兩種非釀酒酵母與米曲霉互作特性研究

汪繼偉，閻春悅，馬春蕾，常 煦，李志軍，陳 雄，李 欣,

（1.工業(yè)發(fā)酵省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，發(fā)酵工程教育部重點實驗室，湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北武漢 430068；2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌 443000）

白酒釀造中的酵母菌主要有釀酒酵母和產(chǎn)酯酵母等[1]，釀酒酵母主要提供酒化作用，通過無氧呼吸產(chǎn)生乙醇[2-3]；產(chǎn)酯酵母利用乙醇、糖、醛、酸和鹽類等其他代謝產(chǎn)物生成白酒中的重要呈香物質(zhì)酯類，因此產(chǎn)酯酵母是影響白酒風(fēng)味的重要菌種，利用產(chǎn)酯酵母可提高白酒揮發(fā)性香味物質(zhì)含量[4-6]。產(chǎn)酯酵母類群較多，目前在在釀造行業(yè)中應(yīng)用的有數(shù)十種，研究較多的產(chǎn)酯酵母有東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）和扣囊復(fù)膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）等[7-10]。Ma等[11]對釀酒酵母、扣囊復(fù)膜酵母和乳酸菌的不同組合的研究發(fā)現(xiàn)，扣囊復(fù)膜酵母具有較好的產(chǎn)α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶能力，將淀粉轉(zhuǎn)化為可溶性糖的能力優(yōu)于其他酵母菌，并對揮發(fā)性化合物的產(chǎn)生具有積極影響。生物強化接種扣囊復(fù)膜酵母和釀酒酵母用于小曲酒發(fā)酵，乙醇和酯含量分別提高了42.5%和11.8%，醛酮和雜環(huán)化合物含量分別降低了73.7%和77.1%[12]。東方伊薩酵母是白云邊發(fā)酵過程中的優(yōu)勢酵母之一，將該酵母菌用于強化曲制備可使正丙醇含量降低27.4%，出酒率提高22.9%[13]。白酒發(fā)酵中費比恩塞伯林德納氏酵母（Cyberlindnera fabianii）作為優(yōu)勢菌株被發(fā)現(xiàn)[14-15]，但目前對其的研究還較少，該酵母具有一定的產(chǎn)香、產(chǎn)酯能力，同時液態(tài)培養(yǎng)具有較好的產(chǎn)乙酸乙酯能力[16]。葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae）是一種產(chǎn)酯酵母，在酒類和調(diào)味品釀造工業(yè)中應(yīng)用廣泛[17]，黎源等[18]研究發(fā)現(xiàn)其在優(yōu)化條件下最高可達到3.56 g/L的產(chǎn)酯量。使用C. lusitaniae對大曲強化，己酸乙酯含量顯著增加，在發(fā)酵后期，強化大曲的酯含量高于未強化的大曲[19]。C. lusitaniae可以產(chǎn)生許多對高品質(zhì)白酒至關(guān)重要的風(fēng)味化合物，在改善白酒風(fēng)味和品質(zhì)方面具有潛在的應(yīng)用價值[20]。然而，這兩種酵母與霉菌的互作關(guān)系還不清晰。

鑒于米曲霉在白酒釀造中存在廣泛且具有強大的α-淀粉酶酶活力[21]，故選擇米曲霉作為混菌發(fā)酵過程的絲狀真菌。本文對費比恩塞伯林德納氏酵母HY-11和葡萄牙棒孢酵母HY-21兩種酵母在固態(tài)發(fā)酵條件下進行酵母菌單菌發(fā)酵和與米曲霉M-08混菌發(fā)酵研究，分析了不同體系產(chǎn)風(fēng)味、酶系和其他代謝物的特點，為提高酵母菌風(fēng)味代謝，純種產(chǎn)酯酵母菌應(yīng)用于白酒釀造提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

費比恩塞伯林德納氏酵母（Cyberlindnera fabianii）HY-11、葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae）HY-21、米曲霉（Aspergillus oryzae）M-08 均來自本實驗室保藏菌株，三株菌株來源于安琪酵母股份有限公司所提供的釀造酒曲，經(jīng)分離、純化和鑒定而獲得；酵母粉 安琪酵母股份有限公司；瓊脂粉 武漢市華順生物技術(shù)有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；α-乙酸萘酯、吡啶 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；固蘭B、α-萘酚、碘化鉀 上海麥克林生化科技有限公司；蛋白胨、葡萄糖、氫氧化鈉、Na2HPO4·12H2O、可溶性淀粉、NaH2PO4·2H2O、濃鹽酸、I2、甲酸、叔戊醇、無水硫酸鈉 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；甲醇 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；氯仿北京蘭杰柯科技有限公司；碳酸氫鈉 廣州飛揚生物工程有限公司。

S-10生物傳感器分析儀 深圳市西爾曼科技有限公司；V-1300分光光度計 上海美析儀器有限公司；804R臺式高速離心機 Eppendoff公司；HNY-211B恒溫培養(yǎng)振蕩器 天津市歐諾儀器儀表有限公司；SPX-150D型恒溫生化培養(yǎng)箱、YXQ-75S11立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；PE-28 pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；NH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；SPME Fiber Assembly Divinylbenzene/Carboxyl/Polydimethylsiloxane（DVB/CAR/PDMS）萃取頭Supelco公司；7890B氣相色譜儀、DB-WAX毛細管色譜柱（60 m×0.32 mm，0.5 μm）、DB-5毛細管色譜柱（30 m×0.23 mm，0.25 μm） 安捷倫公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料處理方法 稱取30 g高粱放置于已稱重標記的250 mL三角瓶中，加入去離子水清洗一遍后瀝干水分。再加入30 mL去離子水，包好三角瓶等待滅菌。滅菌條件為121 ℃，20 min。一次滅菌完成，冷卻至室溫后，加入10 mL去離子水，并攪拌均勻，進行第二次滅菌，滅菌完成冷卻后次日接種。每瓶培養(yǎng)基重量約為68.0±0.3 g，其含水量可控制在58.5%±0.1%。

1.2.2 種子制備 酵母菌和霉菌種子培養(yǎng)方法均采用固體斜面培養(yǎng)法，酵母菌使用YEPD瓊脂培養(yǎng)基，霉菌為PDA培養(yǎng)基。酵母菌生長時間為1 d，霉菌的培養(yǎng)時間為5 d。培養(yǎng)好的種子加入40 mL無菌水，振蕩，制成種子菌懸液。

1.2.3 發(fā)酵方案 實驗方案和接種量見表1。接種完成后，用已滅菌竹簽攪拌均勻。用手展開紗布蓋住瓶口，再蓋上報紙后用線纏繞好瓶口。稱重后，放置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，每隔4 d補水至原重并攪拌均勻。發(fā)酵周期15 d，每組實驗重復(fù)三次。

表1 發(fā)酵方案和接種量Table 1 Fermentation scheme and inoculation amount

1.2.4 樣品采集 于發(fā)酵0、2、4、6、9、12和15 d取樣，每次取一整瓶。在無菌操作臺中打開瓶子，稱取三角瓶和瓶內(nèi)固體總質(zhì)量后加入100 mL無菌水，用已滅菌竹簽攪拌均勻并重新包好三角瓶。置于30 ℃，200 r/min恒溫培養(yǎng)振蕩器中，振蕩45 min。于無菌操作臺中，取1 mL混勻的樣品待測液用于稀釋涂布（當天進行）。取45 mL樣品待測液于50 mL離心管中，9000 r/min離心5 min，收集上清液用于其他指標的檢測。風(fēng)味物質(zhì)、乙醇、還原糖、有機酸和氨基酸樣品儲存于-20 ℃冰箱中；酯化酶、糖化酶和α-淀粉酶樣品當天檢測。

1.3 檢測方法

1.3.1 感官評價 感官評定由湖北工業(yè)大學(xué)12名感官評估師（男6名，女6名，年齡20～40歲）評定。感官評價員按照ISO 8586：2012標準，在室溫（25±2 ℃）的感官室進行訓(xùn)練，并且都有一年以上的感官評價經(jīng)驗。對風(fēng)味特征的感官評定描述術(shù)語由評價員在評估一些樣品和參照資料后共同提供[22-23]。樣品（樣本供應(yīng)溫度30 ℃±2 ℃）攪拌均勻后進行評估，以評價員共同描述部分作為風(fēng)味評價的結(jié)果。

1.3.2 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測 取5 mL上清液樣品，加入裝有1.5 g NaCl、10 μL 1.98 g/L的4-甲基-2-戊醇（內(nèi)標）和轉(zhuǎn)子的頂空鉗口樣品瓶中，用于風(fēng)味物質(zhì)測定。頂空固相微萃取，萃取頭選用白酒風(fēng)味分析一般選用的50/30 μm DVB/CAR/PDMS纖維萃取頭。固相微萃取頭在氣相色譜進樣口老化0.5 h，250 ℃（首次使用萃取頭）。將頂空鉗口樣品瓶于50 ℃磁力攪拌器上加熱平衡30 min后，將萃取頭插入樣品瓶頂空部分，萃取纖維距液面2 mm左右，50 ℃萃取30 min。將萃取頭插入氣相色譜儀（GC）進樣口，進樣口溫度250 ℃解吸5 min，進行GC分析。

色譜柱：安捷倫DB-WAX毛細管色譜柱（60 m×0.32 mm，0.5 μm）；升溫程序：40℃保持5 min，以5 ℃/min升至240 ℃，保留8 min；載氣（N2）流速25 mL/min；檢測器溫度300 ℃。

1.3.3 微生物計數(shù)方法 使用稀釋涂布法進行微生物計數(shù)，將涂布好的平板倒置放于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)2 d后進行計數(shù)。每個稀釋梯度涂三個平板，菌落數(shù)取平均值。

1.3.4 乙醇和還原糖的檢測 乙醇含量通過生物傳感器分析儀S-10進行測定。

還原糖含量使用3,5-二硝基水楊酸法（3,5-dinitrosalicyic acid，DNS）進行測定[24]。以還原糖含量（g/L）為橫坐標，吸光值（OD540）為縱坐標繪制標準曲線，標準曲線方程為y=1.808x-0.0888，其中R2=0.9997。

1.3.5 有機酸檢測 有機酸的檢測方法參考劉翠翠[25]，在樣品處理方法中略微修改。樣品處理：取400 μL上清液于2 mL離心管中，加入1.6 mL的甲醇（沉降蛋白），振蕩混勻后12000 r/min離心5 min。將上清液通過0.22 μm濾膜過濾后，取550 μL上清液到2 mL離心管中并加入400 μL內(nèi)標（0.04%叔戊醇，溶劑為65%乙醇溶液），再加入50 μL甲酸進行活化，振蕩均勻后在-20 ℃條件下保存待測。

乳酸含量的檢測使用生物傳感器分析儀S-10進行測定。

1.3.6 游離氨基酸檢測 檢測參考Reddy等[26]方法并稍作改動。取500 μL上清液到試管中，加入45 μL 7 moL/L的NaOH溶液，再加入500 μL的無水乙醇與吡啶（v:v=4:1）混合液，振蕩均勻。加入100 μL氯甲酸乙酯（ECF），超聲波處理1 min，再加100 μL的ECF，超聲波處理1 min后，加入500 μL含1%ECF和10%內(nèi)標（0.2%乙酸苯乙酯，氯仿作為溶劑）的氯仿溶液及200 μL飽和碳酸氫鈉溶液，劇烈振蕩處理1 min。將試管中液體轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中，3000 r/min離心5 min。取下層液體至已添加無水硫酸鈉的2 mL離心管中，3000 r/min離心1 min。將離心后的上部分液體轉(zhuǎn)移至棕色氣相瓶中，旋緊瓶蓋并用封口膜封好瓶蓋部分，保存在-20 ℃條件下用于氣相色譜檢測。

色譜柱：安捷倫DB-5毛細管色譜柱（30 m×0.23 mm，0.25 μm）；升溫程序：70 ℃保持5 min，以5 ℃/min升至280 ℃，保留5 min；載氣（N2）流速25 mL/min；檢測器溫度300 ℃；進樣口溫度280 ℃。

1.3.7 糖化酶活力測定 葡萄糖淀粉酶（糖化酶）酶活力的測定方法參考Chen等[27]略微修改。移取0.5 mL處理后的樣品，加入0.5 mL的10 g/L可溶性淀粉溶液，置于40 ℃水浴鍋保溫5 min，取出后加入0.5 mL的DNS試劑放入沸水浴中處理5 min，冷卻后加入4 mL去離子水。以水代替樣品，其他操作與測試樣品相同，用于調(diào)零，于540 nm波長處比色并記錄示數(shù)。以葡萄糖濃度（g/L）為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線，標準曲線方程為y=1.1745x+0.071，其中R2=0.999。一單位葡萄糖淀粉酶活性定義為在測定條件下每小時釋放出1 mg還原糖的酶量。

1.3.8α-淀粉酶活力測定α-淀粉酶酶活力的測定方法參考Xiao等[28]，并在其基礎(chǔ)上稍作改進。取處理好的樣品0.4 mL，加入0.4 mL的2 g/L可溶性淀粉溶液，于50 ℃孵育30 min后，加入0.2 mL 1 mol/L的HCl終止酶反應(yīng)。再加入1 mL的碘試劑，顯色后，加入5 mL去離子水，于580 nm波長處比色。用水代替樣品，其它操作與測試樣品相同，作為空白調(diào)零。以淀粉含量（μg）為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線，標準曲線方程為y=0.0022x-0.0211，其中R2=0.9996。酶活力定義為，在50 ℃、pH7.0條件下平均每分鐘1 μg碘結(jié)合淀粉物質(zhì)的消失量即為一個酶活力單位。

1.3.9 酯化酶活力測定 酯化酶活力測定方法參考潘名志[29]并稍作改進。取上清液樣品0.5 mL，加入pH為6.0的0.1 mol/L磷酸緩沖液3.0 mL和底物2.5 mmol/L的α-乙酸萘酯溶液0.1 mL，置于37 ℃水浴鍋中反應(yīng)15 min，取出后加入0.8%的固蘭B溶液0.4 mL，于37 ℃保溫10 min后取出。以去離子水代替樣品，其他與測試樣品相同，作為空白調(diào)零。在528 nm吸收波長處比色，測其光密度。以α-萘酚濃度（mmol/L）為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線，標準曲線方程為y=0.5376x-0.0471，其中R2=0.9998。酶活力定義為在37 ℃，15 min水解α-乙酸萘酯產(chǎn)生1.0 mmoLα-萘酚所需的酶量為一個酶活力單位。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗重復(fù)三次，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)、有機酸和氨基酸均采用內(nèi)標法進行半定量分析，通過與標準品保留時間的對比進行定性分析。使用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行分析，使用Origin 9和Excel 2010進行圖像的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一酵母菌發(fā)酵和混菌發(fā)酵感官評價

固態(tài)單一菌株發(fā)酵費比恩塞伯林德納氏酵母HY-11（F1）和葡萄牙棒孢酵母HY-21（F2）兩發(fā)酵方案在整個發(fā)酵過程中，感官評價整體風(fēng)味較差，產(chǎn)生風(fēng)味較淡，無酒味。如表2所示，F(xiàn)1方案在發(fā)酵前期（1～5 d）感官評定只具有蒸煮高粱味；發(fā)酵中期（6～10 d），具有淡果香和甜味；發(fā)酵后期（11～15 d）果香味消失。F2發(fā)酵2 d具有高粱味和甜味，4～9 d具有淡果香和甜味，后期主要表現(xiàn)為淡的酸味。

費比恩塞伯林德納氏酵母HY-11和葡萄牙棒孢酵母HY-21分別同米曲霉M-08混菌發(fā)酵，即F4和F5方案，與單一酵母菌發(fā)酵相比感官風(fēng)味較好，風(fēng)味提升明顯。如表2所示，F(xiàn)4方案在發(fā)酵6 d時風(fēng)味最好，風(fēng)味特點為超濃哈密瓜香、酒香和酯香味。F4在發(fā)酵4～6 d時的酒香味較突出，嗅評風(fēng)味最濃厚，隨著發(fā)酵的進行風(fēng)味開始變淡。F5方案雖然在發(fā)酵4～9 d期間具有酒香風(fēng)味，但整體風(fēng)味欠佳，醬香和咸味太重。故而F5在發(fā)酵15 d時的風(fēng)味最佳，具有醬香、果香和哈密瓜香，但是缺乏酒香味。

表2 單一酵母菌發(fā)酵和混菌發(fā)酵感官評定Table 2 Sensory evaluation of single yeast fermentation and mixed fermentation

加入米曲霉M-08進行混菌發(fā)酵，不僅使得風(fēng)味更佳濃厚，感官風(fēng)味更好，也使得酒香味實現(xiàn)從無到有，這說明米曲霉M-08的加入促進了酵母菌揮發(fā)性風(fēng)味代謝物的產(chǎn)生，兩菌株之間具有較好相互作用。

2.2 單一酵母菌發(fā)酵和混菌發(fā)酵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量如表3所示，F(xiàn)4和F5方案的風(fēng)味物質(zhì)種類最多（9種），F(xiàn)1方案種類較少（8種），F(xiàn)2最少（2種）。酵母菌單一菌株發(fā)酵即F1和F2，風(fēng)味物質(zhì)總量較低，最高含量分別為3.68和2.17 μg/g，較低的風(fēng)味物質(zhì)含量與嗅評結(jié)果風(fēng)味較淡相一致。而加入米曲霉M-08進行混菌發(fā)酵的F4和F5方案，風(fēng)味物質(zhì)的總含量有大幅度提升，最高含量分別達到1408.97和257.77 μg/g。費比恩塞伯林德納氏酵母HY-11單菌與混菌發(fā)酵相比，混菌發(fā)酵缺少了癸酸乙酯、月桂酸乙酯和4-乙基愈創(chuàng)木酚，產(chǎn)生了新的代謝產(chǎn)物乙酸乙酯、乙酸異戊酯、異丁醇和2,3-丁二醇。葡萄牙棒孢酵母HY-21單一菌株發(fā)酵僅有苯乙醇一種風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生，但與米曲霉M-08混菌發(fā)酵則產(chǎn)生了8種（乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯、異丁醇、異戊醇、2,3-丁二醇、苯甲醛和乙偶姻）新的產(chǎn)物。分析單一酵母菌和混菌發(fā)酵的風(fēng)味物質(zhì)變化可知，米曲霉M-08的加入改變了酵母菌代謝風(fēng)味物質(zhì)特征，從而導(dǎo)致整個發(fā)酵體系風(fēng)味特征的變化。

表3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及其含量Table 3 Volatile flavor compounds and their contents

F4在發(fā)酵6 d時具有超濃的哈密瓜香、酒香和酯香味，酯類物質(zhì)中水果味的乙酸乙酯和熱帶水果味的乙酸苯乙酯[30]含量較高，分別達到了841.68和344.87 μg/g。F5在發(fā)酵15 d時產(chǎn)生大量的乙酸乙酯和玫瑰花香味的苯乙醇，其含量分別達到148.11和50.77 μg/g，此時為果香和哈密瓜香。由此可知，費比恩塞伯林德納氏酵母HY-11具有更強的產(chǎn)酯能力，而葡萄牙棒孢酵母HY-21的產(chǎn)醇能力更好，兩菌株在同米曲霉的混菌發(fā)酵中都具有很好的產(chǎn)香能力，但F4方案風(fēng)味更好。

2.3 單一酵母菌發(fā)酵和混菌發(fā)酵酵母菌生長分析

如圖1A所示，發(fā)酵前2 d酵母菌單菌發(fā)酵pH呈上升趨勢而與米曲霉M-08混菌發(fā)酵前期pH則呈降低趨勢，這說明M-08對發(fā)酵過程中pH的變化有較大影響。體系中加入米曲霉M-08，會大幅度降低體系的pH。

發(fā)酵過程中酵母菌生物量變化如圖1B所示，整個發(fā)酵過程中F1和F2方案生物量波動較小，F(xiàn)4和F5方案生物量變化較大。F1方案整體生物量較低，且僅在發(fā)酵前2 d呈升高趨勢，發(fā)酵2 d生物量為2.75×108CFU/g，之后其生物量基本一直維持不變。F2在發(fā)酵過程中生物量在4 d時最高，為6.87×108CFU/g，12 d降低到4.81×108CFU/g，隨后便開始二次生長，發(fā)酵15 d達到6.06×108CFU/g。F4方案發(fā)酵前4 d酵母菌生物量呈直線增加，4 d生物量為9.85×108CFU/g，隨后開始降低，6 d時出現(xiàn)二次生長現(xiàn)象，并且在發(fā)酵12 d時生物量達到最高

圖1 發(fā)酵過程中pH和酵母菌生物量Fig.1 pH and yeast biomass during fermentation

1.64×109CFU/g，隨后略有降低。F5的生物量在所有方案中變化最大，其生物量最高值出現(xiàn)在2 d時為1.35×109CFU/g，而在發(fā)酵后期，該方案的酵母菌生物量很低，12 d時的生物量最低，為7.92×106CFU/g，隨后出現(xiàn)二次生長。費比恩塞伯林德納氏酵母HY-11和葡萄牙棒孢酵母HY-21分別同米曲霉M-08混菌發(fā)酵，生物量同單菌發(fā)酵相比有了大幅度的提升，分別提升了496.36%和96.51%，這說明兩株酵母菌都為霉菌依賴型酵母。且F4生物量一直高于F1，說明在該發(fā)酵體系中米曲霉M-08對酵母菌具有完全的促進作用。F5僅在發(fā)酵前4 d生物量比F2高，發(fā)酵6 d后生物量較低，說明僅在發(fā)酵前期米曲霉M-08與葡萄牙棒孢酵母HY-21有較好的相互作用。

發(fā)酵6 d后F4風(fēng)味物質(zhì)開始大幅降低，此時生物量卻很高，說明后期生物量太高會影響風(fēng)味物質(zhì)的合成，并且會消耗風(fēng)味物質(zhì)。F4二次生長發(fā)生在6 d時，此時的風(fēng)味物質(zhì)含量最高；F5在發(fā)酵12 d出現(xiàn)二次生長，15 d風(fēng)味物質(zhì)含量達到最高。因此可發(fā)現(xiàn)，風(fēng)味最佳，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)最高的時期，往往出現(xiàn)在二次生長時，或者二次生長后，且生物量不宜過高。

2.4 單一酵母菌發(fā)酵和混菌發(fā)酵乙醇和還原糖含量比較

酵母菌通過無氧呼吸產(chǎn)生乙醇，四個方案中酵母菌產(chǎn)生乙醇含量如圖2A所示。F1和F2方案基本無乙醇產(chǎn)生，在整個發(fā)酵周期內(nèi)乙醇產(chǎn)量基本趨近于零。當兩株酵母菌分別同米曲霉M-08混菌發(fā)酵后，乙醇產(chǎn)量明顯提升，這說明米曲霉M-08的加入促進了酵母菌乙醇的產(chǎn)生。F4方案在發(fā)酵4 d時乙醇的含量達到最高值6.57 mg/g，4 d后其乙醇含量開始降低，15 d時乙醇含量僅為0.11 mg/g。F5方案發(fā)酵6 d時乙醇含量增加到29.81 mg/g，隨后開始降低，但是降低幅度較小，發(fā)酵后期該方案的乙醇含量最高，15 d時的含量仍舊維持在17.99 mg/g?；炀l(fā)酵兩方案的還原糖含量遠高于單一酵母菌發(fā)酵，這說明添加米曲霉M-08可以大幅度提高體系中還原糖的含量（圖2B）。由于F1和F2方案的還原糖含量太低，所以無溢流代謝產(chǎn)物乙醇的生成。F4發(fā)酵后期還原糖水平低，造成乙醇幾乎完全被消耗利用；而F5方案6 d后還原糖水平較高，故乙醇未被完全消耗殆盡，仍舊可以維持在較高水平。相比于費比恩塞伯林德納氏酵母HY-11，葡萄牙棒孢酵母HY-21有更好的乙醇產(chǎn)生能力。

圖2 發(fā)酵過程中乙醇和還原糖含量Fig.2 Contents of ethanol and reducing sugar during fermentation

2.5 單一酵母菌發(fā)酵和混菌發(fā)酵有機酸和氨基酸含量分析

有機酸可以作為風(fēng)味物質(zhì)的前體物質(zhì)，從而影響體系中風(fēng)味物質(zhì)的合成[31]。對單一酵母菌發(fā)酵和混菌發(fā)酵的四種方案進行胞外有機酸代謝分析，如圖3所示。單一酵母菌發(fā)酵的有機酸組成較單一，在F1方案中僅檢測到乙酸和異戊酸，F(xiàn)2中只檢測到異戊酸。F1發(fā)酵4 d乙酸含量最高為0.074 mg/g，兩方案產(chǎn)生異戊酸的含量則很低?；炀l(fā)酵兩方案有機酸合成較多，在種類和數(shù)量上都高于單菌發(fā)酵。F4方案有4種有機酸生成，異丁酸、丁酸和乳酸占主體，最高含量分別為0.33、0.11和0.13 mg/g。F5整個發(fā)酵周期內(nèi)可檢測到5種有機酸，其中異丁酸和丁酸含量較高，最高含量分別為0.72和1.07 mg/g。與單菌發(fā)酵相比，混菌發(fā)酵體系中有機酸的組分發(fā)生改變，通過結(jié)合代謝反應(yīng)合成新的有機酸，并促進了有機酸的消耗（乙酸、異戊酸）?；炀w系有機酸組分的改變，促進了體系中新的風(fēng)味物質(zhì)的代謝（異丁醇），并且使更多乙酸酯類和異戊酸等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)生成。

圖3 發(fā)酵過程中有機酸含量Fig.3 Organic acid content in fermentation process

氨基酸作為風(fēng)味物質(zhì)的前體物質(zhì)，其種類和含量與酵母菌代謝產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)有密切的關(guān)系[32]。如圖4所示，單一菌株發(fā)酵產(chǎn)生氨基酸的種類較單一或者不能向胞外分泌氨基酸，而豐富發(fā)酵體系菌株即添加米曲霉M-08可以有效提高體系中游離氨基酸的含量和種類。費比恩塞伯林德納氏酵母HY-11單菌發(fā)酵未檢測到游離氨基酸，葡萄牙棒孢酵母HY-21整個發(fā)酵過程中也僅檢測到天冬氨酸，所以體系中氨基酸的不足是導(dǎo)致單一酵母菌發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生不足的重要原因之一。F4體系中氨基酸含量相對較低，但其風(fēng)味物質(zhì)生成量和生物量較高（6 d），所以推測大部分的氨基酸被用于菌體生長和合成風(fēng)味物質(zhì)。F5體系氨基酸較豐富，種類和含量都較高，但該體系的總風(fēng)味物質(zhì)生成量較F4低。聯(lián)系生物量分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵6 d時的酵母菌生物量較低，所以導(dǎo)致體系中氨基酸積累，風(fēng)味物質(zhì)合成受到影響。米曲霉M-08與酵母菌有較好的相互作用，共同培養(yǎng)具有良好的氨基酸代謝能力，體系中加入米曲霉M-08，可以有效提升體系的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量。

圖4 發(fā)酵過程中氨基酸含量Fig.4 Amino acid content during fermentation

2.6 單菌發(fā)酵和混菌發(fā)酵酶活力分析

對發(fā)酵過程中的糖化酶、α-淀粉酶和酯化酶進行監(jiān)測，結(jié)果如圖5所示。兩株酵母菌進行單菌發(fā)酵，體系的糖化酶和α-淀粉酶活力較低，所以兩株酵母菌水解淀粉成為可發(fā)酵糖的能力差，體系還原糖水平低，無法為菌體的生長提供足夠的碳源。米曲霉M-08產(chǎn)生糖化酶和α-淀粉酶能力較強，其最高酶活力分別可達到4887.91和69437.64 U/g。兩酵母菌分別與米曲霉M-08進行混菌發(fā)酵，糖化酶和α-淀粉酶活力與酵母菌單菌發(fā)酵相比有不同程度的提高?；炀l(fā)酵F4方案糖化酶的酶活力在發(fā)酵第4 d時達到最高371.65 U/g，F(xiàn)5則在第2 d達到最酶活力455.07 U/g，而單菌發(fā)酵F1和F2的糖化酶活力最高分別為4.43和14.37 U/g。但混菌發(fā)酵方案糖化酶活力比米曲霉M-08單菌發(fā)酵的酶活力低，這說明酵母菌會影響M-08產(chǎn)糖化酶的能力。F4和F5體系的α-淀粉酶活力最高值分別為2586.47和3289.12 U/g，而F1和F2整個發(fā)酵過程中的α-淀粉酶最高酶活力僅為36.27和30.25 U/g。在混菌發(fā)酵時酶活力遠低于米曲霉M-08發(fā)酵時 α -淀粉酶活力，表明霉菌在一定程度上會受到酵母菌的抑制?；炀l(fā)酵體系較高的糖化酶和α-淀粉酶酶活力，使得淀粉水解，從而提高還原糖水平，促進酵母菌生長。分析酯化酶酶活力變化情況發(fā)現(xiàn)，米曲霉M-08的加入能夠提高體系中酯化酶酶活力，這種作用尤其對葡萄牙棒孢酵母HY-21更明顯，對費比恩塞伯林德納氏酵母HY-11也有一定的提升作用，從而大大提升體系風(fēng)味物質(zhì)含量。

圖5 發(fā)酵過程中酶活力變化Fig.5 Changes of enzyme activity during fermentation

費比恩塞伯林德納氏酵母HY-11同米曲霉M-08混菌發(fā)酵，發(fā)酵體系的α-淀粉酶、糖化酶和酯化酶與酵母菌的單一菌株發(fā)酵相比都有極大幅度提升，分別提升了70.31倍、82.89倍和3.69倍。葡萄牙棒孢酵母HY-21與米曲霉M-08混菌發(fā)酵比HY-21單一菌株發(fā)酵α-淀粉酶和糖化酶酶活力分別提高107.73倍和30.67倍，酯化酶從單一菌株發(fā)酵的未檢測到提升到387.82 U/g。說明這兩株酵母菌對米曲霉M-08具有依賴作用，為霉菌依賴型酵母菌，與米曲霉M-08共培養(yǎng)能夠促進體系酶活力的提升，從而促進酵母菌的生長和風(fēng)味物質(zhì)的代謝。

3 結(jié)論

費比恩塞伯林德納氏酵母HY-11和葡萄牙棒孢酵母HY-21為霉菌依賴型酵母，通過同步糖化發(fā)酵方式，與米曲霉M-08混菌發(fā)酵，可以極大促進酵母菌的生長和風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生。費比恩塞伯林德納氏酵母HY-11與米曲霉M-08混菌發(fā)酵風(fēng)味較好，與單一酵母菌發(fā)酵相比，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量更高，并且風(fēng)味代謝物組分發(fā)生變化，發(fā)酵6 d具有超濃哈密瓜香、酒香和酯香味。費比恩塞伯林德納氏酵母HY-11具優(yōu)秀的產(chǎn)酯能力，產(chǎn)生乙酸乙酯、乙酸苯乙酯和乙酸異戊酯的含量分別為903.48、344.87和

198.61 μg/g。葡萄牙棒孢酵母HY-21具有更好的產(chǎn)醇能力，其乙醇、苯乙醇和異戊醇的最高產(chǎn)生量分別為29.81 mg/g、50.77和42.94 μg/g。與單菌發(fā)酵相比，混菌發(fā)酵體系中有機酸的組分發(fā)生改變，通過結(jié)合代謝反應(yīng)合成新的有機酸，并促進了有機酸的消耗（乙酸、異戊酸）。米曲霉M-08與酵母菌有較好的相互作用，混菌發(fā)酵可提升體系游離氨基酸水平，因而體系中加入米曲霉M-08，能有效提升體系的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量。兩株酵母菌單菌發(fā)酵的產(chǎn)酶能力不足，無法為菌體生長提供足夠碳源，導(dǎo)致風(fēng)味代謝物含量低。利用米曲霉M-08的產(chǎn)酶優(yōu)勢，采用同步糖化發(fā)酵方式，能夠有效提升體系的酶活力，促進揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的代謝。本研究結(jié)果為米曲霉M-08與霉菌依賴型酵母在共培養(yǎng)發(fā)酵中的相互作用提供了理論依據(jù)，為費比恩塞伯林德納氏酵母HY-11和葡萄牙棒孢酵母HY-21應(yīng)用于白酒釀造奠定基礎(chǔ)。