無(wú)血清全懸浮培養(yǎng)Vero細(xì)胞系的建立及生物反應(yīng)器培養(yǎng)參數(shù)優(yōu)化

楊惠清，武發(fā)菊，葛玉鳳，劉小剛，安芳蘭，劉學(xué)榮，胡永浩

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730000；2.中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，甘肅蘭州 730046)

Vero細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞)是日本學(xué)者Yasumura和Kawakita在 1962 年從非洲綠猴腎臟分離的首個(gè)用于生產(chǎn)人用生物制品的異倍體貼附依賴性細(xì)胞[1]。Vero細(xì)胞是世界衛(wèi)生組織(WHO)和我國(guó)生物制品規(guī)程認(rèn)可的生產(chǎn)疫苗的細(xì)胞系[2-3]。與用作疫苗生產(chǎn)的原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞和其他一些傳代細(xì)胞基質(zhì)相比，Vero細(xì)胞的來(lái)源方便，生物安全性高，對(duì)多種病毒的感染敏感、病毒增殖滴度高，是很多病毒理想的基質(zhì)，能廣泛用于人和動(dòng)物疫苗的生產(chǎn)[4]。為了獲得高濃度的產(chǎn)品，首先需要獲得高密度的細(xì)胞。近年來(lái)，微載體培養(yǎng)技術(shù)在 Vero 細(xì)胞的培養(yǎng)上得到了廣泛的應(yīng)用。周健等[5]通過(guò)微載體生物反應(yīng)器培養(yǎng)制備的Vero細(xì)胞流感H1N1亞型全病毒滅活疫苗各項(xiàng)指標(biāo)符合《中國(guó)藥典》規(guī)定；劉志成等[6]利用微載體培養(yǎng)技術(shù)，初步建立了生物反應(yīng)器-微載體培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)Vero細(xì)胞制備CA16的工藝，為CA16滅活疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。但是，與懸浮培養(yǎng)相比，微載體的使用不僅加大了細(xì)胞培養(yǎng)的成本，也給培養(yǎng)規(guī)模的放大帶來(lái)了不便[7]。因此，Vero細(xì)胞全懸浮培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。Rourou S等[8]利用自制的培養(yǎng)基，獲得了可在搖瓶中懸浮生長(zhǎng)的Vero細(xì)胞(VeroS)，細(xì)胞密度水平高于2.0×106cells/mL，結(jié)果與在Cytodex1微載體上生長(zhǎng)的Vero細(xì)胞結(jié)果相當(dāng)。

本研究對(duì)貼壁型Vero細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)馴化，篩選出1株可無(wú)血清全懸浮培養(yǎng)的Vero細(xì)胞，建立相應(yīng)細(xì)胞庫(kù)，進(jìn)行相關(guān)檢定，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了規(guī)?；瘧?yīng)用，優(yōu)化了生物反應(yīng)器培養(yǎng)參數(shù)，使其可在生物反應(yīng)器中高密度生長(zhǎng)，為以Vero細(xì)胞為基質(zhì)的病毒性疫苗的生產(chǎn)提供參考，也填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)Vero細(xì)胞全懸浮培養(yǎng)技術(shù)的空白。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 貼壁Vero細(xì)胞為中農(nóng)威特生物科技股份有限公司于2015年2月從美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American type culture collection,ATCC)引進(jìn)，編號(hào)為CCL-81。

1.1.2 主要試劑 無(wú)血清培養(yǎng)基(virus production-serum-free medium，VP-SFM)，蘇州沃美公司產(chǎn)品；DMEM (minimum essential medium)培養(yǎng)基、胎牛血清(fatal bovine serum，F(xiàn)BS)、胰蛋白酶和DMSO，美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器設(shè)備 CO2搖床，上海比奧實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司產(chǎn)品；7.5 L反應(yīng)器，Sartorius公司產(chǎn)品；臺(tái)式冷凍離心機(jī)，Thermo Fisher公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡，日本Olympus公司產(chǎn)品；CASY細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀，羅氏公司產(chǎn)品；液氮罐，四川亞西橡塑機(jī)械有限公司低溫設(shè)備廠產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)，蘇凈安泰公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 Vero細(xì)胞的懸浮馴化 采用常規(guī)方法復(fù)蘇1支Vero貼壁細(xì)胞，用逐步降血清法適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)。具體方法如下：用含 100 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞，傳2代后用胰蛋白酶消化，傳代至含50 mL/L FBS的培養(yǎng)基(500 mL/L DMEM+500 mL/L VP-SFM)中培養(yǎng)，待鋪滿后適應(yīng)含30 mL/L FBS的培養(yǎng)基(300 mL/L DMEM+700 mL/L VP-SFM)，再適應(yīng)含10 mL/L FBS的培養(yǎng)基(100 mL/L DMEM+900 mL/L VP-SFM)，進(jìn)行血清饑餓處理(于傳代前12 h更換不含血清的培養(yǎng)基)后，適應(yīng)VP-SFM，最終獲得無(wú)血清培養(yǎng)Vero細(xì)胞株。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期已適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)的Vero細(xì)胞接種至無(wú)血清培養(yǎng)基VP-SFM，并轉(zhuǎn)移至搖瓶中，培養(yǎng)過(guò)程中，根據(jù)細(xì)胞的增殖狀態(tài)，調(diào)整培養(yǎng)參數(shù)，連續(xù)傳代至細(xì)胞完全失去黏附瓶壁的能力，以單個(gè)細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)于培養(yǎng)液中，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定，傳代細(xì)胞密度大于2.0×106cells/mL，活率大于90%，認(rèn)為Vero細(xì)胞已適應(yīng)懸浮無(wú)血清培養(yǎng)。

1.2.2 懸浮Vero細(xì)胞庫(kù)的建立

1.2.2.1 原始細(xì)胞庫(kù) 將1.2.1中已適應(yīng)無(wú)血清懸浮培養(yǎng)的Vero細(xì)胞，連續(xù)傳代至細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定時(shí)收集適量細(xì)胞離心，加入凍存液，吹打混勻，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為7.0×106cells/mL，每只凍存管分裝1.5 mL。梯度凍存后放入-70 ℃冰箱過(guò)夜，再放于-196 ℃液氮罐中保存，作為原始細(xì)胞庫(kù)。

1.2.2.2 主細(xì)胞庫(kù) 取1支原始細(xì)胞庫(kù)細(xì)胞，于40 ℃純水中1 min內(nèi)復(fù)融，取適量37 ℃預(yù)熱的新鮮培養(yǎng)基置于離心管中，將上述細(xì)胞加入離心管中，混勻后600 r/min離心5 min除去冷凍保護(hù)液，棄上清，再加入適量新鮮培養(yǎng)液，接種至培養(yǎng)瓶中，接種密度為0.6×106cells/mL 左右，37 ℃恒溫?fù)u床振蕩(轉(zhuǎn)速120 r/min)培養(yǎng)48 h左右，取樣計(jì)數(shù)。連續(xù)傳代至細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定時(shí)收集適量細(xì)胞離心，加入凍存液，吹打混勻，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為7.0×106cells/mL，每只凍存管分裝1.5 mL。梯度凍存后放入-70 ℃冰箱過(guò)夜，再放于-196 ℃液氮罐中保存，作為主細(xì)胞庫(kù)。

1.2.2.3 工作細(xì)胞庫(kù) 取1支主細(xì)胞庫(kù)細(xì)胞，于40 ℃純水中1 min內(nèi)復(fù)融，取適量37 ℃預(yù)熱的新鮮培養(yǎng)基置于離心管中，將上述細(xì)胞加入離心管中，混勻后600 r/mim離心5 min除去冷凍保護(hù)液，棄上清，再加入適量新鮮培養(yǎng)液，接種至培養(yǎng)瓶中，接種密度為0.6×106cells/mL 左右，37 ℃恒溫?fù)u床振蕩(轉(zhuǎn)速120 r/min)培養(yǎng)48 h左右，取樣計(jì)數(shù)。連續(xù)傳代至細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定時(shí)收集適量細(xì)胞離心，加入凍存液，吹打混勻，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1.2×107cells/mL，每只凍存管分裝1.5 mL。梯度凍存后放入-70 ℃冰箱過(guò)夜，再放于-196 ℃液氮罐中保存，作為工作細(xì)胞庫(kù)。

1.2.3 Vero細(xì)胞原始細(xì)胞庫(kù)、主細(xì)胞庫(kù)和工作細(xì)胞庫(kù)的檢定

1.2.3.1 細(xì)胞形態(tài)觀察及活力檢測(cè) 取原始細(xì)胞庫(kù)、主細(xì)胞庫(kù)及工作細(xì)胞庫(kù)Vero細(xì)胞各1支復(fù)蘇，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，采用細(xì)胞分析儀檢測(cè)細(xì)胞密度和活力，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)，并拍照。

1.2.3.2 生長(zhǎng)曲線 將復(fù)蘇后傳代1次的細(xì)胞，調(diào)整接種濃度為 0.6×106cells/mL，接種至培養(yǎng)瓶中，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h取樣，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，直至細(xì)胞密度降低為止，繪制生長(zhǎng)曲線并求得最大增殖數(shù)量和倍增時(shí)間(PDT)[9]。

1.2.3.3 細(xì)胞的傳代穩(wěn)定性 取工作細(xì)胞庫(kù)Vero細(xì)胞1支，復(fù)蘇，按0.6×106cells/mL無(wú)菌接種至培養(yǎng)瓶中進(jìn)行連續(xù)傳代，共傳20代，用細(xì)胞分析儀進(jìn)行細(xì)胞密度和活率測(cè)定，比較48 h細(xì)胞密度及活率。

1.2.3.4 無(wú)菌、支原體和病毒檢查 按《中國(guó)獸藥典》三部(2020版)附錄進(jìn)行檢查[10]。

1.2.3.5 染色體分析 參照《四種動(dòng)物傳代細(xì)胞染色體變異率分析》中染色體標(biāo)本制備方法進(jìn)行染色體制片，Gimesa染色后油鏡下觀察并拍照，分別對(duì)100個(gè)染色體鋪展完好的片子進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[11]。

1.2.4 懸浮細(xì)胞培養(yǎng)工藝的放大

1.2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 為了找到最佳的試驗(yàn)條件及因素間的交互作用，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以細(xì)胞密度為響應(yīng)值，以pH、溶氧和攪拌轉(zhuǎn)速為影響因素，設(shè)計(jì)3因素3水平共17次試驗(yàn)的響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化篩選出的最優(yōu)培養(yǎng)參數(shù)。各因素及水平見(jiàn)表1。懸浮Vero細(xì)胞經(jīng)搖瓶逐步擴(kuò)大培養(yǎng)，按照初始密度為0.6×106cells/mL 接種于7.5 L生物反應(yīng)器。采用攪拌式培養(yǎng)，有效培養(yǎng)體積為4 L，培養(yǎng)溫度37 ℃，其余培養(yǎng)參數(shù)按表1所示的培養(yǎng)參數(shù)進(jìn)行試驗(yàn)，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.4.2 優(yōu)化結(jié)果的驗(yàn)證 用最優(yōu)化的培養(yǎng)參數(shù)培養(yǎng)Vero細(xì)胞，比較此條件下的細(xì)胞密度與通過(guò)多元函數(shù)分析確定出的極值及取得極值所對(duì)應(yīng)的變量值，以驗(yàn)證模型的可靠性，并確定最后優(yōu)化的結(jié)果。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)的因素及水平

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞馴化及傳代

貼壁培養(yǎng)的Vero細(xì)胞在逐步降血清至無(wú)血清培養(yǎng)的過(guò)程中，細(xì)胞未表現(xiàn)出明顯的形態(tài)差異，適應(yīng)了無(wú)血清環(huán)境，表現(xiàn)為貼壁良好、細(xì)胞透亮、邊緣清晰，形狀多為長(zhǎng)梭形，生長(zhǎng)迅速，活力高，傳代穩(wěn)定。

將已適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)的Vero細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基在125 mL三角瓶中傳代，懸浮培養(yǎng)初期Vero細(xì)胞大量死亡，活率較低，增大接種密度以維持培養(yǎng)初期較高的密度，采用離心換液的方式傳代，800 r/min離心5 min，傳代8代～10代后逐步適應(yīng)，生長(zhǎng)速度逐漸變快，倍增時(shí)間逐步規(guī)律，獲得了適應(yīng)無(wú)血清懸浮培養(yǎng)的Vero細(xì)胞懸浮細(xì)胞。細(xì)胞呈圓形、飽滿、透亮，邊緣整齊，大小均勻，細(xì)胞液干凈、透亮。細(xì)胞馴化過(guò)程中細(xì)胞生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖1。

2.2 Vero細(xì)胞原始細(xì)胞庫(kù)、主細(xì)胞庫(kù)、工作細(xì)胞庫(kù)的檢定

2.2.1 細(xì)胞的形態(tài)觀察 顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞圓形、飽滿、透亮，邊緣整齊，大小均勻，細(xì)胞液干凈、透亮，呈現(xiàn)較好的懸浮生長(zhǎng)狀態(tài)(圖2)。

2.2.2 Vero細(xì)胞復(fù)蘇后的活率 原始細(xì)胞庫(kù)、主細(xì)胞庫(kù)及工作細(xì)胞庫(kù)Vero細(xì)胞活率分別為95.4%、96.0%和95.5%，均高于80%。

2.2.3 Vero細(xì)胞系的生長(zhǎng)曲線 Vero細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線均呈“ S ”型(圖 3)，最大增殖密度為4.2×106cells/mL，平均倍增時(shí)間為19.6 h。

2.2.4 Vero細(xì)胞的傳代穩(wěn)定性 連續(xù)傳20代，48 h細(xì)胞活率在94.5%～96.5%之間，較穩(wěn)定；從P3代開(kāi)始，傳代過(guò)程中細(xì)胞密度處于較穩(wěn)定的范圍內(nèi)，表明細(xì)胞傳代過(guò)程中生長(zhǎng)較穩(wěn)定(圖4)。

2.2.5 無(wú)菌、支原體和病毒檢查結(jié)果 無(wú)菌和支原體檢查結(jié)果為陰性，病毒檢查中未出現(xiàn)細(xì)胞病變、紅細(xì)胞凝集和紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象。

A.100 mL/L血清培養(yǎng)的Vero細(xì)胞；B.適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)的Vero細(xì)胞；C.初始無(wú)血清懸浮培養(yǎng)的Vero細(xì)胞；D.適應(yīng)無(wú)血清懸浮培養(yǎng)的Vero細(xì)胞。

圖2 Vero細(xì)胞形態(tài)(200×)

圖3 Vero細(xì)胞系生長(zhǎng)曲線

2.2.6 Vero細(xì)胞核型分析結(jié)果 對(duì)Vero細(xì)胞系的100個(gè)鋪展完好的中期相的染色體數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，Vero細(xì)胞系的染色體數(shù)為58或60的占75%，染色體中期分裂相見(jiàn)圖5。

圖4 細(xì)胞活率及48 h密度曲線

圖 5 Vero細(xì)胞染色體的顯微鏡觀察(1 000×)

2.3 生物反應(yīng)器培養(yǎng)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果 響應(yīng)面圖呈馬鞍型，表明有極值存在，決定系數(shù)R2為0.955 4，表明Y值變化的95.54%可由此模型解釋，模型擬合程度較好。根據(jù)響應(yīng)面變化情況，pH、溶氧和攪拌轉(zhuǎn)速的最佳值為7.07、49.54%和80.45 r/min，在此條件下，預(yù)測(cè)細(xì)胞密度可達(dá)4.555×106cells/mL(表2和圖6)。

2.3.2 優(yōu)化結(jié)果的驗(yàn)證 用最優(yōu)的pH、溶氧和攪拌轉(zhuǎn)速在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)Vero細(xì)胞，細(xì)胞最大濃度為4.5×106cells/mL，較優(yōu)化前的3.5×106cells/mL提高了0.28倍，為預(yù)測(cè)值的98.79%，符合度較高。

3 討論

哺乳動(dòng)物細(xì)胞無(wú)血清全懸浮培養(yǎng)技術(shù)經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展已日趨成熟，該技術(shù)具有較為顯著的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，是當(dāng)前臨床生物制品生產(chǎn)的主要技術(shù)工藝[12]。目前，已使用微載體在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)Vero細(xì)胞生產(chǎn)部分病毒性疫苗[13-17]。而采用Vero全懸浮細(xì)胞生產(chǎn)的疫苗在國(guó)內(nèi)尚少見(jiàn)。

表2 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

細(xì)胞作為疫苗生產(chǎn)的基質(zhì)，其質(zhì)量直接影響疫苗的質(zhì)量和安全性。一株細(xì)胞用于生產(chǎn)前必須進(jìn)行全面的安全性評(píng)價(jià)[18]。評(píng)價(jià)的內(nèi)容包括細(xì)胞來(lái)源、傳代培養(yǎng)及馴化過(guò)程、細(xì)胞鑒別、復(fù)蘇后活力、生長(zhǎng)特征、微生物污染、外源病毒因子檢查和細(xì)胞核學(xué)檢查[19]。本研究馴化的全懸浮培養(yǎng)型Vero細(xì)胞來(lái)源清楚，有較高的復(fù)蘇活力，細(xì)胞沒(méi)有被細(xì)菌、真菌和支原體等微生物污染。外源病毒因子檢查，排除了致細(xì)胞病變的病毒、致紅細(xì)胞吸附的病毒等病毒的污染。建立的主細(xì)胞庫(kù)及工作細(xì)胞庫(kù)各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果均符合《中國(guó)獸藥典》規(guī)定，具有良好的傳代穩(wěn)定性。

生物反應(yīng)器培養(yǎng)工藝的放大是一個(gè)十分復(fù)雜的技術(shù)問(wèn)題，在放大培養(yǎng)過(guò)程中，混合和傳質(zhì)是培養(yǎng)細(xì)胞的重要因素[20]。同時(shí)，罐體越大造成的流體剪切力也會(huì)越大，影響細(xì)胞狀態(tài)，尤其是懸浮細(xì)胞[21]。因此，需要對(duì)生物反應(yīng)器的培養(yǎng)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以便獲得高密度懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞。本研究通過(guò)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)生物反應(yīng)器培養(yǎng)參數(shù)pH、溶氧和攪拌轉(zhuǎn)速進(jìn)行了優(yōu)化，經(jīng)優(yōu)化后的參數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞，增殖密度可達(dá)4.5×106cells/mL，較優(yōu)化前的3.5×106cells/mL提高了0.28倍，實(shí)現(xiàn)了Vero細(xì)胞生物反應(yīng)器高密度培養(yǎng)。

A.pH和溶氧；B.pH和攪拌轉(zhuǎn)速；C.溶氧和攪拌轉(zhuǎn)速

綜上所述，本研究通過(guò)逐步降血清和改變培養(yǎng)液的方法，獲得1株無(wú)血清全懸浮培養(yǎng)Vero細(xì)胞系，通過(guò)優(yōu)化生物反應(yīng)器培養(yǎng)參數(shù)，實(shí)現(xiàn)了在7.5 L反應(yīng)器中的高密度培養(yǎng)，為該細(xì)胞的全懸浮規(guī)模化生產(chǎn)提供了參考。