基于matK+rbcL+trnH-psbA 聯(lián)合分析法對罌粟屬的植物鑒定

范豫杰 ，黃 磊 ，蘇世達 ，蘇少明

（1）云南省刑事科學技術(shù)重點實驗室，云南 昆明 650221;2）昆明市公安局刑事科學技術(shù)研究所，云南 昆明 650506）

罌粟科全世界約有38 屬700 余種，我國有18 屬362 種，主要分布于我國的西南部和西北部[1-2]。紫堇屬、綠絨蒿屬、花菱草屬與罌粟屬同屬于罌粟科，是近親關(guān)系的植物。罌粟屬中的不同種植物，又以虞美人（Papaver rhoeas.L）與罌粟最為相似。虞美人因其花朵鮮艷，有很高的觀賞價值，被作為園林景觀植物材料廣泛應(yīng)用[1,3]。

罌粟（Papaver somniferum.L）是“非法種植罌粟原植物罪”犯罪構(gòu)成中的核心要件，明確種植對象是罌粟對定罪量刑十分重要。目前，罌粟的檢驗鑒定主要依據(jù)形態(tài)學，區(qū)別于傳統(tǒng)主要依靠形態(tài)學的罌粟原植株鑒定方法，DNA 條形碼技術(shù)不受個體形態(tài)、發(fā)育階段的影響，通用性強、準確性高。DNA 條形碼技術(shù)（DNA barcoding）是利用生物基因組中普遍存在的一段較短的、標準的DNA 序列作為分子標記，通過參考數(shù)據(jù)庫同源比對，以及物種進化樹來確定物種間的親緣關(guān)系[4]。

因為罌粟被管制的特殊性，罌粟條形碼DNA研究比較少，大多數(shù)研究直接使用Genbank 中的數(shù)據(jù)來篩選DNA 條形碼[5]。由于Genbank 中數(shù)據(jù)來源的不確定，缺乏標準的鑒定規(guī)范，以及大量進口的特殊虞美人品種，都為罌粟檢驗鑒定的具體司法實踐帶來了諸多實際困難。罌粟的DNA 鑒定仍有巨大的研究空間，目前市面上也沒有成熟可靠的罌粟DNA 試劑盒可供選擇。本研究以5 種不同亞種的虞美人作為種內(nèi)比對研究對象，將花菱草屬的加州虞美人（花菱草）作為種間比對對象，從葉綠體基因序列psbA-trnH、matK 和rbcL 以及核糖體基因序列ITS 著手，擬探索一種可行的鑒定方法，為今后罌粟鑒定的規(guī)范作探索。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

從安徽宿州植物培育基地、中國科學院武漢植物園、廣州進口花卉園藝培植基地、成都花卉園藝培育基地處獲得加州虞美人（Eschscholtzia californica Cham）、東方虞美人（Papaver Oriental.L）、沙地虞美人（Papaver ammophilum）、阿爾卑斯虞美人（Papaver alpinum）、塞浦路斯虞美人（Papaver cyprium）、冰島虞美人（Papaver nudicaule）。從昆明市公安局禁毒支隊處獲得云南本土罌粟和新疆地區(qū)罌粟（Papaver somniferum.L）植株和種子，見表1。

表1 供試樣本編號與分組Tab.1 Serial numbers of laboratory samples and section

1.2 實驗方法與步驟

1.2.1 DNA 的提取從上述8 種植物每種植株取其新鮮葉片，按植物種類混合，每種植物各取20 mg 干燥樣本，加入液氮充分研磨，采用TSINGKE 植物DNA 提取試劑盒（普通版）提取植物DNA。

1.2.2 引物的來源在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中查找到相關(guān)序列，并用NCBI primerblast（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）和Premier.5 軟件設(shè)計出引物，見表2。

表2 擴增引物序列的設(shè)計Tab.2 The sequences of primer for amplification

1.2.3 PCR 擴增反應(yīng)體系為50 μL 體系，Easy Taq Super Mix：45 μL，正向引 物：2 μL（濃 度10 μmol/L），反向引物：2 μL（濃度10 μmol/L），DNA 模板：1 μL。PCR 擴增條件：預(yù)變性：98 ℃，2 min；35 個循環(huán)（變性：98 ℃，10 s；引物退火：56 ℃，10 s；延伸：72 ℃，10 s）；終延伸：72 ℃，5 min；4 ℃延長保存。

1.2.4 測序分析用1%瓊脂糖凝膠進行PCR 擴增產(chǎn)物電泳驗證，對擴增產(chǎn)物委托擎科生物公司進行雙向測序并對結(jié)果進行分析。通過Sequencing Analysis 5.2 分析峰圖數(shù)據(jù)，最后判定數(shù)據(jù)是否可用，如果可用，結(jié)果保存為abi 格式和seq 格式。

1.2.5 測序結(jié)果處理測序良好的結(jié)果用ContigExpress 軟件進行拼接，去除引物區(qū)域和低質(zhì)量區(qū)域。使用MEGA X 計算K2P（Kimura 2-parameter）遺傳距離，包括計算序列總體平均遺傳距離（Average overall mean），種間平均遺傳距離（Average between group distances）和種內(nèi)平均遺傳距離（Average within group distances）。使用MEGA X 構(gòu)建N-J 發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 擴增結(jié)果

使 用ITS2、ITS4、ITS5、rbcL、psbA-trnH、matK6 種引物序列對8 種植物樣本DNA 進行擴增，冰島虞美人（PNU）在ITS2、ITS4、ITS5 基因序列上均未獲得產(chǎn)物。塞浦路斯虞美人（PCY）在rbcL和psbA-trnH 2 個基因序列上均未獲得產(chǎn)物，見圖1。

圖1 ITS2、ITS4、ITS5、rbcL、psbA-trnH、matK 序列擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of ITS2ITS4ITS5 bcLpsbA-trnHmatK gene sequence amplification products

2.2 測序結(jié)果及信息位點評估

2.2.1 對ITS 序列的評估ITS 是rDNA 中介于18S 和5.8S 之間（ITS1），以及5.8S 和26S 之間（ITS2）的非編碼轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，由于ITS1、ITS2 序列的進化速率快，常被用于植物種屬內(nèi)和種間親緣關(guān)系的鑒定。本研究針對ITS4 和ITS5 重新設(shè)計的引物進行擴增測序。ITS4 和ITS5 的堿基序列長度大約是ITS2 的2 倍，堿基序列基本覆蓋ITS2。測序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)ITS2、ITS4、ITS5 在東方虞美人（POL）、沙地虞美人（PAM）、塞浦路斯虞美人（PCY）樣本中出現(xiàn)了雙峰現(xiàn)象，見圖3。考慮到本研究存在多個植株樣本混合取樣的情況，故采取了單株植物單獨取樣進行驗證，同時對引物和擴增產(chǎn)物采取了PAGE 膠純化，結(jié)果顯示ITS 序列仍然存在雙峰的現(xiàn)象，排除了污染的可能性?？紤]到本實驗測序采取雙向測序，從峰形上看，以單峰為主，單峰和雙峰混合出現(xiàn)，考慮為DNA 單鏈上存在堿基的缺失造成測序結(jié)果移碼出現(xiàn)雙峰、套峰，與ITS 序列本身變異有關(guān)。ITS 序列雖然容易產(chǎn)生變異，適合作為物種鑒定的后選基因序列，但同時變異也意味著存在大量的堿基突變和堿基缺失，堿基的突變和缺失容易給罌粟鑒定帶來困難。

2.2.2 測序結(jié)果入庫比對因東方虞美人（POL）、沙地虞美人（PAM）、塞浦路斯虞美人（PCY）的ITS4、ITS5 測序結(jié)果中存在雙峰和套峰的情況，為保證入庫比對準確性，表3 中僅展示了罌粟（PSL）、阿爾卑斯虞美人（PAL）的ITS4、ITS5 測序后入庫比對的結(jié)果。表3 中還選取了測序成功率最高的葉綠體matK 測序結(jié)果入庫進行比對。將ITS、matK 序列測序數(shù)據(jù)去除測序結(jié)果兩端信號弱或重疊峰區(qū)域，用ContigExpress 進行拼接，拼接結(jié)果在NCBI 里使用BLAST Analysis 功能進行比對校驗，查看其與數(shù)據(jù)庫里基因組測序結(jié)果之間的相似匹配情況，見表3。

表3 罌粟屬植物的BLAST 比對結(jié)果Tab.3 BLAST comparison results of Papaver somniferum and its adulterants

2.2.3 遺傳距離分析和構(gòu)建發(fā)育樹理想的DNA條形碼，種內(nèi)距離應(yīng)明顯小于種間距離。考慮到ITS2、ITS4、ITS5 兩個基因序列存在雙峰情況（圖3），冰島虞美人（PNU）在ITS 序列上出現(xiàn)擴增缺失，為保證遺傳距離對計算分析準確性，本研究僅利用葉綠體基因進行發(fā)育樹構(gòu)建，而放棄利用ITS 的相關(guān)操作。

首先，本研究從Genbank 中下載了罌粟（Papaver somniferum.L，編號DQ912880）、冰島虞美人（Papaver nudicaule，編號KF022360）、東方虞美人（Papaver Oriental.L，編號MH711392）、加州虞美人（Eschscholzia californica，編號Mk281585）的葉綠體psbA-trnH、matK 和rbcL 基因序列數(shù)據(jù)，通過3 個基因序列psbA-trnH+matK+rbcL 聯(lián)合分析，使用MEGA.X 軟件計算種內(nèi)、種間遺傳距離，并構(gòu)建N-J 系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。根據(jù)psbAtrnH+matK+rbcL 聯(lián)合分析顯示種內(nèi)平均遺傳距離明顯小于種間平均遺傳距離（圖4），以及N-J系統(tǒng)發(fā)育樹對物種的區(qū)分度，表明psbA-trnH +matK+rbcL 聯(lián)合分析方法有效。

圖3 Genbank 中下載的數(shù)據(jù)進行psbA-trnH+matK+rbcL 聯(lián)合分析構(gòu)建N-J 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The data downloaded from Genbank were analyzed by PSBA-TRNH +matK+rbcL to construct the N-J phylogenetic tree

圖4 樣本rbcL、psbA-trnH、matK 序列種內(nèi)、種間平均遺傳距離分布圖Fig.4 The distribution of interspecific and intraspecific genetic distancebased on psbA-trnH+matK+rbcL sequences

其次，因塞浦路斯虞美人（PCY）在psbA-trnH、rbcL 兩個基因序列上出現(xiàn)擴增無產(chǎn)物的現(xiàn)象，故不對塞浦路斯虞美人（PCY）進行N-J 建樹分析。用MEGA X 軟件對罌粟（PSL）、阿爾卑斯虞美人（PAL）、東方虞美人（POL）、沙地虞美人（PAM）、冰島虞美人（PNU）、加州虞美人（ECC）使用psbAtrnH+matK+rbcL 聯(lián)合分析法構(gòu)建N-J 系統(tǒng)發(fā)育樹鄰接法分析序列矩陣所有的堿基作同等加權(quán)，空位采用缺失處理，鄰接樹上各分支的相對支持率采用bootstrap 進行1 000 次重復(fù)取樣檢驗。結(jié)果（圖5）顯示，psbA-trnH+matK+rbcL 聯(lián)合分析能夠很好地將罌粟與其他罌粟屬植物區(qū)分開來，特別是能夠?qū)enbank 中沒有數(shù)據(jù)的沙地虞美人（PAM）與其他虞美人區(qū)分開。

圖5 基于rbcL+psbA-trnH+matK 序列聯(lián)合構(gòu)建的 NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 NJ phylogenetic tree based on psbA-trnH+matK+rbcL sequences

3 討論

罌粟作為“非法種植毒品原植物罪”罪名成立的核心，能準確鑒定是否為罌粟植株對定罪量刑十分重要。如今虞美人作為觀賞花卉大量出現(xiàn)在市面上，虞美人種類繁多，且屬于罌粟科和罌粟屬植物，在植物種子和幼苗階段很難鑒別是否為罌粟。DNA 條形碼技術(shù)為罌粟鑒定提供了新的方向。但由于罌粟被列為毒品被管制的特殊性，對其相關(guān)研究不多[6-24]。

3.1 直接使用Genbank 中的數(shù)據(jù)作為鑒定標準存在鑒定風險

目前，國內(nèi)對罌粟DNA 條形碼的研究多使用從Genbank 中直接下載數(shù)據(jù)分析。如張爽等[11]是通過從Genbank 中下載我國7 個罌粟屬植物，進行數(shù)據(jù)分析后認為trnL-trnF 對國內(nèi)罌粟屬植物具有很好的區(qū)分效果。通過從數(shù)據(jù)庫中下載數(shù)據(jù)，構(gòu)建進化樹和計算遺傳距，對基因序列進行評估，來分析并篩選候選基因序列，該方法路徑理論性強。但在實際工作中，直接使用Genbank 數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)作為鑒定標準，存在很大的鑒定風險。

對未知物種進行鑒定，必須要有物種鑒定的行業(yè)標準與參照，并用標準的操作獲得穩(wěn)定的結(jié)果。本次研究中通過實驗數(shù)據(jù)入庫比對后發(fā)現(xiàn)，如表3 所示，云南罌粟和新疆罌粟的ITS 序列經(jīng)入庫比對，最佳匹配物種均有虞美人（Papaver rhoeas）。本研究中的其他虞美人樣本，ITS 序列入庫比對，出現(xiàn)了與罌粟（Papaver somniferum）100%相匹配的情況；表3 葉綠體3 個基因序列中，沙地虞美人（PAM）的matK 基因序列與罌粟（PSL）100%相匹配；在psbA-trnH、rbcL 序列中，也都出現(xiàn)了虞美人與罌粟相匹配的現(xiàn)象。這對將Genbank 中的數(shù)據(jù)直接作為金標準來進行物種鑒別造成了阻礙。同時，無論使用UPGMA（類平均法）、ME（Minimum evolution，最小進化法）、NJ（Neighbor-joining，鄰接法）或貝葉斯（Bayesian）推斷等方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的過程中，都有很多人為主觀操作的環(huán)節(jié)，如對基因的剪切與整理，使用不同軟件的算法等，都會對結(jié)果產(chǎn)生影響。

因此，從Genbank 中下載數(shù)據(jù)進行理論分析，并用于DNA 條形碼的篩選的理論研究是可行的，但將其作為認定罌粟的金標準目前還存在巨大的鑒定風險。

3.2 單獨使用ITS、psbA-trnH、rbcL、matK 序列無法區(qū)分罌粟屬內(nèi)植物

單獨使用核基因組序列和葉綠體基因組序列對罌粟屬內(nèi)植物進行區(qū)分存在很大的鑒定風險。

罌粟條形碼技術(shù)研究目前主要集中在ITS 序列，雖然ITS 核基因序列在其他中藥領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用[13-14]，但就罌粟屬內(nèi)的植物來說，單獨依靠一種基因序列進行測序后入庫比對存在很大的鑒定風險。劉瑋琦等[23]使用ITS4、ITS5 對疆罌粟屬（Roemeria）、罌粟屬（Papaver）、綠絨蒿屬（Meconopsis）、海罌粟屬（Glaucium）和薊罌粟屬（Argemone）構(gòu)建N-J 發(fā)育樹進行鑒定，顯示結(jié)果理想。但本實驗中使用ITS4、ITS5 對罌粟屬內(nèi)的罌粟和虞美人進行鑒定卻存在很多困難。一方面是東方虞美人（POL）、沙地虞美人（PAM）、塞浦路斯虞美人（PCY）在ITS4、ITS5 中存在堿基缺失的現(xiàn)象，見圖2；另一方面是冰島虞美人（PNU）使用ITS4、ITS5 引物擴增后沒有擴增產(chǎn)物。

圖2 ITS 序列上大量的堿基突變與缺失Fig.2 A large number of base mutations and deletions in ITS sequence

單獨用葉綠體psbA-trnH、rbcL、matK 候選基因序列進行遺傳距離分析和構(gòu)建N-J 發(fā)育樹也存在風險，市場上常見的塞浦路斯虞美人（PCY）在psbA-trnH、rbcL 基因序列沒有擴增產(chǎn)物。

3.3 psbA-trnH+matK+rbcL 聯(lián)合分析能夠有效將罌粟屬內(nèi)植物

本實驗采用了葉綠體基因組條形碼聯(lián)合分析方法，針對罌粟屬植物，即罌粟和市場上常見的各種虞美人開展了區(qū)分鑒定，取得了良好的效果。相關(guān)研究表明，組合條形碼的分辨率普遍高于單一條形碼，具有更高的普遍適用性[24]。本研究從Genbank 中下載了罌粟（Papaver somniferum.L）、冰島虞美 人（Papaver nudicaule）、東方虞美人（Papaver Oriental.L）、加州虞美人（Eschscholzia californica）的葉綠體基因序列數(shù)據(jù)，通過對3 個基因序列psbA-trnH+matK+rbcL 聯(lián)合分析，構(gòu)建種內(nèi)、種間N-J 系統(tǒng)發(fā)育樹，確定方法的有效性。然后將本研究中7 種植物（塞浦路斯虞美人以外）的葉綠體基因序列進行psbA-trnH+matK+rbcL 聯(lián)合分析，并構(gòu)建N-J 系統(tǒng)發(fā)育樹。經(jīng)過對2 種發(fā)育樹的比較，發(fā)現(xiàn)psbA-trnH+matK+rbcL 聯(lián)合分析能夠有效將罌粟屬內(nèi)的植物進行區(qū)分。

3.4 關(guān)于罌粟的鑒定標準的展望

《中華人民共和國刑法》中，關(guān)于“非法種植毒品原植物罪”中的罌粟，按照中國植物志中的定義，應(yīng)為罌粟（英文學名為Papaver somniferum.L）[1]。但在Genbank 中，能與Papaver somniferum.L在通用DNA 條形碼基因序列上相匹配的虞美人品種卻又有很多，這給司法實踐關(guān)于鑒定標準的問題帶來了很多的實際困難。罌粟的鑒定，其本身對定罪量刑十分關(guān)鍵，具有很強的司法實踐意義。隨著進口觀賞物種的豐富，很多國外的觀賞虞美人都含有嗎啡、可待因、罌粟堿等成分，這些植物是否需要管制，是否應(yīng)當被定義為罌粟，都需要檢驗鑒定的結(jié)論作為支撐。

本研究中發(fā)現(xiàn)，面對種類繁多復(fù)雜的虞美人品種，通過罌粟的核基因DNA 條形碼ITS 序列對罌粟屬內(nèi)的植株進行區(qū)分存在困難。單獨使用常用的葉綠體DNA 條形碼，區(qū)分效果也不佳。而使用葉綠體psbA-trnH+matK+rbcL 聯(lián)合分析能夠針對本研究中的虞美人品種進行有效區(qū)分，這可以為今后制定罌粟DNA 鑒定行業(yè)標準提供一定的理論支持。

目前，我們國家沒有自己的DNA 條形碼數(shù)據(jù)庫，很多研究都是將自己的測序結(jié)果錄入國外數(shù)據(jù)庫進行比較，得出相應(yīng)的結(jié)論。建立我們國家的罌粟DNA 數(shù)據(jù)庫和罌粟DNA 鑒定行業(yè)標準勢在必行。只有從罌粟的概念、DNA 數(shù)據(jù)等方面建立行業(yè)標準和規(guī)范，方能為推進我們國家對“非法種植毒品原植物罪”的司法實踐提供有效遵循。