伴侶動(dòng)物源細(xì)菌質(zhì)粒介導(dǎo)的黏菌素耐藥機(jī)制研究進(jìn)展

唐欣悅，周煜博，張玉珠，鄭慧華，黃榮磊，于 超，杜崇濤，謝光洪

(吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林長春 130062)

抗菌藥物是治療伴侶動(dòng)物感染性細(xì)菌性疾病的重要工具，例如犬和貓傷口感染、呼吸系統(tǒng)感染和泌尿道感染等都是臨床中常見的需用抗菌藥物治療的疾病，為了控制這些細(xì)菌性疾病或并發(fā)癥，不合理或頻繁用藥易導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性甚至多重耐藥性。一旦抗菌藥物效力喪失，將會(huì)嚴(yán)重影響動(dòng)物的健康和福利[1]。

黏菌素是治療多重耐藥(multidrug-resistance，MDR)革蘭氏陰性細(xì)菌，尤其是碳青霉烯類耐藥腸桿菌科引起感染的最后手段。目前，耐黏菌素革蘭氏陰性菌已在犬、貓和人類分離的腸桿菌科中出現(xiàn)，且不同于已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的多黏菌素耐藥機(jī)制，質(zhì)粒介導(dǎo)的新型移動(dòng)黏菌素抗性(mobile colistin resistance，mcr)基因可以隨著質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移在不同細(xì)菌中水平傳播，多種細(xì)菌及動(dòng)物宿主均能攜帶mcr基因[2]。

隨著現(xiàn)代社會(huì)中伴侶動(dòng)物的大量增加，它們的社會(huì)角色也發(fā)生了變化。越來越多的養(yǎng)寵人士將寵物視為“朋友”或“家庭成員”，對寵物情感陪伴的需求加大。與抗生素耐藥性和伴侶動(dòng)物的耐藥性轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的一個(gè)獨(dú)特方面是它們與人類的密切接觸，這增加了寵物與人之間細(xì)菌傳遞的可能性，為耐藥細(xì)菌的種間傳播創(chuàng)造了機(jī)會(huì)，伴侶動(dòng)物中有耐藥性細(xì)菌的出現(xiàn)成為了一個(gè)重大的公共衛(wèi)生問題[3]。本文介紹了當(dāng)前黏菌素的使用情況，耐藥和傳播機(jī)制及耐藥菌在伴侶動(dòng)物與人之間的流行情況等，這對伴侶動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性的研究具有重要意義。

1 黏菌素使用情況

多黏菌素是一類非核糖體合成的陽離子、環(huán)肽類抗生素，在已知的5種亞型A、B、C、D、E中，廣泛用于動(dòng)物生產(chǎn)實(shí)踐的為多黏菌素E和多黏菌素B[4]。其中多黏菌素B的抗菌活性最強(qiáng)，最初被發(fā)現(xiàn)是由革蘭氏陽性菌多黏菌芽孢桿菌產(chǎn)生的。多黏菌素E又叫做黏菌素，分子質(zhì)量1 750 u，由一個(gè)環(huán)七肽組成，其N端有一個(gè)脂肪酸尾?；娜逆淣端脂肪?；蔚氖杷允枪逃卸拘缘闹饕?，并對黏菌素的抗菌活性產(chǎn)生重大影響[5]。市面上有兩種不同形式的黏菌素，即口服和局部使用的硫酸黏菌素和用于腸外及氣霧劑治療的甲基磺酸黏桿菌素(colistin methanesulfonate，CMS)，兩種形式均可吸入。黏菌素(通常用作硫酸鹽)是一種聚陽離子，而黏菌酯(用作鈉鹽)是一種生理pH下的聚陰離子。黏菌素能作為飼料添加劑來促進(jìn)動(dòng)物生長或治療由腸桿菌科細(xì)菌引起的疾病[6]。

黏菌素潛在的腎毒性和神經(jīng)毒性阻礙了其廣泛引入常規(guī)臨床治療，自20世紀(jì)90年代中期以來，由于耐多藥革蘭氏陰性菌(尤其是銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和肺炎克雷伯氏菌)的流行以及新型抗生素的缺乏，人們重新對黏菌素產(chǎn)生了興趣[7]。當(dāng)使用b-內(nèi)酰胺、氨基糖苷或喹諾酮類藥物無效時(shí)，多黏菌素，尤其是黏菌素，因?yàn)樗哂锌焖贇缂?xì)菌、窄譜活性以及相關(guān)的耐藥性發(fā)展緩慢等優(yōu)點(diǎn)，仍然是治療耐多藥革蘭氏陰性超級病菌感染的最后手段。但隨著黏菌素在臨床的大量使用，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了對黏菌素和碳青霉烯類抗生素同時(shí)耐藥的細(xì)菌[8]。

2 黏菌素潛在耐藥機(jī)制

2.1 黏菌素傳統(tǒng)耐藥機(jī)制

目前所報(bào)道的關(guān)于黏菌素的固有耐藥性，主要與通過多種途徑進(jìn)行的脂多糖修飾有關(guān)。最常見的為外膜孔蛋白的特異性修飾和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)整體負(fù)電荷的減少，其次是外排泵系統(tǒng)的過度表達(dá)和膠囊多糖的形成。

革蘭氏陰性菌對黏菌素的耐藥性最常見的原因是由于PhoPQ和PmrAB(兩種雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng))的變化引起的脂多糖重塑，導(dǎo)致與細(xì)菌外膜的結(jié)合減少，從而導(dǎo)致陰離子脂質(zhì)A，停止或減少與不同機(jī)制的初始交互[9]。pmr位點(diǎn)是一個(gè)自動(dòng)調(diào)節(jié)的雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，除了一個(gè)傳感器激酶和響應(yīng)調(diào)節(jié)器外，還包括一個(gè)乙醇胺轉(zhuǎn)移酶。乙醇胺轉(zhuǎn)移酶通過在LPS的脂質(zhì)A組分中添加乙醇胺部分，有助于提高黏菌素的耐藥性，從而減少細(xì)菌膜的負(fù)電荷，減少帶正電荷的黏菌素的結(jié)合[10]。在許多革蘭氏陰性細(xì)菌中，獲得性多黏菌素耐藥性通常是通過添加4-氨基-4-脫氧-l-阿拉伯糖和或磷酸乙醇胺(phosphoethanolamine，PetN)來替代脂質(zhì)A來介導(dǎo)的。這種作用需要由pmrC介導(dǎo)的ugd和pbg位點(diǎn)和乙醇胺的產(chǎn)物，因此這些修飾去除負(fù)電荷，降低了LPS的親和力，從而增加了對黏菌素的抗性[11]。

激活外排泵或外排泵調(diào)節(jié)劑如敏感抗菌肽(sensitivity to antimicrobial peptides，Sap)蛋白、BrlR、KpnEF或AcrAB-TolC復(fù)合物會(huì)導(dǎo)致對黏菌素的耐藥性增加。Sap蛋白由sapABCDF操縱子編碼的5個(gè)蛋白質(zhì)組成，在腸道沙門氏菌血清型鼠傷寒桿菌中，已經(jīng)證明Sap蛋白對一些青霉肽和魚精蛋白的耐藥性是必要的，但它們對防御素?zé)o效。然而，該操縱子似乎在多黏菌素耐藥性中發(fā)揮了作用，因?yàn)槠渫蛔儗?dǎo)致奇異瘧原蟲突變體對多黏菌素B的易感性增加[12]。在鮑曼不動(dòng)桿菌中，18個(gè)假定的外排轉(zhuǎn)運(yùn)體被氯化鈉的生理水平上調(diào)，并導(dǎo)致對多黏菌素的耐受性增加，包括一種名為CarO的孔蛋白[13]。使用外排泵抑制劑，特別是羰基氰化物3-氯苯肼(carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone，CCCP)，表明外排泵確實(shí)對肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)菌和嗜麥芽窄營養(yǎng)單胞菌的黏菌素耐藥有影響，進(jìn)一步支持外排泵系統(tǒng)參與黏菌素耐藥[14]。

膠囊在對黏菌素的抗性中也發(fā)揮了作用。在空腸彎曲菌中，低脂糖中修飾細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的鎳碳糖唾液酸的截?cái)嘣黾恿藢Χ囵ぞ谺的敏感性。同時(shí)，還觀察到膠囊中單層的肺炎克雷伯氏菌會(huì)比多層的菌株對黏菌素的耐藥性弱一些。此外，肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯氏菌或銅綠假單胞菌對未封裝的肺炎克雷伯氏菌、大腸埃希氏菌或銅綠假單胞菌的膠囊表達(dá)導(dǎo)致對多黏菌素B的耐藥性增加[15]。最后，一些調(diào)控膠囊形成的調(diào)控因子，如Cpx(結(jié)合菌毛表達(dá))和Rcs(膠囊合成調(diào)控因子)，似乎通過激活Cpx的外排泵KpnEF或調(diào)節(jié)PhoPQTCS參與黏菌素耐藥[16]。

2.2 質(zhì)粒介導(dǎo)的黏菌素新型耐藥機(jī)制

各種細(xì)菌對黏菌素具有內(nèi)在的抗性，而獲得性抗性是由于染色體突變或質(zhì)粒上基因的獲得而產(chǎn)生的耐藥性。2016年我國學(xué)者在一株大腸埃希菌(SHP45)中首次發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒介導(dǎo)的黏菌素耐藥基因mcr-1[17],繼而世界上40多個(gè)國家發(fā)現(xiàn)了這種攜帶耐藥性質(zhì)粒的菌株傳播，隨后陸陸續(xù)續(xù)在腸桿菌科細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)其他新型耐藥基因。目前，全球共發(fā)現(xiàn)有10種質(zhì)粒介導(dǎo)的黏菌素耐藥基因,分別命名為mcr-1 、mcr-2、mcr-3、mcr-4、mcr-5、mcr-6、mcr-7、mcr-8、mcr-9和mcr-10。

mcr-1基因全長為1 626 bp，G+C含量49%，位于Incl2型質(zhì)粒上。通過預(yù)測，其編碼的產(chǎn)物mcr-1蛋白與類芽孢桿菌編碼的PetN轉(zhuǎn)移酶的同源性達(dá)63%，mcr-1可以將PetN添加至LPS 的脂質(zhì)A部分，使LPS的負(fù)電荷減少，從而減弱黏菌素與細(xì)菌的結(jié)合作用,導(dǎo)致細(xì)菌對黏菌素耐藥[18]。mcr-1耐藥基因主要存在大腸埃希菌中，但最近攜帶mcr-1耐藥基因的肺炎克雷伯氏菌也出現(xiàn)暴發(fā)的趨勢。目前在Incl2、IncHI1、IncHl2、IncX4、IncFI、IncFII、IncK和IncP等多種腸桿菌質(zhì)粒中都檢測出mcr-1基因。mcr-2基因全長為1 617 bp，位于lncX4型質(zhì)粒上，與mcr-1的核苷酸序列一致性為76.8%。其上、下游基因環(huán)境也與mcr-l相似，mcr-2上游有移動(dòng)元件IS1595超家族，下游有297 bp 的開放閱讀框(open reading frames,ORFs)，編碼磷脂酸磷酸酶(phosphatidate phosphatase，PAP)膜結(jié)合脂質(zhì)磷酸酶，攜帶mcr-2的 pKP37-BE質(zhì)粒不攜帶其他耐藥基因。mcr-3基因全長1 626 bp，與mcr-1和mcr-2的核苷酸同源性較低，僅有45.0%和47.0%。該基因位于IncHI2類型的質(zhì)粒pWJ 1上。mcr-3上游含有截短的產(chǎn)氣單胞菌特有的轉(zhuǎn)座子元件TnAs[19]。通過結(jié)構(gòu)域的互換以及序列分析證實(shí)，mcr-1和mcr-2同屬同一個(gè)基因家族，而且mcr-2的跨膜區(qū)域比mcr-1的跨膜結(jié)構(gòu)域更有助于細(xì)菌對多黏菌素耐藥。進(jìn)化分析顯示mcr-1、mcr-2可能來源于Paenibacillus基因組上的磷酸乙醇轉(zhuǎn)移酶[20]。相關(guān)研究報(bào)道，mcr-3可能也來源于Aeromonas基因組上的磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶，因?yàn)閿y帶mcr-3基因質(zhì)粒的相關(guān)轉(zhuǎn)座元件與Aeromonas基因組上的磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶的區(qū)域有高度的同源性，這表明質(zhì)粒介導(dǎo)的多黏菌素耐藥基因起源的多樣性[21]。

mcr-4基因全長為1 626 bp,位于ColE10型質(zhì)粒pmcr上，含有移動(dòng)元件IS5，其編碼的蛋白mcr-4 的氨基酸序列與mcr-1、mcr-2和mcr-3的同源性分別為34.0%、35.0%和49.0%[22]。從結(jié)構(gòu)方面上講，mcr-4的空間結(jié)構(gòu)與研究較為清楚的mcr-1結(jié)構(gòu)相似，它們都有N端的跨膜結(jié)構(gòu)域和C端的催化結(jié)構(gòu)域以及兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的連接區(qū)域。從進(jìn)化方面講，mcr-4和mcr-1在進(jìn)化樹上面形成了不同的進(jìn)化分支，mcr-4與mcr-1的結(jié)構(gòu)域互換試驗(yàn)也證明二者不能發(fā)生互換[23]。但是與磷酸乙醇胺脂質(zhì)A轉(zhuǎn)移酶(phosphoethanolamine-lipid A transferase，EptA)不同，mcr-1和mcr-4可以賦予敏感菌株大腸埃希氏菌耐多耐菌素的水平達(dá)到16 μg/mL,這表明，雖然mcr-1和mcr-4進(jìn)化和結(jié)構(gòu)方面存在著一定的差異，但是具有相似的功能性。根據(jù)流式細(xì)胞結(jié)果和激光共聚焦顯微結(jié)果表明，mcr-4蛋白可以減少多黏菌素對宿主菌大腸埃希氏菌產(chǎn)生的活性氧化物(reactive oxygen species，ROS)，化學(xué)拯救試驗(yàn)表明，鐵螯合劑、半胱氨酸可以減少芬頓反應(yīng)產(chǎn)生的自由基[24]。

mcr-5基因全長為1 644 bp，是Tn3家族轉(zhuǎn)座子的一部分，位于多拷貝ColE型質(zhì)粒上。mcr-5基因編碼的EptA與mcr-1、mcr-2、mcr-3、mcr-4的同源性分別為36.1%、35.3%、34.7%和33.7%[25]。mcr-6基因最初被認(rèn)為是來自莫拉氏菌屬的mcr-2的變種mcr-2.2，后更名為mcr-6.1,該基因全長1 617 bp,與最初發(fā)現(xiàn)的來自大腸埃希氏菌的mcr-2相比，有65個(gè)氨基酸不一致，同源性為87.9%，與來自莫拉氏菌屬的另一個(gè)變種mcr-2.1編碼的蛋白mcr-2.1相比，有66個(gè)氨基酸不一致，氨基酸同源性為87.8%。由mcr-6.1(mcr-2.2)編碼的EptA 與mcr-1和mcr-2的同源性為62%～64%[26]。mcr-7基因全長1 620 bp，定位于Incl2型質(zhì)粒(pSC20141012) 上，該質(zhì)粒上還同時(shí)攜帶有blaCTX-M-55耐藥基因。在mcr-7側(cè)翼序列中，沒有發(fā)現(xiàn)移動(dòng)原件，mcr-7.1編碼的蛋白含有539個(gè)氨基酸,被注釋為EptA[27]。mcr-7與之前發(fā)現(xiàn)的mcr-1、mcr-2、mcr-3、mcr-4、mcr-5、mcr-6相比，其氨基酸同源性分別為35%、34%、70%、45%、36%和 33%[27]。mcr-8基因全長為1 698 bp，位于IncFII類型的質(zhì)粒上，該序列與mcr-3對應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列同源性為50.23%,該基因編碼的氨基酸序列與mcr-1.mcr-2、mcr-3、mcr-4、mcr-5、mcr-6和mcr-7的同源性分別為31.1%、30.3%、40.0%、37.9%、33.59%、30.49%和37.5%[28]。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，mcr-1.1的患病率下降，相比之下，在2017年-2021年收集的許多分離株中均觀察到mcr-9.1和mcr-10.1的出現(xiàn)[29]。mcr-9的氨基酸序列從2010年華盛頓州一名人類患者分離的MDR腸炎沙門氏菌血清型鼠傷寒(Serovartyphimurium)菌株中檢測到，與mcr-3的氨基酸同源性達(dá)到64.5%。9個(gè)mcr同源物(mcr-1至9)表明mcr-9、mcr-3、mcr-4和mcr-7在結(jié)構(gòu)水平上具有高度的相似性[30]。mcr-10在中國臨床腸桿菌090065中提取的非結(jié)合IncFIA(HI1)質(zhì)粒中被發(fā)現(xiàn)，它與mcr-9的核苷酸同源性為79.69%，并且黏菌素最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)增加了4倍(從1 mg/L～4 mg/L)。通過對基因庫的篩選，在四大洲國家的各種腸桿菌科物種中發(fā)現(xiàn)了mcr-10，這表明該基因已廣泛傳播[31]。mcr-10顯示了79.04%至83.67%的氨基酸同一性和高度保守的預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，具有不同Buttiauxella物種的染色體編碼的mcr樣磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶(此處指定為mcr-B)。因此，mcr-10、mcr-9和mcr-B蛋白可能起源于一個(gè)共同的祖先?；驇熘凶钤缙ヅ鋗cr-10的是1株弗氏檸檬酸桿菌臨床菌株的質(zhì)粒pOZ172，該菌株于1998年在中國廣州發(fā)現(xiàn)，這表明數(shù)十年來，mcr-10一直由腸桿菌科的質(zhì)粒動(dòng)員[32]。

3 黏菌素耐藥菌流行現(xiàn)狀

動(dòng)物的糞便一方面殘留有抗菌藥物或其活性代謝產(chǎn)物，同時(shí)也含有豐富的耐藥菌或耐藥基因。目前，mcr-1已在6大洲，30多個(gè)國家被發(fā)現(xiàn)，這表明mcr-1已在全球范圍內(nèi)形成了流行。在我國，已有25個(gè)省(自治區(qū))分離到了攜帶有mcr-1的細(xì)菌。2016年，Liu Y Y等[17]在中國動(dòng)物、食品和患者的大腸埃希氏菌分離株中全球范圍內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)了一個(gè)可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒介導(dǎo)的黏菌素耐藥基因mcr-1。此外，在患者的肺炎克雷伯氏菌中發(fā)現(xiàn)了mcr-1，水平基因轉(zhuǎn)移代表了黏菌素耐藥性的一種范式轉(zhuǎn)變，在此之前，它只被發(fā)現(xiàn)是由染色體突變介導(dǎo)的，從而通過垂直傳播來實(shí)現(xiàn)。此后陸續(xù)報(bào)道出質(zhì)粒介導(dǎo)的新型黏菌素耐藥基因，近年來，在尼日利亞[33]、韓國[34]、英國[35]等國家的犬、貓和人分離株中都得到mcr陽性菌株且為MDR。2020年，Moon D C等[34]在韓國首次從伴侶動(dòng)物糞便和尿液樣本中回收的大腸埃希氏菌分離株中存在移動(dòng)黏菌素耐藥基因mcr-1，且攜帶mcr-1的質(zhì)粒與來自韓國患者的質(zhì)粒密切相關(guān)。研究顯示，在299個(gè)家庭(犬及其主人)的直腸拭子中檢測到攜帶mcr-1和blaCTX-M的患病率分別為2.7%和5.3%，同時(shí)發(fā)現(xiàn)犬和它們的主人之間mcr-1的攜帶存在顯著關(guān)聯(lián)，并分離出相同的mcr-1陽性大腸埃希氏菌(mcr-1-positveEscherichiacoli，mcrPEC)或blactx-m陽性大腸埃希氏菌(bla CTX-M-positiveE.coli，CTX-MPEC)菌株，耐藥細(xì)菌所表現(xiàn)出的共定植潛力，正可能是耐藥基因傳播的風(fēng)險(xiǎn)。而前3個(gè)月抗生素的使用與犬的blaCTX-M攜帶有關(guān)，只觀察到1只犬和主人攜帶相同的CTX-MPEC。雖然在一個(gè)家族中流行相同的菌株非常罕見，但世界范圍內(nèi)擁有足夠數(shù)量的犬，這種威脅在寵物和人類中應(yīng)當(dāng)受到重視[36]。自從質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因mcr-1被發(fā)現(xiàn)后，陸續(xù)有mcr-2～mcr-10基因被報(bào)道，2019年在羅根岡腸桿菌臨床菌株的IncFIA質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)與mcr-9的核苷酸同源性最高為79.69%的新型質(zhì)粒攜帶的黏菌素耐藥基因mcr-10[31]。這些耐藥基因的突變率很高，并且可在菌株間傳播，引起大范圍的流行。

4 展望

耐藥細(xì)菌不斷出現(xiàn)在環(huán)境中，同伴動(dòng)物和幾種耐多藥生物體在伴侶動(dòng)物和人類之間共存。然而，這些細(xì)菌在動(dòng)物和人類之間傳遞、轉(zhuǎn)移的方向仍然難以確定，在伴侶動(dòng)物中使用抗菌藥物意味著選擇、隱藏和傳播抗菌藥物耐藥性的可能性，這對公眾健康構(gòu)成潛在風(fēng)險(xiǎn)。

隨著對先進(jìn)治療的需求不斷增加，加上耐多藥細(xì)菌的傳播，未來在獸醫(yī)學(xué)中可能需要新的抗菌劑來解決耐藥細(xì)菌和耐藥基因向人類傳播的有關(guān)問題。微生物危害可能直接或間接對人類健康造成不利影響，對人類健康的直接危害定義為從動(dòng)物傳播給人類并導(dǎo)致人類疾病(人獸共患病)的抗藥性細(xì)菌，間接危害是可能從伴侶動(dòng)物傳播給動(dòng)物的抗性基因?qū)娊】档挠绊?。而?dòng)物源性抗生素耐藥性向人類的傳播是復(fù)雜的，需要進(jìn)一步研究。