豬德爾塔冠狀病毒CHN/20GXNN-1/2020分離鑒定及遺傳進(jìn)化分析

速雪麗，秦毅斌，陸 穎，杜 琛，趙 武，何 穎，陳 櫻，韋祖樟，黃偉堅(jiān)，歐陽康*

(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/廣西高校動(dòng)物疫病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西南寧 530005；2．廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，廣西南寧 530005；3．廣西壯族自治區(qū)獸用生物制品工程研究中心，廣西南寧 530005；4．廣西畜禽繁育與疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530005)

豬德爾塔冠狀病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)是一種新興的豬腸道病毒，其感染哺乳仔豬后的臨床癥狀與其他腹瀉類病毒相似，主要表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐、脫水和死亡[1-2]。PDCoV是冠狀病毒科(Coronaviridae)、δ冠狀病毒屬(Deltacoronavirus)的成員，基因組大小約25.4 kb[3]。除了3′端的poly(A)尾外，主要編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白，即纖突(spike，S)蛋白、小膜(envelope，E)蛋白、膜(membrane，M)蛋白和核衣殼(nucleocapsid，N)蛋白，以及3種非結(jié)構(gòu)蛋白NS6、NS7和NS7a[2]。其中，S蛋白含有1 159個(gè)或1 160個(gè)氨基酸殘基，主要參與宿主細(xì)胞吸附和融合[4]，同時(shí)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，具有高度的免疫原性[5]。PDCoV最早于2012年被香港大學(xué)的Woo P C等[6]在臨床樣品中發(fā)現(xiàn)，但直到2014年在美國暴發(fā)后才開始受到關(guān)注[7]。隨后，PDCoV不僅在韓國、加拿大、日本、越南和泰國等地相繼暴發(fā)，中國內(nèi)陸也多次報(bào)道了PDCoV疫情[8-9]。PDCoV可以有效感染不同來源的動(dòng)物細(xì)胞[10]，但只在豬腎小管上皮細(xì)胞(LLC-PK細(xì)胞)和豬睪丸細(xì)胞(ST細(xì)胞)上具有良好的病毒感染和連續(xù)傳代效果，當(dāng)培養(yǎng)基補(bǔ)充適宜濃度的外源胰蛋白酶時(shí)，PDCoV增殖能力顯著增強(qiáng)[9,11-21]。此外，PDCoV還可以感染牛犢、雛雞、雛鳥等動(dòng)物并使其發(fā)生腹瀉，PDCoV表現(xiàn)出了跨物種傳播的能力[13]。近年來，廣西地區(qū)不斷出現(xiàn)PDCoV疫情，新生仔豬的感染率較高，但對(duì)PDCoV的相關(guān)研究較少。本研究對(duì)廣西地區(qū)20份PDCoV陽性樣品進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)，通過細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)、RT-PCR/RT-qPCR鑒定、間接免疫熒光試驗(yàn)(indirect immunofluorescent assay，IFA)、TCID50測(cè)定及S基因進(jìn)行克隆測(cè)序分析等方法將分離病毒鑒定為PDCoV，為進(jìn)一步開展PDCoV生物學(xué)特性研究、致病性研究和疫苗研制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、病毒及抗體 LLC-PK細(xì)胞和PDCoV毒株CHN/GX/1468B/2017，由廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所提供并保存于廣西大學(xué)動(dòng)物傳染病與分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室。PDCoV-N蛋白多克隆抗體按常規(guī)方法制備，并由廣西大學(xué)動(dòng)物傳染病與分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 DMEM(高糖)培養(yǎng)基、胎牛血清，康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司產(chǎn)品；磷酸鹽緩沖液(DPBS)，博士德公司產(chǎn)品；AxyPrepTM Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Mix，AxyPrep公司產(chǎn)品；2.5 mg/mL胰酶，Sigma公司產(chǎn)品；雙抗(青霉素-鏈霉素混合液)，BI公司產(chǎn)品；DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000、pMD18-T載體、dNTP mix，寶日醫(yī)生物(北京)有限公司產(chǎn)品；2×TaqMaster Mix，諾唯贊生物科技股份有限公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒和質(zhì)粒小量抽提試劑盒，Omega公司產(chǎn)品；大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，廣西南寧康維生物科技有限公司產(chǎn)品；ProteinFind Goat anti-Rabbit IgG(H+L)，上海百賽生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 PCR儀，ProFlex公司產(chǎn)品；LightCycler 96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，Roche公司產(chǎn)品；微量移液槍，Eppendorf公司產(chǎn)品；生物安全柜，海爾公司產(chǎn)品；數(shù)顯恒溫水浴鍋，HH-2公司產(chǎn)品；二氧化碳培養(yǎng)箱，Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)，AIR TECH公司產(chǎn)品等。

1.1.4 引物 PDCoV的檢測(cè)引物參考Zhou X等[14]，即PDCoV-MF(5′-GGCAAATTATTGTTTTCATTGCGATCATATGGGCGC-3′)和PDCoV-MR(5′-CTTATACAGGCGAGCGTCACCGGCCTTTGAAG-3′)；S基因的擴(kuò)增引物均參考Sun W等[8]，S全基因分為S1和S2進(jìn)行擴(kuò)增；即PDCoV-S1F(5′-ATGCAGAGAGCTCTATTGATTATGAC-3′)和PDCoV-S1R(5′-AACTTGCAAGTACTCCGTCTGAACG-3′)，PDCoV-S2F(5′-ATTTTCTCTTTCCGTTCAGACGGAG-3′)和PDCoV-S2R(5′-CTACCATTCCTTAAACTTAAAGGACG-3′)。PEDV、TGEV、PRoV檢測(cè)引物參考先前研究[15]。參考PDCoV毒株CH/GX/1468B/2017(MN025260)N基因設(shè)計(jì)熒光定量PCR檢測(cè)引物，即qPCR-NF(5′-AACCTCATGTTGCCAAACGC-3′)和qPCR-NR(5′-GCGTTGAAGGGGTCAACTCT-3′)，目的片段大小為112 bp。引物均由杰李生物(上海)技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 臨床樣品 從廣西多個(gè)集約化養(yǎng)豬場(chǎng)收集了腹瀉仔豬的腸道內(nèi)容物20份，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)，腸內(nèi)容物均為PDCoV陽性。用含200 mL/L甘油和1 000 U/mL青鏈霉素的已滅菌PBS對(duì)腸內(nèi)容物進(jìn)行5倍稀釋，振蕩混勻，然后在4 ℃、3 000 r/min下離心5 min，并用0.22 μm無菌過濾器過濾上清液并儲(chǔ)存于-80 ℃。

1.2.2 病毒分離與傳代 鋪滿90% LLC-PK細(xì)胞單層的6孔培養(yǎng)板接種500 μL過濾后的接種物，在37 ℃下吸附2 h后，棄液，然后補(bǔ)充含5 μg/mL胰蛋白酶的維持培養(yǎng)基。細(xì)胞在37 ℃下連續(xù)培養(yǎng)，直到觀察到CPE。當(dāng)CPE大于80%時(shí)，在-80 ℃反復(fù)凍融后收集病毒上清液并儲(chǔ)存以備后續(xù)傳代。按照上述方法將病毒連續(xù)盲傳20代。

1.2.3 RT-PCR/RT-qPCR檢測(cè) 分別提取第1、5、10、15、20代病毒的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用PDCoV、PEDV、TGEV、PRoV的檢測(cè)引物對(duì)第10代病毒進(jìn)行PCR檢測(cè)，PCR反應(yīng)體系為12.5 μL，參考文獻(xiàn)[14,16]的方法，對(duì)分離病毒進(jìn)行初步鑒定。用PDCoV熒光定量PCR檢測(cè)引物分別測(cè)定第1、5、10、15、20代病毒的病毒載量，熒光定量PCR反應(yīng)體系為12.5 μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，65 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s熔解；37 ℃ 30 s冷卻。

1.2.4 IFA試驗(yàn) 將第10代病毒以MOI=0.1接種LLC-PK細(xì)胞，當(dāng)開始出現(xiàn)明顯CPE時(shí)先用預(yù)冷的甲醇在-20 ℃固定15 min，然后用10 mg/mL BSA在37 ℃下封閉1 h，再與稀釋50倍的PDCoV N蛋白多克隆抗體在4 ℃作用12 h，最后與稀釋500倍的山羊抗兔IgG在37 ℃避光作用1 h，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.5 病毒滴度測(cè)定 根據(jù)Zhao Y等[9]描述的方法，分別對(duì)第1、5、10、15、20代病毒進(jìn)行TCID50測(cè)定。當(dāng)96孔培養(yǎng)板的單層LLC-PK細(xì)胞鋪滿至100%后，用含5 μg/mL胰蛋白酶的培養(yǎng)基將病毒稀釋為10-1～10-10共11個(gè)稀釋梯度，每個(gè)稀釋梯度接種8個(gè)孔，每孔接種100 μL，并設(shè)置陰性對(duì)照。然后在37 ℃下連續(xù)培養(yǎng)并每日觀察CPE。當(dāng)觀察到第4天時(shí)，按照Reed&Muench[9]的方法計(jì)算病毒TCID50。

1.2.6 S基因的擴(kuò)增及序列分析 對(duì)第10代病毒的S1基因、S2基因進(jìn)行基因克隆，方法參照文獻(xiàn)[8]，將成功構(gòu)建的pMD18-T-S1、pMD18-T-S2重組質(zhì)粒送至深圳華大基因生物公司進(jìn)行序列測(cè)定。將獲得的S基因全序列分別與GenBank 110株國內(nèi)外參考毒株進(jìn)行序列比較和遺傳進(jìn)化分析，其中88株參考毒株參考先前研究[15]，剩余參考毒株為近5年國內(nèi)外流行毒株(表1)。使用DNA Star Lasergene Version 7中的MegAlign軟件的“W”算法對(duì)序列進(jìn)行同源性分析，用MEGA6.0軟件中的“M”算法對(duì)序列進(jìn)行序列比對(duì)，再使用“Neighbor-joining”方法以Bootstrap值為1 000個(gè)重復(fù)的方法構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，最后使用進(jìn)化樹美化軟件iTOL(https://itol.embl.de/)制圖。

表1 參考毒株信息

2 結(jié)果

2.1 病毒分離結(jié)果

第2代病毒接種LLC-PK細(xì)胞60 h后開始出現(xiàn)CPE，第4代病毒接種LLC-PK細(xì)胞36 h內(nèi)可觀察到細(xì)胞變圓、聚集并最終脫落的典型CPE(圖1B)；正常LLC-PK細(xì)胞狀態(tài)良好(圖1A)。結(jié)果表明，本研究從疑似PDCoV樣品中成功分離得到1株病毒，并將其命名為CHN/20GXNN-1/2020。

2.2 分離毒株RT-PCR鑒定結(jié)果

對(duì)10代病毒分別用PDCoV、PEDV、TGEV、PoRV的引物進(jìn)行RT-PCR鑒定。結(jié)果顯示，在檢測(cè)的腸道病毒中只有PDCoV為陽性，其PCR產(chǎn)物條帶大小與陽性對(duì)照基本一致，符合預(yù)期結(jié)果，而PEDV、TGEV、PoRV這3種常見的腸道病毒均為陰性(圖2)。該結(jié)果初步表明，本研究分離的病毒為PDCoV。

A.陰性對(duì)照；B.CHN/20GXNN-1/2020接種LLC-PK細(xì)胞36 h的細(xì)胞病變

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.陽性對(duì)照;2.第10代毒株;3.PEDV;4.TGEV;5.PoRV;6.陰性對(duì)照

2.3 分離毒株間接免疫熒光鑒定

第10代病毒樣品接種LLC-PK細(xì)胞24 h后可以觀察到明顯CPE，IFA試驗(yàn)結(jié)果顯示，在產(chǎn)生CPE的部位可明顯觀察到針對(duì)PDCoV N蛋白的特異性熒光(圖3A)，而陰性對(duì)照無特異性熒光(圖3C)，結(jié)果表明分離病毒為PDCoV。

2.4 病毒滴度測(cè)定

為進(jìn)一步研究PDCoV在LLC-PK細(xì)胞中的生長(zhǎng)特點(diǎn)，每5代進(jìn)行一次TCID50和RT-qPCR測(cè)定，持續(xù)到第20代(表2)。結(jié)果顯示，PDCoV毒株CHN/20GXNN-1/2020可以在LLC-PK細(xì)胞上產(chǎn)生穩(wěn)定病變，第5代與第1代相比，病毒滴度增加了約8 000倍，病毒載量增加了約20倍。在后續(xù)的傳代培養(yǎng)中病毒滴度略有增加，病毒載量呈2倍～5倍的增加并保持相對(duì)穩(wěn)定。結(jié)果表明，PDCoV毒株CHN/20GXNN-1/2020在LLC-PK細(xì)胞中可以增殖，該細(xì)胞系適用于PDCoV分離和增殖。

A、B.PDCoV毒株CHN/20GXNN-1/2020接種LLC-PK細(xì)胞；C、D.陰性對(duì)照

表2 CHN/20GXNN-1/2020毒株低代次到高代次的復(fù)制情況

2.5 分離毒株S基因擴(kuò)增

取第10代病毒進(jìn)行S1和S2基因的擴(kuò)增。結(jié)果顯示， S1基因(圖4A)和S2基因(圖4B)PCR產(chǎn)物條帶大小均與預(yù)期的條帶大小相符。最終獲得S基因全長(zhǎng)序列3 480 bp(登錄號(hào)：OL441343)，進(jìn)一步將分離毒株鑒定為PDCoV。

將PDCoV毒株CHN/20GXNN-1/2020的S基因與最早報(bào)道的香港PDCoV毒株CHN/HKU15-44/2009毒株進(jìn)行序列對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，S基因存在3 bp的缺失(153 bp-155 bp)，這與多數(shù)中國參考毒株相似。此外，S基因氨基酸存在23處突變，其中H46Y、D228G、I432V、T550I和T1 036P這5處氨基酸突變是PDCoV毒株CHN/20GXNN-1/2020獨(dú)有的突變位點(diǎn)。同源性分析結(jié)果顯示，S基因核苷酸和氨基酸同源性分別為96.4%～98.6%和95.7%～99.0%，同源性最高的是CHN/SC/2015毒株。結(jié)果表明，與國內(nèi)外PDCoV流行毒株相比，PDCoV毒株CHN/20GXNN-1/2020與中國多數(shù)PDCoV流行毒株的同源性更高。

A.S1基因；B.S2基因；M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;第10代樣品

表3 PDCoV毒株CHN/20GXNN-1/2020與參考毒株的同源性

2.6 分離毒株S基因遺傳進(jìn)化樹分析

基于PDCoV毒株CHN/20GXNN-1/2020 S基因的全長(zhǎng)序列構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(圖5)。S基因遺傳進(jìn)化樹顯示，PDCoV毒株CHN/20GXNN-1/2020與四川PDCoV毒株、PDCoV毒株CHN/HN-17/2017和PDCoV毒株CHN/HG/2017等在同一分支，這些毒株的S基因在153 bp～155 bp都存在3 bp的缺失。結(jié)果表明，與東南亞、美國、日本和韓國的PDCoV流行毒株相比，PDCoV毒株CHN/20GXNN-1/2020與中國絕大多數(shù)PDCoV流行毒株有更密切的親緣關(guān)系。

●代表本研究分離毒株

3 討論

冠狀病毒(Coronaviruses，CoVs)可以分為4個(gè)屬(α、β、γ和δ)，宿主范圍比較廣泛，包括人、禽和哺乳動(dòng)物，可導(dǎo)致宿主發(fā)生急性或慢性呼吸道、腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等相關(guān)疾病，致病率和死亡率較高[17]。PDCoV作為δ冠狀病毒屬主要成員，可感染禽類和哺乳動(dòng)物，其感染哺乳仔豬后的主要臨床特征表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐和脫水等，與其他豬腸道冠狀病毒的臨床癥狀極為相似，無法在臨床上進(jìn)行區(qū)分，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[18-19]。此外，PDCoV常與其他腹瀉類病原發(fā)生混合感染，導(dǎo)致仔豬的致病率和死亡率增加。目前，對(duì)該病尚無疫苗產(chǎn)品，需要對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步研究。

目前，實(shí)驗(yàn)室利用LLC-PK細(xì)胞、PK-15細(xì)胞及ST細(xì)胞成功分離出了PDCoV[16,20-23]，但病毒分離成功率非常低。病毒分離一般會(huì)被細(xì)胞種類、樣品的類型、樣品中的其他物質(zhì)及培養(yǎng)基額外添加物等因素所影響[24]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，樣品質(zhì)量是PDCoV成功分離的關(guān)鍵因素，如可能包含未知病毒其他病原體、病毒含量極少或樣品保存不當(dāng)?shù)龋@些都是限制分離毒株重要因素[12,25]。外源性胰蛋白酶可以增強(qiáng)S蛋白的蛋白水解裂解作用以促進(jìn)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，因此，添加胰蛋白酶可以促進(jìn)冠狀病毒感染細(xì)胞[26]，在病毒分離過程中添加適宜濃度的胰蛋白酶可以有效提高PDCoV分離的成功率[27]。在本研究中，通過添加5 μg/mL胰蛋白酶中對(duì)疑似PDCoV的臨床腹瀉樣品進(jìn)行病毒分離，最終成功分離鑒定出1株新的PDCoV，該毒株病毒滴度及病毒載量在傳代培養(yǎng)中可逐漸的增高。

冠狀病毒S蛋白的突變影響冠狀病毒致病機(jī)制和宿主嗜性[28]。本研究所獲得的PDCoV毒株CHN/20GXNN-1/2020 S基因序列分析顯示存在3 bp(153 bp-155 bp)缺失，而我們前期獲得的廣西分離PDCoV毒株CHN/GX/1468B/2017 S基因卻不存在這種缺失[15]，這表明在廣西地區(qū)至少流行兩種類型的PDCoV毒株。目前，這種S基因缺失現(xiàn)象一般在中國分離毒株中較為多見，但在美國、日本、韓國或東南亞的分離毒株中卻很少出現(xiàn)，這可能與PDCoV毒株的流行區(qū)域特點(diǎn)密切相關(guān)，但這需要更多的分子流行病學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行論證。S基因的差異可能導(dǎo)致PDCoV毒株毒力的差異，但這種特定的缺失是否有利于病毒的復(fù)制和增強(qiáng)病毒毒力還難以定論。PDCoV的中和抗體區(qū)域主要位于S蛋白上，S蛋白中主要中和抗體的區(qū)域?yàn)镃TD區(qū)域(aa 278-616)，目前已經(jīng)鑒定過的中和抗體區(qū)域?yàn)镃OE區(qū)域(aa499-638)[17,26]。PDCoV毒株CHN/20GXNN-1/2020 S基因氨基酸有4處突變位于CTD區(qū)域，這些突變可能影響該區(qū)域中和抗體的功能，但還有待進(jìn)一步研究。S基因的遺傳進(jìn)化樹顯示，PDCoV毒株CHN/20GXNN-1/2020主要與四川PDCoV流行毒株、PDCoV毒株CHN/HN-17/2017和PDCoV毒株CHN/HG/2017等中國毒株處于同一進(jìn)化分支，與東南亞、美國、日韓毒株處于不同的進(jìn)化枝，表明病毒的流行在地域上存在差異性。這種差異與PDCoV結(jié)構(gòu)基因在進(jìn)化和傳播過程發(fā)生的突變密切相關(guān)，從而導(dǎo)致這些毒株的親緣關(guān)系發(fā)生變化。此外，PDCoV毒株CHN/20GXNN-1/2020與廣西地區(qū)多數(shù)流行毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，說明廣西地區(qū)的流行毒株有不同的來源，這與廣西所處的地理位置有關(guān)。本研究確認(rèn)了廣西豬群存在PDCoV感染并成功分離出1株新的PDCoV，為進(jìn)一步開展PDCoV生物學(xué)特性研究、致病性研究和疫苗研制奠定了良好基礎(chǔ)。