原與相應抗體在半固體瓊脂凝膠內(nèi)擴散，當抗原與抗體比例適當時會出現(xiàn)一條白色的沉淀線，可通過肉眼觀察沉淀線的有無來確定試驗結(jié)果。國紀壘等[15]制備了12個血清型的抗血清進行雙向瓊脂擴散試驗，成功對其分離的4株病毒進行了分型。

3.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗

酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是將抗原或抗體吸附于固相載體，在載體上進行染色，從而用酶標儀或肉眼觀察直接判定結(jié)果，該法敏感性強、特異性高，是目前發(fā)展最快也是試劑盒應用最廣的一項技術。粟元文等[16]將鴨源FAdV-4 hexon蛋白1 011 bp的基因表達的蛋白作為抗原進行包被，建立了檢測FAdV-4抗體的間接ELISA方法，并對滅活疫苗免疫的鴨場和感染FAdV-4的鴨場進行檢測，測得免疫合格率和感染陽性率分別為96.46%和99.46%，而未免疫和未感染FAdV-4的鴨場陽性感染率為0。馬洪超[17]將FAdV-4的hexon基因表達的蛋白作為包被抗原建立檢測 FAdV-4抗體的間接ELISA方法，對FAdV-4流行地區(qū)的100份血清進行檢測的陽性率為25%，而瓊脂擴散試驗的檢出率為21%。Rajasekhar R等[18]將FAdV-4六鄰體免疫顯性部分的737 bp克隆到pRSET載體，獲得重組蛋白，建立單血清稀釋ELISA和Dot-ELISA檢測方法，ELISA對臨床樣品檢測的滴度范圍為(3.76±0.04)log10～(4.431±0.12)log10，Dot-ELISA的檢測滴度范圍為(1.445±0.02)log10～(1.968±0.08)log10靈敏度、特異性和準確性均高于瓊脂凝膠免疫擴散試驗(AGIDT)。萬文妍[19]用FAdV-4 hexon(469-775aa)蛋白制備單克隆抗體，將其作為捕獲抗體建立了雙抗體夾心ELISA檢測方法，最低可檢測0.1 μg的病毒；并且還用FAdV-4 fiber2蛋白C端頭節(jié)區(qū)作為診斷抗原建立了間接ELISA方法，對臨床50份樣品進行檢測的結(jié)果與hexon特異性引物檢測的PCR結(jié)果一致。

田開月等[20]將中國流行株FAdV-4的fiber2編碼基因進行密碼子優(yōu)化后得到的fiber2蛋白作為包被抗原，建立了檢測FAdV-4抗體的間接ELISA方法，對臨床60份樣品的檢測結(jié)果與fiber2特異性引物的擴增結(jié)果一致。王萍[21]用FAdV-4毒株免疫小鼠，用間接ELISA方法鑒定出4株抗FAdV-4 Fiber2單克隆抗體，選用兩種建立了雙抗體夾心ELISA檢測方法，對樣品的最低檢出率為12.5 ng/mL。Shao H X等[22-23]分別制備FAdV-4 fiber1和fiber2的兩種單克隆抗體，將其分別作為捕獲抗體和檢測抗體建立夾心ELISA和檢測FAdV-4的夾心ELISA，基于fiber1建立的夾心ELISA可有效檢測FAdV-4/10，而檢測FAdV-4的夾心ELISA的檢測限度與王萍[21]建立的夾心ELISA相同。值得注意的是，邵紅霞建立的基于fiber2 的夾心ELISA也與FAdV-10發(fā)生反應，因為FAdV-10和FAdV-4均屬于FAdV-C種，且具有相似的fiber2蛋白，這與Feichtner F等[24]使用基于fiber2的ELISA特異性檢測FAdV-4抗體時報告的結(jié)果一致。梅楠等[25]將FAdV-4 AQ強毒株的fiber-2基因截短體(112 bp-1 440 bp)表達的蛋白作為包被抗原，建立了檢測FAdV-4的ELISA檢測方法，對臨床13份樣品的檢測結(jié)果與瓊脂擴散試驗完全吻合。

3.4 其他血清學檢測方法

Feichtner F等[10]基于重組FAdV纖突蛋白建立了6種不同血清型FAdV-1、-2、-4、-8a、-8b和-11的復合熒光微球免疫分析(fluorescent microsphere immunoassay，F(xiàn)MIA)是一種多重血清學診斷工具，可用于在單一反應中同時檢測和區(qū)分相應抗體。何子榮等[26]將FAdV-4 JSJ13毒株的整個fiber2基因表達的蛋白作為抗原建立I-ELISA檢測方法，該方法的靈敏性和特異性均為100%，可用于檢測雞體內(nèi)的FAdV-4抗體。萬文妍[19]根據(jù)hexon基因設計特異性RPA引物，建立了RPA-LFD(重組酶聚合酶擴增-膠體金側(cè)向流試紙條)檢測方法，最低檢測限度為100拷貝，敏感性是常規(guī)PCR的100倍，可用肉眼觀察試驗結(jié)果，適用于FAdV-4的現(xiàn)場診斷和流行病學調(diào)查。

3.5 間接免疫熒光法

間接免疫熒光法(indirect immunofluorescence assay，IFA)是將熒光染料與抗體連接，制成熒光抗體，當抗原與抗體結(jié)合時，用熒光顯微鏡觀察即可對待檢抗原進行定性和定位。國紀壘[15]制備了不同血清型的兔抗Ⅰ群FAV IgG，建立了Ⅰ群FAV的IFA，并對人工感染雞的各組織器官進行檢測，研究了病毒在雞體內(nèi)的分布和組織嗜性。

4 血清4型禽腺病毒的分子生物學檢測方法

腺病毒分子生物學檢測方法包括聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)、實時熒光定量PCR(real-time PCR)限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)、環(huán)介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)和核酸探針技術[27]。

4.1 聚合酶鏈反應及實時熒光定量聚合酶鏈反應

PCR是檢測FAdV的主要方法，有高靈敏度、簡單性、選擇性和快速性，腺病毒的六鄰體基因由保守的基底區(qū)和高變環(huán)區(qū)組成，是檢測腺病毒的主要引物設計區(qū)[20]。而實時熒光定量PCR可以通過熒光強度的變化對病毒進行定量分析。Mase M等[28]建立了一種基于凝膠的常規(guī)PCR檢測方法，可用于同時檢測和區(qū)分FAdV1、2、4、8a和8b。Sharif N等[29]從六鄰體的外顯子區(qū)域設計了3對引物，可同時檢測FAdV1、FAdV-4和FAdV-11。劉琳等[30]根據(jù)FAdV-4hexon基因序列設計引物和探針，建立了TaqMan探針熒光定量PCR檢測方法，最低檢測量為50拷貝/μL。張云丹等[31]在FAdV-4 hexon的保守區(qū)域設計合成一對引物和TaqMan探針，建立FAdV-4 FQ-PCR檢測方法，最低檢出濃度為2.03拷貝/μL。羅洋洋等[32]根據(jù)FAdV-4的hexon基因設計了一對引物和TaqMan探針，對臨床50份樣品進行檢測，結(jié)果顯示其建立的TaqMan熒光定量方法和普通PCR方法完全符合，并且熒光定量方法檢出的陽性樣本比普通PCR方法多5份。

4.2 限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應

限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(PCR-RFLP)將擴增后的PCR產(chǎn)物用特異性內(nèi)切酶切割后，直接用凝膠電泳觀察結(jié)果。Raue A等[33]在六鄰體蛋白保守區(qū)構(gòu)建了兩對引物H1/H2和H3/H4， 高變區(qū)構(gòu)建了一對引物H5/H6，H1/H2和H3/H4擴增的片段經(jīng)HaeⅡ酶切后，可以區(qū)分12種FAV參考毒株，并能區(qū)分FAV和EDS病毒。Mase M等[34]基于FAdV-4和FAdV-10的fiber1基因設計引物，用AluⅠ酶通過PCR-RFLP分析將心包積水綜合征FAdV-4 分離株與其他FAdV-4毒株區(qū)分開來。

4.3 環(huán)介導等溫擴增法

環(huán)介導等溫擴增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是在目的基因的6個區(qū)域設計4條引物，在恒溫條件下即可進行反應，可以通過肉眼觀察(焦磷酸鎂白色沉淀)判定結(jié)果。Xie Z X等[35]首次建立了LAMP方法用于檢測和鑒定 Ⅰ 群禽腺病毒株。Yuan X Y等[36]建立了一種對FAdV具有強特異性的LAMP實時濁度法，對FAdV-4具有特異性，檢測下限為75拷貝/μL。

4.4 核酸探針技術

核酸探針技術是用已知的DNA片段作為探針與未知核酸進行雜交試驗，根據(jù)雜交結(jié)果分析其同源性[15]。董婷婷[37]制備了地高辛標記的禽腺病毒4型核酸探針，特異性良好，且不與1、2、8和12型的病毒發(fā)生交叉反應，最低檢出量為1 pg，可用于臨床診斷。

4.5 其他分子生物學檢測方法

現(xiàn)在發(fā)表最多的檢測腺病毒的方法是PCR，此外還有PCR與其他方法結(jié)合建立的檢測方法。Steer P R等[38]對六鄰體基因的3個區(qū)域進行分析后，建立PCR 和高分辨率熔融(HRM)曲線分析的方法，其中Hexon L1 PCR產(chǎn)物的HRM曲線分析可區(qū)分所有FAdV血清型。Ganesh K等[39]通過PCR結(jié)合Southern雜交成功地從印度的噬血細胞綜合征(hemophagocytic syndrome,HPS)病例中檢測到FAdV-4。王利麗等[40]根據(jù)FAdV-4的penton基因設計引物，建立了檢測4型腺病毒的納米PCR方法(Nano PCR)，對FAdV-4的最低核酸檢出限度為54拷貝/μL，特異性較強，可用于臨床感染的檢測。

5 小結(jié)

HHS自發(fā)現(xiàn)以來給全球養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，為了加強對該病的防控，使用快速有效的流行病學調(diào)查及檢測方法尤為重要。檢測FAdV-4的方法主要有血清學檢測方法和分子生物學檢測方法。PCR檢測是目前用的最多，也是國內(nèi)外學者研究最多的方法，大多數(shù)PCR檢測方法的引物設計是在hexon基因，也有在penton基因設計引物成功檢測4型禽腺病毒的報道[33]。由于real-time PCR可對病毒進行定量，近年來也有real-time PCR對FAdV-4進行定量的報道，其他與PCR相結(jié)合的檢測方法如PCR-RFLP，可將PCR產(chǎn)物用酶切之后直接進行凝膠電泳觀察，根據(jù)產(chǎn)生的基因片段的大小進行分型。LAMP靈敏度高、反應時間短、設備要求簡單，也受到了眾多學者的關注。ELISA具有操作簡單、快速、特異性強等優(yōu)點，常被用作血清流行病學調(diào)查的主要方法。近年來國內(nèi)外學者建立的ELISA檢測方法，大多都是基于禽腺病毒的衣殼蛋白，尤其是fiber蛋白，這與fiber蛋白能識別細胞受體并刺激機體產(chǎn)生中和抗體介導免疫反應的特性有關。同時，由于ELISA方法簡便、快速等優(yōu)勢，已成為臨床檢測禽腺病毒感染的一種重要檢測方法。