結(jié)球甘藍(lán)抽薹過(guò)程中抗氧化系統(tǒng)及蛋白質(zhì)含量的變化

王神云，余方偉，張 偉，于 利，李建斌

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所，南京 210014)

結(jié)球甘藍(lán)(BrassicaoleraceaL var.capitata. L.，簡(jiǎn)稱甘藍(lán))俗稱包菜、圓白菜、茴子白等，是十字花科主要蔬菜作物之一，屬綠體春化作物，即一定大小的植株通過(guò)一定的低溫作用后，當(dāng)溫度和光照條件合適后誘導(dǎo)植株抽薹開(kāi)花，完成世代[1-2]。春甘藍(lán)生產(chǎn)中，經(jīng)常會(huì)發(fā)生“未熟抽薹”現(xiàn)象，嚴(yán)重影響產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量；在甘藍(lán)育種中，一些材料需促進(jìn)抽薹，才能保證收到種子；在甘藍(lán)F1代種子生產(chǎn)中，一些品種雙親需調(diào)節(jié)抽薹時(shí)間，保障兩本花期相遇，增加種子產(chǎn)量和質(zhì)量。因此，甘藍(lán)抽薹過(guò)程的調(diào)控?zé)o論在生產(chǎn)中還是育種中都尤為重要。

植物抽薹是由系列內(nèi)因和外因共同作用的過(guò)程，因此抽薹成花過(guò)程中不僅成花途徑的相關(guān)分子因子，如FLC、CO、FT、miRNA156、miRNA159等會(huì)發(fā)生表達(dá)量或結(jié)構(gòu)等的變化[3-4]，而且也會(huì)發(fā)生復(fù)雜的生理生化反應(yīng)，如系列抗氧化酶、糖、蛋白質(zhì)、激素等物質(zhì)的活性和含量的變化[5-7]。十字花科蔬菜白菜從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到盛花抽薹過(guò)程中超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)及可溶性蛋白(S-Pr)和丙二醛(MDA)含量的變化呈現(xiàn)一定的規(guī)律性，而且易抽薹和晚抽薹材料之間存在明顯的差異，表明這些生理指標(biāo)和白菜抽薹有一定的聯(lián)系[6]。十字花科蔬菜蘿卜從花芽未分化到薹高>5cm的抽薹過(guò)程中保護(hù)酶SOD、POD和CAT的活性與可溶性糖和S-Pr含量也發(fā)生趨勢(shì)性變化，說(shuō)明蘿卜抽薹過(guò)程也需要一些生理生化物質(zhì)的參與[8]。甘藍(lán)抽薹必需經(jīng)過(guò)一段低溫春化，前人研究表明甘藍(lán)通過(guò)低溫春化階段，可溶性糖、S-Pr、游離氨基酸含量積累，而淀粉和全氮含量卻顯著下降[9-10]，抗氧化系統(tǒng)酶CAT、POD和SOD的活性隨著低溫的積累也降低[11]；通過(guò)春化階段后進(jìn)入花芽分化階段，花芽分化過(guò)程蛋白質(zhì)和蔗糖含量表現(xiàn)為下降趨勢(shì)[12]；花芽分化后到現(xiàn)蕾蛋白質(zhì)和蔗糖的含量又升高[12]，因此，甘藍(lán)抽薹過(guò)程中大量的代謝物質(zhì)發(fā)生規(guī)律性變化趨勢(shì)，與抽薹有一定聯(lián)系。前期研究主要在甘藍(lán)低溫春化、花芽分化和現(xiàn)蕾這幾個(gè)時(shí)期生理生化的分析，甘藍(lán)現(xiàn)蕾到開(kāi)花還有一個(gè)花薹伸長(zhǎng)和分枝的生長(zhǎng)過(guò)程，這個(gè)階段的生理生化研究屬于空白，本試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，利用抽薹性差異明顯表型穩(wěn)定的兩份甘藍(lán)材料，研究分析甘藍(lán)通過(guò)低溫春化后到開(kāi)花抽薹過(guò)程中抗氧化系統(tǒng)的幾個(gè)酶活性、MDA和S-Pr含量變化進(jìn)行研究，以期明確甘藍(lán)抽薹發(fā)育后期抗氧化系統(tǒng)生理指標(biāo)變化規(guī)律，進(jìn)而為甘藍(lán)類蔬菜階段發(fā)育調(diào)控過(guò)程研究和人工調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為兩份高代自交系甘藍(lán)，耐抽薹甘藍(lán)CF11-1-6-4(簡(jiǎn)稱CF)和易抽薹甘藍(lán)c179-1-4(簡(jiǎn)稱c179)，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供。兩份供試材料第1批播種于9月20日，定植于10月28日；第2批播種10月10日，定植于11月21日，試驗(yàn)在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所試驗(yàn)地進(jìn)行，育苗和田間肥水管理同生產(chǎn)管理。

1.2 測(cè)定指標(biāo)及方法

于2021年3月8日、3月15日、3月22日、3月29日、4月5日和4月12日(c179始花)每隔 7 d進(jìn)行莖粗和抽薹率調(diào)查并采集樣品。莖粗用直尺測(cè)定15個(gè)植株莖最粗部位的直徑；調(diào)查已測(cè)量莖粗植株的抽薹性(薹高5 cm即為抽薹)，抽薹 率=抽薹植株數(shù)/15×100%。

精確稱取心葉數(shù)起第4片葉樣品0.3 g，放入滅菌研缽，加入3 mL磷酸緩沖液(含0.2 mmol·L-1EDTA，pH 7.8)置于冰上研磨成勻漿， 11 000g4 ℃離心25 min，上清液用于測(cè)定MDA和S-Pr含量及各種酶的活性。SOD活性采用氮藍(lán)四唑(NBT)法[13]測(cè)定。CAT活性參考Angela等的方法[14]測(cè)定。APX、G-POD活性參考朱祝軍等的方法[15]測(cè)定。MDA含量參照Cakmak等的方法[16]測(cè)定。S-Pr含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[17]測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

測(cè)定數(shù)據(jù)采用Excel 2016、SPSS 26.0軟件進(jìn)行方差分析(LSD多重比較)和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同定植時(shí)間甘藍(lán)莖粗和抽薹情況

由表1可知，定植時(shí)間的早、晚影響甘藍(lán)莖的生長(zhǎng)量，兩個(gè)材料定植早的莖均比定植晚的粗，而且易抽薹材料c179莖的生長(zhǎng)速度快于耐抽薹材料CF(表1)，c179于11月21日定植的莖的生長(zhǎng)量也快于CF于10月28日定植。兩個(gè)材料的耐抽薹性差異大，易抽薹材料c179，10月28日定植和11月21日定植，3月22日均發(fā)生現(xiàn)蕾現(xiàn)象，定植早比定植晚抽薹率高10%，3月29日抽薹率均達(dá)到100%；耐抽薹材料CF于10月28日定植后到第2年4月5日開(kāi)始抽薹，比c179晚14 d，4月12日只有25%的植株發(fā)生抽薹，抽薹率低于c179材料75%，于11月21日定植沒(méi)有發(fā)生抽薹現(xiàn)象，沒(méi)有發(fā)生抽薹現(xiàn)象的均沒(méi)有通過(guò)低溫春化，表明耐抽薹材料CF通過(guò)綠體春化對(duì)植株生長(zhǎng)量要求明顯高于易抽薹材料c179。

表1 兩個(gè)甘藍(lán)不同定植時(shí)間莖粗和抽薹率Table 1 The stem diameter and bolting rate of the two cabbage lines at different planting time

2.2 甘藍(lán)抽薹過(guò)程CAT活性變化

耐抽薹CF和易抽薹c179，從3月8日-4月12日，定植早、晚6個(gè)時(shí)間點(diǎn)CAT活性變化趨勢(shì)基本一致。兩個(gè)材料定植早的CAT變化是3月15日稍微升高，3月22日迅速升高，3月29日活性又降低，4月5日到4月12日繼續(xù)降低；兩個(gè)材料定植晚的CAT活性變化3月15日稍降低，其他時(shí)間點(diǎn)變化趨勢(shì)基本同于定植早的(圖1)。3月22日c179發(fā)生現(xiàn)蕾現(xiàn)象而CF沒(méi)有發(fā)生現(xiàn)蕾現(xiàn)象，但兩個(gè)材料的CAT活性在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)都迅速升高，而且它們定植早、晚沒(méi)有同時(shí)表現(xiàn)顯著差異，而且定植早的耐抽薹CF在4月5日部分發(fā)生現(xiàn)蕾現(xiàn)象，但其CAT活性同其他變化趨勢(shì)一致，表現(xiàn)下降(表1，圖1)，4月12日c179(始花期)定植早、晚的CAT活性極顯著低于CF。甘藍(lán)通過(guò)低溫春化后現(xiàn)蕾前兩周到始花前的抽薹過(guò)程中CAT活性的變化規(guī)律表明其活性的變化與抽薹相關(guān)性不強(qiáng)，但可能與開(kāi)花有關(guān)。

CF-E、CF-L、c179-E、c179-L表示定植早、晚的耐抽薹材料CF和易抽薹材料c179；大、小寫(xiě)字母表示同一日期兩個(gè)材料定植早、晚間差異極顯著水平(P<0.01)和顯著水平(P<0.05)。 下同

2.3 甘藍(lán)抽薹過(guò)程APX活性變化

耐抽薹CF和易抽薹c179的APX活性3月8日-4月12日變化規(guī)律不一致。易抽薹材料c179定植早、晚的APX活性變化規(guī)律稍有不同，定植早的APX活性3月8日到3月15日緩慢上升，3月22日下降到低于3月8日，3月29日又緩慢上升，隨后開(kāi)始下降，而定植晚的APX活性在3月29日稍有下降，但與定植早的不存在差異，但高于耐抽薹CF的活性，其他時(shí)間點(diǎn)活性變化趨勢(shì)一致(圖2)；耐抽薹CF定植早的APX活性3月8日到3月22持續(xù)上升，3月29驟然下降，后期活性緩慢下降，定植晚的APX活性變化規(guī)律基本與定植早的趨勢(shì)相似，3月8日和3月22日分別比定植早的強(qiáng)和弱(圖2)。在抽薹過(guò)程中，易抽薹c179無(wú)論定植早、晚3月15日(現(xiàn)蕾前1周)和3月29日(現(xiàn)蕾后第1周)活性強(qiáng)于耐抽薹CF，現(xiàn)蕾前1周定植早的存在顯著差異，定植晚的差異不顯著，現(xiàn)蕾后1周定植早的存在極顯著差異，定植晚的差異不顯著；3月22日(現(xiàn)蕾)和4月12日(始花)弱于CF(表1，圖2)，現(xiàn)蕾期定植早的存在顯著差異，定植晚的差異不顯著，始花期存定植早、晚存在極顯著差異。上述甘藍(lán)抽薹過(guò)程APX活性變化規(guī)律，表明APX活性可能與現(xiàn)蕾前1周、現(xiàn)蕾后第1周及始花過(guò)程有關(guān)。

圖2 甘藍(lán)抽薹過(guò)程中APX活性Fig.2 APX activities during bolting process of cabbage

2.4 甘藍(lán)抽薹過(guò)程G-POD活性變化

耐抽薹CF和易抽薹c179的G-POD活性3月8日-4月12日變化規(guī)律基本一致，3月15日先升高，3月22日除了定植早的CF的G-POD活性上升，其他均下降，3月29日除了定植早的CF的G-POD活性下降幅度大，其他均與3月22日活性相當(dāng)，4月5日G-POD活性下降，4月12日CF的G-POD活性稍有上升，而c179的仍有下降(圖3)。3月8日和3月15日(現(xiàn)蕾前2周)定植早、晚的易抽薹c179的G-POD活性極顯著高于CF，4月12日(始花)極顯著低于CF(表1，圖3)；3月22日定植早的耐抽薹材料CF的G-POD活性突然上升(部分材料現(xiàn)蕾前2周)，極顯著高于其他樣品(表1，圖3)，3月29日也極顯著高于定植晚的活性。3月8日、3月15日易抽薹材料c179和3月29日定植早的耐抽薹材料CF雖沒(méi)有現(xiàn)蕾，但通過(guò)花芽分化的材料抽薹已啟動(dòng)，因此表明G-POD活性可能與甘藍(lán)抽薹啟動(dòng)發(fā)育階段和始花相關(guān)。

圖3 甘藍(lán)抽薹過(guò)程中G-POD活性Fig.3 G-POD activities during bolting process of cabbage

2.5 甘藍(lán)抽薹過(guò)程SOD活性變化

耐抽薹CF和易抽薹c179的SOD活性3月8日-4月12日變化規(guī)律基本一致，3月15日基本不變，3月22日升高(除了定植早的CF)，3月29日驟然下降，4月5日又升高，4月12日又略有下降(圖4)。3月8日定植早的CF和c179的SOD活性比定植晚的強(qiáng)，3月15日定植早的CF和c179的SOD活性比定植晚的極顯著高約100 U·min-1·g-1；3月22日定植早的CF的SOD活性驟然下降，c179變化不大，兩個(gè)材料定植晚的SOD活性均上升；4月5日和4月12日兩個(gè)材料定植早的SOD活性比定植晚的低，存在一定差異，但定植早的CF的SOD活性略有上升，可能與材料特性有關(guān)；從3月8日到4月12日CF和c179定植早的SOD活性基本都比定植晚的強(qiáng)(圖4)，除了3月22日定植早的CF的SOD活性，上述SOD活性變化規(guī)律，表明SOD活性的變化與甘藍(lán)通過(guò)低溫春化后的抽薹過(guò)程相關(guān)不強(qiáng)，可能與材料的特性、植株的大小和生長(zhǎng)狀態(tài)有關(guān)。

圖4 甘藍(lán)抽薹過(guò)程中SOD活性Fig.4 SOD activities during bolting process of cabbage

2.6 甘藍(lán)抽薹過(guò)程丙二醛含量變化

耐抽薹CF和易抽薹c179的MDA含量3月8日-4月12日變化規(guī)律有差異，易抽薹c179，3月15日升高，3月22日下降，3月29日定植早的有上升現(xiàn)象而定植晚的持續(xù)下降，4月5日升高，4月12日定植早的急劇上升，而定植晚的略升高；耐抽薹材料CF于3月15日、4月5日和4月12日與c179變化趨勢(shì)一致，3月15日定植早、晚的含量顯著和極顯著低于c179(現(xiàn)蕾前1周)，3月22日定植早的CF(部分植株現(xiàn)蕾前1周)的MAD含量上升，與c179現(xiàn)蕾前1周變化趨勢(shì)相同(圖5)，4月5日定植早的含量極顯著低于c179(現(xiàn)蕾后第2周)，定植晚的含量不存在顯著差異，4月12日兩個(gè)材料定植早的含量極顯著高于定植晚的(圖5)。上述丙二醛含量的變化規(guī)律，表明丙二醛含量在甘藍(lán)通過(guò)低溫春化后整個(gè)抽薹過(guò)程中在現(xiàn)蕾前1周、現(xiàn)蕾后第2周可能發(fā)揮一定的作用。

圖5 甘藍(lán)抽薹過(guò)程中MDA含量Fig.5 MDA contents during bolting process of cabbage

2.7 甘藍(lán)抽薹過(guò)程可溶性蛋白含量變化

耐抽薹CF和易抽薹c179的S-Pr含量3月8日-4月12日變化規(guī)律基本一致，3月8日兩個(gè)材料定植早的含量比定植晚的極顯著偏低，3月15日兩個(gè)材料定植早的S-Pr含量升高，定植晚的下降，c179(現(xiàn)蕾前1周)的S-Pr含量高于CF，而且定植晚的含量存在極顯著差異，3月22日兩材料定植早、晚的含量都升高，3月29日到4月5日持續(xù)下降，但3月29日和4月5日c179現(xiàn)蕾后第1、2周定植晚的S-Pr含量顯著和極顯著高于CF；定植早的含量不顯著和極顯著高于CF，4月12日兩材料S-Pr含量均升高(表1，圖6)，定植早的CF含量最低，可能與部分植株進(jìn)入現(xiàn)蕾第2周時(shí)期有關(guān)。上述S-Pr含量的變化規(guī)律，表明S-Pr含量在甘藍(lán)通過(guò)低溫春化后的抽薹過(guò)程中可能在現(xiàn)蕾前1周和現(xiàn)蕾后第1、2周存在一定的關(guān)系。

圖6 甘藍(lán)抽薹過(guò)程中S-Pr含量Fig.6 S-Pr contents during bolting process of cabbage

3 討 論

甘藍(lán)抽薹是通過(guò)低溫春化頂端分生組織完成花芽分化后遇到合適的溫度和光照花薹從葉叢中伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，此階段發(fā)育不僅受內(nèi)部因素調(diào)控，而且受溫度、光照等環(huán)境因素的影響，是典型的數(shù)量性狀，受多個(gè)基因控制[18-20]，還與多種代謝物質(zhì)有關(guān)系，如蛋白質(zhì)、糖及各類內(nèi)源激素等[9-12]。甘藍(lán)春化作用的效果是花發(fā)端，而花發(fā)端不是發(fā)生在春化過(guò)程中，卻是發(fā)生在春化之后適合生長(zhǎng)的條件下。甘藍(lán)屬于綠體春化，需要植株長(zhǎng)到一定大小才能感受低溫，本研究所利用的易抽薹材料c179在11月21日定植和10月28日定植均達(dá)到了春化要求，春化結(jié)束后莖粗達(dá)到1.3 cm以上，耐抽薹材料CF莖的生長(zhǎng)量比c179小0.4 cm左右，10月28日定植后的植株部分通過(guò)低溫春化，11月21日定植完全沒(méi)有通過(guò)低溫春化，說(shuō)明不同基因型的甘藍(lán)感受低溫春化植株的大小要求不同，而且同一基因型植株?duì)I養(yǎng)體越大所需低溫積累時(shí)間相對(duì)短，與王超等[21]建立甘藍(lán)抽薹鑒定的方法研究結(jié)果一致，而且與吳國(guó)平等[2]研究結(jié)果也一致。在自然生長(zhǎng)的條件下，就甘藍(lán)春化、抽薹甚至開(kāi)花發(fā)育的進(jìn)程而言，耐抽薹和易抽薹材料是相似的，只是發(fā)育進(jìn)程時(shí)間遲早有差別，因而，不同品種與抽薹有關(guān)的生理代謝活動(dòng)可能相似，那么相關(guān)酶的活性和可溶性蛋白含量的變化也就應(yīng)該具有相同的規(guī)律，只是變化的遲早可能因發(fā)育進(jìn)程而存在差異。甘藍(lán)通過(guò)低溫春化過(guò)程抗氧化系列的保護(hù)酶，如SOD、CAT、POD等及蛋白質(zhì)、蔗糖的含量會(huì)發(fā)生趨勢(shì)變化，可作為甘藍(lán)通過(guò)前期低溫積累的生化標(biāo)記[11-12]。本研究中易抽薹材料c179不同定植時(shí)間通過(guò)春化后到始花整個(gè)抽薹過(guò)程CAT、APX和G-POD活性、MDA和S-Pr含量可能發(fā)揮了一定的作用。甘藍(lán)CAT雖然可以作為前期低溫積累的生化指標(biāo)[11]，與蘿卜相似[22]，在抽薹過(guò)程中可能與抽薹沒(méi)有直接關(guān)聯(lián)，但本研究結(jié)果表明CAT可能有助于甘藍(lán)開(kāi)花；本研究APX活性在易抽薹c179和的耐抽薹CF中的變化規(guī)律和差異表明其在甘藍(lán)現(xiàn)蕾前1周、現(xiàn)蕾后第1周和始花期發(fā)揮一定的作用；G-POD活性與甘藍(lán)現(xiàn)蕾前兩周和始花時(shí)期相關(guān)性強(qiáng)，在擬南芥和青花菜低溫春化過(guò)程中POD活性是慢慢增強(qiáng)的[23-24]，POD是細(xì)胞防御活性氧對(duì)細(xì)胞傷害的保護(hù)酶，而且POD也具有氧化分解IAA的作用，IAA在植物抽薹開(kāi)花過(guò)程中發(fā)揮重要作用[22,25-26]，本研究中G-POD可能在甘藍(lán)抽薹過(guò)程中參與激素調(diào)控，變化趨勢(shì)同十字花科蕓薹屬不結(jié)球白菜[6]；MDA在現(xiàn)蕾后第2周可能發(fā)揮一定的作用，MDA是低溫春化后的一個(gè)響應(yīng)物質(zhì)，在甘藍(lán)、蘿卜、洋蔥中都會(huì)升高[11,22,27]，本研究中甘藍(lán)現(xiàn)蕾后第1周含量下降，第2周到初花稍有上升，變化規(guī)律同不結(jié)球小白菜抽薹過(guò)程[6]，但現(xiàn)蕾第2周易抽薹和耐抽薹材料含量存在顯著和極顯著差異，可能在這個(gè)時(shí)期發(fā)揮一定作用； S-Pr在甘藍(lán)現(xiàn)蕾后第1周和第2周發(fā)揮一定的作用，表明蛋白質(zhì)可能作為物質(zhì)基礎(chǔ)促進(jìn)甘藍(lán)這2周薹長(zhǎng)高的生長(zhǎng)過(guò)程，與蘿卜抽薹過(guò)程可溶性蛋白含量變化規(guī)律相反，可能與蘿卜抽薹后營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)向塊根轉(zhuǎn)移有關(guān)[22]，白菜通過(guò)春化后到始花 S-Pr含量一直上升[6]，而本研究中甘藍(lán)現(xiàn)蕾后2周下降到始花又上升，可能不同的作物存在差異；兩個(gè)材料的SOD活性的變化在抽薹過(guò)程中變化規(guī)律基本一致，它們可能與甘藍(lán)現(xiàn)蕾前2周到始花過(guò)程關(guān)聯(lián)不大。甘藍(lán)抽薹是一個(gè)復(fù)雜的發(fā)育過(guò)程，生理生化物質(zhì)的變化可以作為抽薹過(guò)程內(nèi)因或外因調(diào)控的指示，有助于調(diào)控機(jī)理的解析而且可以為人工調(diào)控階段發(fā)育提供理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

甘藍(lán)通過(guò)低溫春化存在基因型差異，抗氧化系統(tǒng)酶CAT、APX、G-POD及MDA和S-Pr含量5個(gè)生理指標(biāo)在現(xiàn)蕾前2周到始花整個(gè)過(guò)程在一些發(fā)育時(shí)段發(fā)揮重要作用，說(shuō)明了甘藍(lán)抽薹過(guò)程的復(fù)雜性，這些生理生化物質(zhì)在甘藍(lán)抽薹過(guò)程中所起作用以及如何起作用，需要從多方面深入細(xì)致的研究。