金鯧魚發(fā)酵菌株篩選及其生物學(xué)特性與風(fēng)味形成評價

蘇偉明，胡夢杰，沈會連，林琰佳，鄧 旗，劉楚祺，鐘賽意，劉 穎,

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，廣東省海洋生物制品工程實驗室，廣東湛江 524088；2.海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，大連工業(yè)大學(xué)，遼寧大連 116034）

金鯧魚（Trachinotus ovatus）學(xué)名卵形鯧鯵，常生活于熱帶及溫帶海洋中，其肉質(zhì)細膩、鮮甜、口感綿延，是一種深受消費者喜愛的海洋魚類。近年來，隨著深海網(wǎng)箱、海洋牧場等技術(shù)的不斷推廣與應(yīng)用，金鯧魚養(yǎng)殖產(chǎn)量逐年快速增加，成為南方沿海規(guī)模化生產(chǎn)的魚類之一[1]。但同時由于過快地擴張，導(dǎo)致金鯧魚市場供過于求，而且目前的市場銷售以活鮮、冰鮮和冷凍魚等產(chǎn)品為主[2]，行業(yè)存在產(chǎn)品種類單一，高附加值深加工產(chǎn)品缺乏等問題，造成利潤嚴重下滑，制約了金鯧魚產(chǎn)業(yè)發(fā)展的空間。湛江烏石鎮(zhèn)地處雷州半島西南部，是廣東省主要漁港之一，全鎮(zhèn)以漁業(yè)為主，其中當?shù)鼐用裼脗鹘y(tǒng)鹽制的發(fā)酵的方式，形成具有獨特湛江風(fēng)味的發(fā)酵金锠魚，受到消費者喜愛。

發(fā)酵是一種經(jīng)濟而古老的食品加工與保存方法[3]，通過微生物與食物成分的相互作用及微生物酶的降解作用，產(chǎn)生乳酸、酮類、醛類、醇、烯烴類等物質(zhì)，賦予發(fā)酵產(chǎn)品獨特的風(fēng)味、口感與色澤[4-6]，Narzary等[7]對18種發(fā)酵魚產(chǎn)品的營養(yǎng)成分、風(fēng)味、滋味、益生性及微生物的組成進行了報道，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵魚中微生物對其營養(yǎng)、風(fēng)味有重要的影響，同時產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)又延長了產(chǎn)品的保質(zhì)期。因此，開發(fā)以發(fā)酵金鯧魚為代表的深加工產(chǎn)品有望成為解決滯銷、行業(yè)低迷等問題的有效途徑。但是，利用鹽制或風(fēng)干方法制備的傳統(tǒng)發(fā)酵魚中的微生物是來自于自然富集的，由于受到不同年份、不同季節(jié)溫度與濕度的影響，參與發(fā)酵的微生物種群不確定，影響其產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性、保質(zhì)期以及安全食用性[8]。因此，篩選具有良好特性的微生物進行人工接種，對提高與穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量，縮短發(fā)酵時間尤為重要。而用于接種發(fā)酵的微生物通常是從傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品中分離優(yōu)質(zhì)微生物這一策略獲得[9]，Shubham等[10]利用此策略從印度的發(fā)酵魚中分離篩選到40株乳酸菌，并發(fā)現(xiàn)其中兩株菌具有較好的應(yīng)用特性。近年來，研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌屬、片球菌屬、乳桿菌屬等乳酸菌在魚的發(fā)酵過程中起到了關(guān)鍵的作用[11-12]。另外，田國軍等[13]成功地從自然發(fā)酵的臘魚中分離到1株優(yōu)質(zhì)乳酸菌，并接種到新鮮的臘魚中進行發(fā)酵，其產(chǎn)品的風(fēng)味和質(zhì)量均得到了明顯的改善。Barbara等[14]發(fā)現(xiàn)，乳桿菌屬用于魚發(fā)酵香腸生產(chǎn)中，有效減少了發(fā)酵時間。總之，隨著人工接種發(fā)酵技術(shù)的不斷成熟，在食品發(fā)酵中使用發(fā)酵劑進行定向接種已成為提高加工速度和產(chǎn)品質(zhì)量的重要手段[15]。

針對傳統(tǒng)方法制備的發(fā)酵魚微生物種群結(jié)構(gòu)的不確定性，導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定這一問題，本研究以廣東湛江烏石鎮(zhèn)傳統(tǒng)方法制備的優(yōu)質(zhì)發(fā)酵金鯧魚為材料，從中分離篩選出適合作為發(fā)酵劑的微生物菌種，并對分離菌株的生物學(xué)特性及其形成的風(fēng)味進行評價，以期為實現(xiàn)定向接種，人工控制發(fā)酵生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

傳統(tǒng)發(fā)酵金鯧魚 新鮮優(yōu)質(zhì)，來自于廣東湛江烏石鎮(zhèn)，每條400 g左右；金黃色葡萄球菌（StaphylococcusaureusATCC29213）、大腸桿菌（Escherichia coliATCC35218） 均購自廣東省微生物研究所；MRS肉湯、MRS培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯（NB）、營養(yǎng)瓊脂（NA） 青島海博生物技術(shù)公司；Mighty Amp DNA Polymerase Ver.2 寶生物工程有限公司；16S rRNA細菌通用引物27F：5” -AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3” ，1492R：5” -GGTTACCTTGTTACGAC TT-3” 上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

CFX96 Touch型實時熒光定量PCR儀、Gel Doc XR+型凝膠成像儀 美國BIO-RAD公司；PEN3型電子鼻 德國AIRSENSE公司；SA402B型電子舌 日本INSENT公司；Varioskan Flash型酶標儀美國熱電公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵菌株的篩選 用無菌水沖洗掉發(fā)酵金锠魚表面的雜質(zhì)，瀝干水之后，用滅菌剪子剪碎，稱取25 g加到無菌均質(zhì)袋中，再加入pH7.2滅菌的PBS 225 mL，均質(zhì)30 s后，吸取0.1 mL均勻涂布于MRS培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)48～72 h。挑取不同形態(tài)特征的菌落，反復(fù)純化，直至獲得純的分離株。

參照文獻[16]，篩選具備過氧化氫酶實驗呈陽性、發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，但不產(chǎn)生生物胺、不產(chǎn)氣，具有一定的耐鹽性，并有良好的抗菌活性菌株作為潛在發(fā)酵菌株。抗菌活性測定采用牛津杯法[17]，其它指標測定采用《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》描述方法[18]。

1.2.2 發(fā)酵菌株的16S rRNA鑒定 分別以27F、1492R為正、反向引物，使用MightyAmp DNA聚合酶對發(fā)酵菌株進行菌落PCR，PCR體系與反應(yīng)條件按照Lu等[19]的方法。再將目的PCR產(chǎn)物寄送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。根據(jù)測得的16S rRNA基因序列，從EzBioCloud數(shù)據(jù)庫進行同源性搜索，下載相似性高的模式菌株的相應(yīng)基因序列[20]，并用MEGA5.1建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 溫度對發(fā)酵菌株生長的影響 挑取兩環(huán)發(fā)酵菌株，接種于50 mL MRS液體中，30 ℃靜置培養(yǎng)18 h，作為發(fā)酵菌株的種子液，再將種子液按3%接至MRS液體中，混勻后分別置于20、25、30 ℃培養(yǎng)28 h，且每間隔2 h測定發(fā)酵液的OD600nm[21]，繪制生長曲線，評價溫度對兩株發(fā)酵菌的影響。

1.2.4 pH對發(fā)酵菌株生長的影響 將1.2.3中的發(fā)酵菌株的種子液按3%的接種量分別接種于pH為3.0、4.0、5.0、6.0和7.0的MRS液體中，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h后，測定發(fā)酵液OD600nm值[22]，繪制生長曲線，評價pH對兩株發(fā)酵菌的影響。

1.2.5 發(fā)酵菌株產(chǎn)酸能力測定 按3%接種量將種子液接種于100 mL的MRS液體中，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h，每間隔4 h取樣，測定發(fā)酵液的pH[23]。

1.2.6 發(fā)酵菌株抗菌活性的測定 挑取兩環(huán)S.aureus與E.coli分別接種于NB中，37 ℃搖床中培養(yǎng)16～20 h，然后將兩種指示菌的菌液濃度稀釋至106CFU/mL，再將指示菌的稀釋液按1:100的比例加到55 ℃的NB中，混勻后趁未凝固前快速倒入擺放有滅過菌的牛津杯培養(yǎng)皿中，待凝固后拔出牛津杯。接著吸取200 μL發(fā)酵菌上清液加到杯孔中，37 ℃靜止培養(yǎng)18 h，觀察是否出現(xiàn)抑菌圈，并測量抑菌圈的直徑[24]。同時，以生理鹽水代替發(fā)酵上清液做空白對照。

1.2.7 發(fā)酵菌株發(fā)酵液的電子鼻測定 將1.2.3中發(fā)酵菌的種子液按3%的接種量接于MRS液體中，30 ℃靜止培養(yǎng)24 h，再量取發(fā)酵液20 mL于頂空瓶中，靜置30 min后進行電子鼻檢測，測定條件為：頂空時間20 min，樣品及載氣流速均為300 mL/min，傳感器自清洗時間60 s，樣品測試時間60 s，數(shù)據(jù)采集間隔為1 s，PEN3電子鼻傳感器對不同成份敏感性能描述見表1。

表1 PEN3型電子鼻傳感器描述Table 1 Description of PEN3 electronic nose sensor performance

1.2.8 發(fā)酵菌株發(fā)酵液的電子舌測定 將1.2.7中得到的菌株發(fā)酵液稀釋5倍，在4 ℃下，以3000 r/min離心20 min，收集上清液過濾，吸收100 mL上清濾液裝入專用燒杯中，進行電子舌的檢測。電子舌AAE、CT0、CA0、C00和AE1傳感器的響應(yīng)特性分別為鮮味、咸味、酸味、苦味和澀味。在測定前，所有傳感器先放在參比溶液（0.30 mmol/L酒石酸和30.00 mmol/L氯化鉀混合溶液）中活化24 h，再裝機進行自檢至信號穩(wěn)定，每個樣品做4次循環(huán)，取后3次結(jié)果，并對味覺特征進行分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵菌株的確定

從傳統(tǒng)發(fā)酵金鯧魚中分離純化到38株菌，通過發(fā)酵菌株篩選實驗，菌株zh-b與菌株zh-f符合發(fā)酵菌株篩選標準[16]，確定為潛在發(fā)酵菌。在MRS培養(yǎng)基上，菌株zh-f菌落呈圓形，色白，細密，顯微形態(tài)為桿狀（圖1A、圖1B）；菌株zh-b在MRS培養(yǎng)基的菌落呈圓形，乳白色，凸起，邊緣整齊，不透明，顯微形態(tài)為球狀（圖1C、圖1D）。Samarjit等[12]也從印度曼尼普人制備的傳統(tǒng)發(fā)酵魚中分離到46株形態(tài)不同的菌株，傳統(tǒng)發(fā)酵魚已成為分離用于發(fā)酵微生物的重要來源。

圖1 兩株菌菌落與顯微形態(tài)圖（100×）Fig.1 Colony and micromorphology of the two strains (100×)

2.2 發(fā)酵菌株的16S rDNA鑒定

將菌株zh-b與菌株zh-f的16S rRNA序列與標準菌株進行比對分析，發(fā)現(xiàn)菌株zh-b與模式菌株P(guān)ediococcus pentosaceusDSM 20336相似性最高，相似率為99.26%，而菌株zh-f與模式菌株Lactobacillus plantarumaATCC 14917相似性最高，相似率為99.11%，并用MEGA 5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。結(jié)合形態(tài)鑒定及16S rRNA序列分析，菌株zh-b與zh-f分別鑒定為戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。從印尼的發(fā)酵魚中也分離到了L.plantaruma與P.pentosaceus[25]，而譚汝城等[21]不僅從自然發(fā)酵魚鲊中分離到L.plantaruma與P.pentosaceus，而且又將其接種于新鮮魚中進行發(fā)酵，并與自然發(fā)酵魚的化學(xué)指標和感官品質(zhì)進行比較，結(jié)果表明，接種發(fā)酵可以改善魚鲊游離氨基酸的組成，并有效提高了魚鲊的感官品質(zhì)。

圖2 兩株發(fā)酵的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of two strain

2.3 溫度對發(fā)酵菌株生長的影響

圖3為兩株發(fā)酵菌株在20、25和30 ℃的生長曲線，從圖中可以看出，在30 h內(nèi)兩株菌的OD600隨著培養(yǎng)時間的延長而不斷升高，并逐漸趨于平穩(wěn)，說明菌數(shù)隨著培養(yǎng)時間的延長而不斷提高，并達到穩(wěn)定期。其中，菌株戊糖片球菌zh-b（圖3A）菌液濃度在同一培養(yǎng)時間20 ℃生長最好，其次是30與25 ℃。而植物乳桿菌zh-f（圖3B）是30 ℃菌液濃度最高，其次是25與20 ℃。

圖3 兩株發(fā)酵菌在不同溫度下的生長曲線Fig.3 Growth curve of two strains at different temperatures

通過比較分析，兩株菌混合發(fā)酵液的最適發(fā)酵溫度確定為30 ℃，從生長曲線出現(xiàn)平穩(wěn)時間分析，確定兩株最適發(fā)酵時間為16 h。

2.4 pH對發(fā)酵菌株的生長影響

圖4為兩株菌在不同pH培養(yǎng)條件下的生長曲線，其中戊糖片球菌的OD600曲線在pH3～5區(qū)間的OD600值呈上升趨勢，并在pH5時達到最大值0.45，但在pH6時，OD600出現(xiàn)微小低谷。OD600值總體變化幅度小于0.4，即戊糖片球菌zh-b的生長受pH影響不大。而植物乳桿菌zh-f的生長隨著pH的增高，出現(xiàn)了先增大再減小的現(xiàn)象，pH在3～6區(qū)間其OD600值隨著pH的增大而增大，且增幅明顯，并在pH6時，OD600達到最大值1.60后，接著OD600開始下降。

圖4 pH對兩株發(fā)酵菌的生長影響Fig.4 Effect of pH on the growth of two strains

2.5 發(fā)酵菌株產(chǎn)酸能力測定

不同乳酸菌產(chǎn)酸能力存在一定的差異，由圖5可知，zh-b在24 h內(nèi)產(chǎn)酸能力較弱，僅在前13 h pH有微小的降低后又開始上升。而zh-f在24 h內(nèi)一直在產(chǎn)酸，尤其在4～13 h pH下降較快，產(chǎn)酸速率最大，說明該階段產(chǎn)酸能力最強，20 h后pH達到3.775趨于平緩，說明植物乳桿菌zh-f將是發(fā)酵金鯧魚中產(chǎn)酸的主要貢獻者。

圖5 兩株發(fā)酵菌產(chǎn)酸能力的比較Fig.5 Acid production capacity of two strains

2.6 兩株發(fā)酵菌的抗菌活性

由表2可知，兩株發(fā)酵菌對E. coli和S. aureus均有抗菌活性，其中植物乳桿菌zh-f對兩種指標菌表現(xiàn)出較強的抗菌活性；而戊糖片球菌zh-b對E.coli和S. aureus雖然也對兩株菌有抑菌效果，但不及zh-f的抗菌效果，這可能與植物乳桿菌產(chǎn)酸能力或產(chǎn)生其它抗菌物質(zhì)有關(guān)。

表2 兩株發(fā)酵菌株抗菌活性Table 2 Antibacterial activity of fermentation strains

2.7 發(fā)酵菌株的電子鼻測定

用AIRSENSE PEN3型電子鼻對兩株菌發(fā)酵液的氣味成分進行測定，根據(jù)響應(yīng)值繪制雷達圖（圖6）。通過比較發(fā)現(xiàn)，戊糖片球菌zh-b和植物乳桿菌zh-f菌株發(fā)酵液均含有甲基類（W1S）、硫化物（W1W）、氮氧化合物（W5S）和有機芳香硫化物（W2W）4種相同的香氣成分，但zh-b的響應(yīng)值明顯高于zh-f，另外還產(chǎn)生了醇類或醛酮類（W2S）成分。其中，戊糖片球菌發(fā)酵液中的主要香氣成分W1S、W1W、W5S、W2S、W2W的響應(yīng)值依次是64.10、57.98、44.75、40.22和19.93，其他傳感器測得的響應(yīng)值均低于2，香氣成分不明顯。而zh-f發(fā)酵液中主要香氣成分硫化物（W1W）、氮氧化合物（W5S）、有機芳香硫化物（W2W）、甲基類（W1S）的響應(yīng)值分別為34.11、10.68、8.96和5.50，其他傳感器W2S、W3S、W6S、W5S、W3C和W1C，響應(yīng)值均低于2，香氣成分不明顯。分析表明，戊糖片球菌zh-b是發(fā)酵金鯧魚香氣成分的主要貢獻者。Shen等[26]采用相關(guān)網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測了關(guān)鍵微生物與風(fēng)味形成存在明顯的關(guān)系，采用美國Isenso公司的iNose電子鼻檢測植物乳桿菌、干酪乳桿菌及戊糖片球菌混合菌制備的發(fā)酵帶魚，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過程中形成了氮氧化合物、有機硫化物，萜類、酯類、甲基類以及無機硫化物風(fēng)味物質(zhì)[27]。

圖6 兩株發(fā)酵菌的電子鼻雷達圖Fig.6 Electronic nose radar map of two strains

2.8 發(fā)酵菌株的電子舌測定

SA402B電子舌傳感器酸味和咸味對應(yīng)傳感器的無味點下限分別為-13和-6，其他味覺指標對應(yīng)傳感器的無味點下限均為0，按該電子舌的規(guī)定大于無味點的味覺指標，即可作為評價對象。根據(jù)電子舌對兩株菌味覺響應(yīng)值的測定，繪制滋味雷達圖（圖7）。從圖中可以看出，兩株菌的咸味、澀味、苦回味及澀回味的測定值均不大于無味點下限值，表明兩株不產(chǎn)生對應(yīng)的味道。對于酸味，戊糖片球菌酸味值為-29.5，小于-13，說明該菌不產(chǎn)生酸味，而植物乳酸菌的酸味值為-3.58，明顯大于-13，說明該菌具有較強的產(chǎn)酸能力，這與2.5的結(jié)果一致。對于鮮味、鮮回味，兩株菌的響應(yīng)值均大于無味點下限，具有產(chǎn)生鮮味、鮮回味的能力，其中，戊糖片球菌的味值分別為14.32、6.64，高于植物乳桿菌產(chǎn)生鮮味、鮮回味（3.20、2.90）。另外，兩株菌也產(chǎn)生非常少量的苦味（4.74與1.58）。不同的微生物發(fā)酵產(chǎn)品的味覺也存在差異，將清酒乳桿菌接種到鰳魚中進行固態(tài)發(fā)酵，采用法國阿爾法莫斯公司的ASTREE II電子舌對味道進行測定，檢測到發(fā)酵鰳魚中的酸味、復(fù)合味1、復(fù)合味2及鮮味比未接種的對照組顯著[28]，說明微生物在發(fā)酵過程中對味覺的形成影響較大。

圖7 兩株菌的電子舌雷達圖Fig.7 Electronic tongue radar map of two strains

3 結(jié)論

本研究以過氧化氫酶呈陽性、耐鹽性、抗菌性及不產(chǎn)生組胺為評價指標，從湛江傳統(tǒng)發(fā)酵金鯧魚中分離篩選出兩株潛在發(fā)酵菌株（zh-b和zh-f），經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantaruma），且最適溫度分別為20、30 ℃，最適pH為5、6。兩株菌均具有抗菌活性，但植物乳桿菌zh-f的抗菌活性更好，且產(chǎn)酸能力明顯高于戊糖片球菌zh-b。但zh-b產(chǎn)生的甲基類、硫化物、氮氧化合物、醇類或醛酮類和有機芳香硫化物高于zh-f，而且zh-b產(chǎn)生的鮮味、鮮回味也高于zh-f。本研究從傳統(tǒng)發(fā)酵魚中篩選到的兩株發(fā)酵菌株，由于具有良好的特性，且風(fēng)味與滋味有較好的互補性，因此，兩株菌在發(fā)酵魚應(yīng)用中的潛力不容忽視。