2株牛病毒性腹瀉病毒的分離鑒定

秦義嫻，陳曉春，劉 丹，孫 淼，薛青紅，吳華偉，高金源，高月異

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)屬于黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)，是有囊膜的單股正鏈RNA分子，全長約12.3 kb。基因組只含有一個開放閱讀框(ORF)，兩端為非編碼區(qū)(5′和3′UTR)，編碼1個大的多聚蛋白，在病毒蛋白酶和宿主細(xì)胞酶的作用下加工形成4種結(jié)構(gòu)蛋白(核衣殼蛋白C及3種包膜糖蛋白Erns、E1和E2)和8種非結(jié)構(gòu)蛋白。根據(jù)5′-UTR、Npro和E2基因序列可將BVDV分為BVDV-1、BVDV-2兩種基因型，BVDV-1進(jìn)一步又可分成至少22個基因亞型(1a～1v)。從我國國內(nèi)各地報(bào)道的BVDV感染情況來看，同時存在BVDV-1型和BVDV-2型，且BVDV-1型多于BVDV-2型[1]。2004年歐洲學(xué)者從巴西進(jìn)口的一批胎牛血清中分離到瘟病毒“Hobi”株，隨后又陸續(xù)從胎牛血清和細(xì)胞系中分離到類似毒株，將其歸類為BVDV-3型[2]。根據(jù)是否可在細(xì)胞上引起病變，將BVDV分為兩種生物型，分別為致細(xì)胞病變型(CP)和非致細(xì)胞病變型(NCP)，BVDV-1型、BVDV-2型和BVDV-3型均同時存在兩種生物型[3]。

目前，關(guān)于BVDV的研究主要集中在結(jié)構(gòu)蛋白，其中E2蛋白編碼區(qū)是BVDV基因組內(nèi)變異性最高的區(qū)域之一，其高變異性可影響B(tài)VDV的診斷，并可能導(dǎo)致已有疫苗的免疫失敗，因此E2蛋白成為目前研究最多的結(jié)構(gòu)蛋白。本研究對新疆、河南兩省的2頭疑似BVDV感染的牛血清樣本進(jìn)行BVDV的分離鑒定，成功分離到2株BVDV毒株，利用生物學(xué)軟件DNA Star對2個毒株的E2基因序列進(jìn)行比對及遺傳進(jìn)化分析，為該病的分子流行病學(xué)調(diào)查及防控提供了數(shù)據(jù)支持。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 樣品及細(xì)胞 樣品為新疆和河南2頭初篩為BVDV核酸陽性的牛血清，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存；MDBK細(xì)胞，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存。

1.1.2 主要試劑 RNA提取試劑盒，北京天根生物公司產(chǎn)品；KOD酶高保真PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA Marker，TaKaRa公司產(chǎn)品；DNA純化回收試劑盒，北京百泰克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；pEasy-Blunt Simple Cloning Kit，北京全式金公司產(chǎn)品；FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體，Sigma公司產(chǎn)品；BVDV-1型單克隆抗體，由中國獸醫(yī)監(jiān)察所保存。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 倒置顯微鏡、熒光顯微鏡，Nikon公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱，Memmert公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)，UVITEC公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 參照GenBank中發(fā)表的BVDV毒株基因序列(表1)，用Primer Primer5.0軟件，設(shè)計(jì)出擴(kuò)增E2基因全長的引物，上游引物BVDV-E2-F為5′-ACCAGATTGGTGGCCTTA-3′，下游引物BVDV-E2-R為5′-CAAGTTGCCCATCATCAT-3′，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司(后簡稱華大基因)合成。預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1 375 bp。

1.2.2E2基因的擴(kuò)增 按照RNA提取試劑盒說明書提取3份血清樣本的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)行E2基因的擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(20 μL)如下：2×PCR buffer for KOD Fx Neo 25 μL，dNTPs 10 μL，上、下游引物各1.5 μL，KOD Fx Neo 1 μL，cDNA 5 μL，ddH2O 6 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，52 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，共35個循環(huán)；68 ℃ 10 min，10 ℃∞。用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.3 病毒分離 將血清樣本4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上清液，接種長成良好單層的MDBK細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)120 h，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物并盲傳10代，置-40 ℃以下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 間接免疫熒光檢測 將1.2.3收獲的病毒液接種已長成良好單層的96孔MDBK細(xì)胞培養(yǎng)板，同時設(shè)立正常細(xì)胞對照，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，接種后72 h，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗2次。每孔加入100 μL 800 mL/L冷丙酮溶液，2 ℃～8 ℃固定30 min，然后棄去丙酮，自然晾干。用PBS洗滌細(xì)胞面1次，然后每孔加入用PBS 1∶1 000稀釋的BVDV-1型單克隆抗體(一抗)50 μL，37 ℃作用1 h。棄去一抗，用PBS洗2次。棄去洗液，每孔加入用PBS 1∶400稀釋的FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體(二抗)50 μL，37 ℃作用1 h。用PBS洗2次后置于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。

表1 參考毒株信息

1.2.5E2基因的克隆及序列分析 將盲傳10代的病毒液提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以KOD高保真酶進(jìn)行E2基因的擴(kuò)增，回收目的片段后與pEasy-Blunt Cloning載體連接，轉(zhuǎn)化入Top10感受態(tài)細(xì)胞，挑取菌落于2 mL LB培養(yǎng)液中37 ℃振蕩培養(yǎng)16 h，進(jìn)行PCR鑒定，取鑒定正確的菌液送華大基因測序。將測序結(jié)果去除附加序列后，用DNA Star軟件對擴(kuò)增的E2基因及GenBank中公布的參考毒株的核苷酸序列進(jìn)行比較分析，并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 E2基因擴(kuò)增結(jié)果

將2份血清樣本提取總RNA后，用BVDV E2特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，2個毒株均擴(kuò)增出1 375 bp大小的片段，與預(yù)期的目的片段大小相符(圖1)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000;1.血清樣本1；2.血清樣本2

2.2 病毒分離與間接免疫熒光結(jié)果

2份血清樣本接種MDBK細(xì)胞后盲傳10代，均未產(chǎn)生特征性細(xì)胞病變。但將盲傳10代收獲的細(xì)胞凍融物接種MDBK細(xì)胞培養(yǎng)72 h，進(jìn)行間接免疫熒光檢測，可觀察到明顯熒光(圖2)，證明成功分離到2株NCP型BVDV，分別命名為HN和XJ-2。

2.3 E2基因的遺傳進(jìn)化分析

對2株分離毒株E2基因進(jìn)行測序，結(jié)果表明，去除附加序列后，HN株、XJ-2株的E2基因序列長度均為1 119 bp，這與GenBank上公布的BVDV E2序列大小相符合。利用DNA Star軟件，將2個分離株與GenBank發(fā)表的國際參考毒株和國內(nèi)流行毒株進(jìn)行比對分析，并繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖3和圖4)。結(jié)果顯示，HN株與XJ-2株的同源性為99.9%，且2個分離株與BVDV1b亞型的JL-1株處于同一分支，同源性最高，分別為99.3%和99.4%，與同屬于BVDV1b亞型的Changchun184株同源性分別為85.8%和85.9%。而HN株與BVDV-2基因型及BVDV-3基因型毒株的同源性僅為59.2%～65.1%，XJ-2株與BVDV-2基因型及BVDV-3基因型毒株的同源性僅為59.3%～65.2%。因此，HN株和XJ-2株均屬于BVDV1b亞型。

A.HN株；B.XJ-2株；C.MDBK正常細(xì)胞對照A.Infected with HN strain;B.Infected with XJ-2 strain；C.MDBK normal cell control

3 討論

牛病毒性腹瀉自1946年在美國紐約州首次報(bào)道以來，目前已存在70余年，每年給養(yǎng)牛業(yè)造成的直接和間接經(jīng)濟(jì)損失都十分巨大。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界各國每年每頭牛損失0～552美元，平均約46.5美元，而歐洲的經(jīng)濟(jì)損失更是高達(dá)每頭牛87美元[4]。BVDV的宿主范圍廣泛，除主要感染牛外，還可引起綿羊、山羊、豬、鹿、水牛、野牛、羊駝、駱駝等多種動物的感染[5]。BVDV感染牛后，常導(dǎo)致高熱、腹瀉、妊娠母牛流產(chǎn)或胎兒畸形、口腔和消化道黏膜糜爛、壞死及血小板和白細(xì)胞減少等癥狀[6]。NCP型與CP型BVDV均能引起被感染動物的急性感染，但主要是由NCP引起[7]，且NCP BVDV能夠通過胎盤，常導(dǎo)致持續(xù)性感染(PI)牛的出生，而PI牛在整個生存周期可持續(xù)排出大量感染性病毒顆粒，是易感動物感染病毒的主要來源。此外，BVDV還可造成牛源生物制品(血清、疫苗等)的污染，是目前非禽源獸用生物疫苗外源病毒檢驗(yàn)的必檢項(xiàng)目。

圖3 2個BVDV分離毒株與參考BVDV毒株E2基因核苷酸同源性分析

圖4 BVDV E2基因核苷酸序列的遺傳進(jìn)化樹

目前，防控BVDV主要依靠疫苗免疫和清除PI動物，而研制有效的疫苗需充分考慮BVDV的遺傳多樣性。我國流行的BVDV基因亞型包括1a、1b、1c、1d、1m、1o、1p、 1q、1u、2a和2b亞型[8-10]，通常認(rèn)為BVDV1b和1m是我國的優(yōu)勢流行亞型[11]，Deng M等通過對我國19個省份92個奶牛場超過500頭牛進(jìn)行檢測，結(jié)果表明1a、1c和1m是我國的優(yōu)勢亞型[12]。BVD疫苗包括傳統(tǒng)的滅活疫苗及新型基因工程疫苗，目前我國已獲批上市的BVD疫苗有牛病毒性腹瀉/黏膜病滅活疫苗(1型，NM01株)、牛病毒性腹瀉/黏膜病、傳染性鼻氣管炎二聯(lián)滅活疫苗(NMG株+LY株)及牛病毒性腹瀉/黏膜病、牛傳染性鼻氣管炎二聯(lián)滅活疫苗(1型，NM01株+LN01/08株)。而新型基因工程疫苗尚未獲得批準(zhǔn)文號，其研究方向主要集中在E2蛋白，一方面因?yàn)镋2蛋白含有BVDV優(yōu)勢抗原表位，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，參與調(diào)節(jié)補(bǔ)體系統(tǒng)，使其不能被先天免疫系統(tǒng)所監(jiān)視和破壞[1]，另一方面，E2蛋白能同E1蛋白一起形成E1-E2異質(zhì)二聚體，對BVDV吸附和細(xì)胞進(jìn)入起到關(guān)鍵作用[13]。已有的研究表明，根據(jù)E2基因序列可將BVDV-1b分為1b1和1b2亞型[14]，且大多數(shù)BVDV1b分離株都屬于1b1亞型，如Changchun184。本研究從河南、新疆兩地成功分離鑒定了2株BVDV1b基因亞型分離株，與BVDV JL-1株的同源性高達(dá)99%以上，但與經(jīng)典的BVDV 1b1 Changchun184株的同源性僅為85.8%～85.9%，為BVDV 1b2亞型。2株BVDV毒株的成功分離鑒定，為了解我國目前BVDV的流行現(xiàn)狀及BVDV疫苗及診斷試劑的研制提供數(shù)據(jù)支持。