長枝木霉菌對水稻耐鹽堿特性的影響

崔皓鈞，王文奕，李巖，劉琳，馬書榮

(東北鹽堿植被恢復與重建教育部重點實驗室(東北林業(yè)大學)，哈爾濱 150040)

0 引言

在世界范圍內(nèi)鹽堿土的面積約占陸地總面積的10%，鹽堿地分布在干旱的荒漠和半荒漠地區(qū)，還存在于沿海及灌溉地區(qū)[1]。我國具有9 913萬hm2的鹽堿地，在東部的沿海地區(qū)、西北干旱地區(qū)、東北平原地區(qū)均有分布[2-3]。土壤鹽堿化限制農(nóng)業(yè)發(fā)展，威脅生態(tài)環(huán)境[4-5]。鹽堿土中大量的鹽離子毒害植物，使植物生長發(fā)育停滯，植物萎蔫加速。土壤中過量的鹽堿離子，也會使土壤的肥力減弱[6-7]?，F(xiàn)如今，如何高效地利用鹽堿地，發(fā)揮最大的生態(tài)效益，促進農(nóng)林業(yè)經(jīng)濟發(fā)展，是首要解決的任務。

木霉菌(Trichoderma)是世界上廣泛分布的絲狀真菌[8]。木霉菌可以提高植物抗病性，拮抗植物病原菌，還可以在鹽堿脅迫下，減弱鹽堿離子對植物的毒害作用，提高植物耐鹽性，促進植物生長。木霉菌介導的植物耐鹽性已在多種植物中得到證實，如Zhao等[9]發(fā)現(xiàn)棘孢木霉(Trichodermaasperellum)Q1對鹽脅迫下黃瓜生長的促進作用，結果表明該菌株具有很好的溶解磷酸鹽能力，使黃瓜幼苗葉片中吲哚乙酸(IAA)、赤霉酸(GA)和脫落酸(ABA)的水平增加，同時植株的根系生長和根系活力也增加。Contreras等[10]發(fā)現(xiàn)綠色木霉(Trichodermavirens)和深綠木霉(Trichodermaatroviride)在正常和鹽條件下都能促進擬南芥(Arabidopsis)生長，使擬南芥的脫落酸、L-脯氨酸和抗壞血酸水平增加，同時還可以提高擬南芥的IAA水平以及抗氧化能力。可見，通過分離篩選獲得木霉菌，作用于植物，可以作為提高植物抗鹽堿性、促進植物生長的重要手段。

本研究旨在從鹽堿地蒙古柳(Salixlinearistioularis)側根分離出長枝木霉菌，通過鹽堿處理及接菌實驗，分別從生物量、生理生化指標及光合作用等幾個方面，探討了長枝木霉菌對水稻種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，分析了長枝木霉菌對水稻的解鹽促生功能，為進一步研究和利用長枝木霉菌緩解鹽堿脅迫促進植物生長提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試植物：本試驗所采用的水稻品種為長白9號。

長枝木霉菌株：從黑龍江省松嫩平原鹽堿地上自然生長的蒙古柳側根分離、純化獲得，并進行分子鑒定，GeneBank登錄號NR120298.1。

供試土壤：園藝土與蛭石以3∶1的比例混合，裝入滅菌袋，121 ℃，60 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 孢子懸浮液的制備

將長枝木霉菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，28 ℃，黑暗培養(yǎng)7 d至完全產(chǎn)孢，用槍頭刮取培養(yǎng)基上的菌絲和孢子，放入無菌水中，用無菌紗布過濾，制成孢子懸浮液。血球計數(shù)板計算孢子濃度，使?jié)舛日{(diào)至2×108cfu/mL。

1.2.2 種子萌發(fā)處理

挑選籽粒飽滿，大小合適的水稻種子，先用75%酒精消毒8～10 min，無菌水多次清洗，再用5%的次氯酸鈉溶液消毒10～15 min，無菌水多次清洗，得到無菌水稻種子。將無菌處理種子放入2×108cfu/mL的孢子懸浮液中，浸泡6 h，對照組用無菌水浸泡6 h。之后分別將種子放在無菌水、100 mmol/L NaCl溶液、30 mmol/L NaHCO3溶液[11]中，每板20粒種子，3個重復。在第2天時，測定水稻種子的發(fā)芽勢。在第3天時，測定水稻種子的發(fā)芽率。培養(yǎng)后第7天，每個處理取5粒正常發(fā)芽的種子測定其胚根長和胚芽長。

發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽第3天正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100；

發(fā)芽勢=發(fā)芽前2天正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)。

1.2.3 盆栽試驗

將無菌處理后的水稻種子轉移至無菌培養(yǎng)皿中催芽3 d。3 d后挑選長勢相同的種子，移入盆缽中，每盆種植5粒種子。試驗組每5 d，用20 mL孢子懸浮液澆灌于幼苗根部，對照組和試驗組均每3 d澆一次20 mL的鹽堿處理液，剩余2次澆灌蒸餾水20 mL[12]。

1.2.4 幼苗生物學指標的測定

鹽堿脅迫處理水稻45 d后，將水稻植株連根取出，分別測量水稻的株高、地上部分干鮮重、地下干鮮重、根長和葉綠素含量。

1.2.5 生理指標的測定

過氧化氫酶的測定采用過氧化氫還原法。過氧化物酶的測定采用愈創(chuàng)木酚法。超氧化物歧化酶采用氮藍四哇法測定。丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法測定[13]。將水稻葉片擦凈剪碎，依次放入三氯乙酸溶液，獲得MDA提取液，加入硫代巴比妥酸溶液，沸水浴，離心。在比色皿中，用紫外分光光度計分別在450、532、600 nm波長下測定吸光度值并計算含量。

1.2.6 光合參數(shù)的測定

采用便攜式光合作用測定系統(tǒng)(LI-6400)測定水稻葉片的凈光合速率(Pn)、氣孔導度(gs)、蒸騰速率(Tr)和胞間CO2濃度(Ci)，設置光照強度為1 000 μmol/(m2·s)，固定系統(tǒng)內(nèi)CO2濃度(體積分數(shù)，下同)為405 μL/L。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2016對水稻的各項脅迫指標的數(shù)據(jù)進行處理作圖，取5次重復的平均值，用SPSS19.0采用單因素方差分析法進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 種子萌發(fā)的影響

在鹽堿條件下，施用長枝木霉菌孢子懸浮液處理水稻種子進行發(fā)芽試驗，處理3 d，統(tǒng)計發(fā)芽率。如圖1所示，與對照組相比，無菌水條件下，長枝木霉菌顯著提升水稻種子的發(fā)芽率，提升32%。鹽堿脅迫能夠顯著降低水稻種子發(fā)芽率，抑制水稻種子發(fā)芽，發(fā)芽率僅達到75%和53%。接菌后，在堿脅迫下，長枝木霉菌提升水稻種子的發(fā)芽率為18%。而在鹽脅迫下，種子發(fā)芽率顯著提高，提升25%。證明長枝木霉菌能夠有效緩解鹽堿脅迫對種子發(fā)芽的抑制。處理2 d，統(tǒng)計發(fā)芽勢。無菌水條件下，長枝木霉菌提升水稻種子的發(fā)芽勢為0.06。而在堿脅迫下，長枝木霉菌提升水稻種子的發(fā)芽勢為0.03。而在鹽脅迫下，長枝木霉菌提升水稻種子的發(fā)芽勢為0.2。由此可見，在鹽堿脅迫下，采用長枝木霉菌孢子懸浮液處理后可減輕鹽堿離子對種子萌發(fā)的抑制，提高發(fā)芽率和發(fā)芽勢。

**表示P<0.01;***表示P<0.001；n.s.表示差異不顯著。白色柱表示未接種對照；黑色柱表示接種長枝木霉菌株。

水稻種子培養(yǎng)7 d，測定水稻的胚根、胚芽。接種菌株后，促進水稻種子胚芽和胚根的生長，結果如圖2和圖3所示，無菌水條件下，胚芽增長14.2%，胚根增長38.9%。在鹽條件下，胚芽增長50%，胚根增長50%。堿條件下，胚芽增長33.3%，胚根增長50%。與CK相比，種子的胚芽、胚軸顯著提高。綜上可知，施用長枝木霉菌孢子懸浮液可以有效緩解鹽堿脅迫對水稻發(fā)芽帶來的抑制作用，促進水稻生長。

2.2 生物量的影響

在鹽堿脅迫條件下，長枝木霉菌對水稻幼苗生物量的影響，見表1。處理45 d后，在鹽堿脅迫條件下，植株受到鹽堿的作用，生長受到抑制。但接菌后，水稻的株高、根長、鮮重和干重均有所增加。無菌水條件下，接菌后，水稻的株高增加10.4%，水稻的根長增加21.2%，水稻的地下干重增加15.3%，水稻的地下鮮重增加17.4%，水稻的地上干重增加23%，水稻的地上鮮重增加17.4%。在堿脅迫條件下，接菌后，水稻的株高增加13.7%，水稻的根長增加6.7%，水稻的地下干重增加30%，水稻的地下鮮重增加6.7%，水稻的地上干重增加17%，水稻的地上鮮重增加10.8%。在鹽脅迫條件下，水稻的株高增加2.3%，水稻的根長增加14%，水稻的地下干重增加42%，水稻的地下鮮重增加14.7%，水稻的地上干重增加17%，水稻的地上鮮重增加5.4%。試驗結果表明，接種長枝木霉菌孢子懸浮液后，均不同程度地促進幼苗的生長，對水稻地上部分促生效果較為顯著。

第一行為無菌水、NaHCO3、NaCl; 第二行為水+長枝木霉菌、NaHCO3+長枝木霉菌、NaCl+長枝木霉菌。

**表示P<0.01;***表示P<0.001。白色柱表示未接種對照；黑色柱表示接種長枝木霉菌株。

2.3 葉綠素含量的影響

光合作用是植物重要的生命活動，植物的光合作用為植物的生長發(fā)育提供養(yǎng)分和信息。鹽堿脅迫會降解葉綠素，降低植物的光合作用效率[14]。如圖4所示，在鹽堿脅迫條件下，接菌后，葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量均升高。接菌后，在無菌水條件下，水稻葉片葉綠素a升高18.9%，葉綠素b升高31.8%，總葉綠素升高21.6%。在鹽脅迫條件下，水稻葉片葉綠素a升高25.3%，葉綠素b升高10.3%，總葉綠素升高18.4%。在堿脅迫條件下，水稻葉片葉綠素a升高29.6%，葉綠素b升高16.3%，總葉綠素升高22.9%，綜上所述，接種長枝木霉菌可增加水稻葉片中的葉綠素含量。

表1 長枝木霉菌對鹽堿脅迫下水稻幼苗生物量的影響

***表示P<0.001；**表示P<0.01;*表示P<0.05。白色柱表示未接種對照；黑色柱表示接種長枝木霉菌株。

2.4 水稻葉片丙二醛含量的影響

丙二醛(MDA)的存在加劇膜的損傷程度，常作為植物受到逆境脅迫的指標。接菌后，水稻幼苗葉片內(nèi)丙二醛含量的變化，如圖5所示。在鹽堿脅迫下，水稻葉片丙二醛的含量上升。在無菌水條件下，降低效果最明顯，下降47.5%。在鹽脅迫下，下降11.9%。在堿脅迫下，菌株使MDA上升2.5%。

n.s.表示差異不顯著;*表示P<0.05。白色柱表示未接種對照；黑色柱表示接種長枝木霉菌株。

2.5 鹽堿脅迫對水稻酶活性的影響

當植物受到鹽堿脅迫時，會分泌大量的抗氧化物質(zhì)保護自身，防止活性氧的積累[13]。如圖6所示，在鹽堿脅迫下，與對照相比，接菌后水稻葉片內(nèi)酶含量發(fā)生變化。在無菌水條件下，接菌后水稻葉片過氧化物酶(POD)的含量上升38.7%，過氧化氫酶(CAT)的含量上升19.9%，超氧化物歧化酶(SOD)的含量上升20.2%。在鹽脅迫條件下，水稻葉片過氧化物酶含量下降17.9%，過氧化氫酶含量下降11.2%，超氧化物歧化酶含量下降5.7%。在堿脅迫條件下，水稻葉片過氧化物酶含量下降27.9%，過氧化氫酶21.7%，超氧化物歧化酶下降19.2%。綜上所述，在無菌水條件下，接菌后可使酶的活性提高。在鹽堿脅迫條件下，接菌后酶的活性下降。

2.6 水稻葉片光合參數(shù)的影響

長枝木霉菌對水稻幼苗光合參數(shù)的影響，如圖7所示，鹽堿脅迫，使水稻的光合參數(shù)下降。在鹽堿脅迫條件下，接菌后，凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導度、葉片胞間CO2總量均有不同程度的升高。接菌后，在無菌水條件下，水稻葉片光合速率上升13.2%，蒸騰速率上升31.8%，氣孔導度上升6.8%，胞間CO2的含量上升22.2%。在鹽脅迫條件下，凈光合速率含量上升13.8%，蒸騰速率含量上升41.8%，氣孔導度含量上升24.6%，胞間CO2含量上升9.4%。在堿脅迫條件下，凈光合速率含量上升13.5%，蒸騰速率含量上升17.9%，氣孔導度含量上升65.3%，胞間CO2含量上升18.4%。

*表示P<0.05;**表示P<0.01；***表示P<0.001。白色柱表示未接種對照；黑色柱表示接種長枝木霉菌株。

**表示P<0.01; ***表示P<0.001。白色柱表示未接種對照；黑色柱表示接種長枝木霉菌株。

3 討論

木霉菌是一種有益真菌，普遍存在于土壤、植物根際和植物組織中，是重要的微生物資源[15-16]。木霉菌能夠產(chǎn)生一系列的防御反應，提高植物抗病性，同時也能產(chǎn)生植物激素，促進植物生長[16-17]。目前人們對木霉菌的研究主要集中在生物防治方面，而在鹽堿條件下，木霉菌促進植物生長展開的研究較少。本研究從松嫩平原鹽堿地蒙古柳根部分離出長枝木霉菌，并分析長枝木霉菌對植物的解鹽促生能力。發(fā)現(xiàn)長枝木霉菌在生物量、生理生化、光合參數(shù)等方面增強了水稻幼苗對鹽堿脅迫的耐受性，能夠促進水稻生長。

本研究中，進行3組6個處理，分別為水、水+菌、鹽、鹽+菌、堿、堿+菌。以水、鹽、堿分別作為每組的對照。在無菌水和鹽堿條件下，長枝木霉菌接種水稻種子后，顯著提高水稻種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢，且在鹽堿條件下經(jīng)長枝木霉菌處理后水稻種子的發(fā)芽率接近于無菌水條件下，能夠基本消除鹽堿脅迫對水稻種子萌發(fā)的抑制作用，提高水稻種子的發(fā)芽能力。接種長枝木霉菌后水稻地下部分和地上部分的干鮮重都得到了顯著的提升，說明長枝木霉菌緩解了鹽堿離子對水稻幼苗生長的抑制作用；還發(fā)現(xiàn)鹽堿脅迫顯著降低水稻幼苗中的葉綠素含量，但在接種長枝木霉菌后，水稻幼苗中的葉綠素含量上升。由此可見，長枝木霉菌顯著促進水稻幼苗的生長，并幫助其在鹽堿脅迫下積累光合產(chǎn)物，為植株自身的生理活動提供營養(yǎng)物質(zhì)。 Mastouri等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在非生物脅迫下，哈茨木霉(Trichodermaharzionnum)T22通過減少滲透脅迫和脂質(zhì)過氧化物的含量，從而緩解氧化性損傷,同時還可以提高種子的萌發(fā)率。張樹武等[20-21]研究發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫下，長枝木霉T6菌株處理小麥種子7 d后，小麥種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢提高，其種子胚芽長度的增長率為9%～34%，胚根長度的增長率為9%～31%。同時發(fā)現(xiàn)濃度100倍和50倍的深綠木霉發(fā)酵液對白三葉幼苗的葉綠素、抗性相關酶活性有較為明顯的提升，且不同濃度的發(fā)酵液對白三葉草幼苗的影響不同。廉華等[22]發(fā)現(xiàn)合適濃度的棘孢木霉菌劑能促進黃瓜幼苗的形態(tài)建成和物質(zhì)積累，也可增加葉片中總葉綠素含量和根系活力等指標。陳伯清等[23]將木霉菌孢子懸浮液作用于番茄幼苗根際后，發(fā)現(xiàn)番茄幼苗葉片中葉綠素含量上升，促進番茄光合作用。這些研究與本研究一致。

鹽堿脅迫會使細胞內(nèi)積累大量的活性氧(ROS)，氧化損傷細胞內(nèi)的膜脂、蛋白質(zhì)等。為了抵御鹽堿脅迫對植物的傷害，植物進化出有效的抗氧化系統(tǒng)，防止植物受到氧化損傷。人們常用抗氧化酶來評價植物的氧化還原狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，在無菌水條件下，長枝木霉菌使各抗氧化酶的活性提升，有利于植物體內(nèi)活性氧的清除。在鹽堿脅迫下，長枝木霉菌使各種抗氧化酶的活性下降，說明其有效緩解鹽堿離子對幼苗的毒害作用。丙二醛含量反映細胞質(zhì)膜受損傷的程度。本研究發(fā)現(xiàn)，接菌后，丙二醛明顯下降，說明受氧化脅迫的幼苗生長得到緩解。李艷娟等[24]通過試驗證明哈茨木霉與綠色木霉2種木霉菌混合作用于杉木幼苗，可提高杉木幼苗過氧化物酶、過氧化氫酶活性，降低了丙二醛含量，顯著提高幼苗的抗逆性。尹大川等[25]發(fā)現(xiàn)綠木霉T43接種樟子松苗木后，過氧化物酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶的活性顯著上升，表現(xiàn)出較高的酶活性，可以提高植物的抗逆性。這些研究結果與本研究一致。

本研究中，在鹽堿條件下，水稻幼苗用長枝木霉孢子懸浮液處理后，與對照組相比，光合參數(shù)指標得到提升，促進植物光合作用。此結果與他人研究一致，周曉馥等[26]發(fā)現(xiàn)哈茨木霉菌液灌根處理黃瓜幼苗，黃瓜植株的總根長、根尖數(shù)、分支數(shù)明顯增加。葉片的凈光合速率、氣孔導度等明顯提高，促進植物的光合作用。陳雙臣等[27]發(fā)現(xiàn)木霉菌可以提高番茄的光合作用，可提高番茄葉片的凈光合速率、氣孔導度等指標。本研究發(fā)現(xiàn)長枝木霉菌可以提高水稻的光合指標等參數(shù)來增加光合作用，與他人的研究一致。說明長枝木霉菌通過提升水稻葉片的光合參數(shù)來促進水稻的生長發(fā)育。

4 結論

本研究從蒙古柳的側根中分離出長枝木霉菌，并對其解鹽促生能力進行深入研究。在鹽堿條件下，長枝木霉菌提高水稻種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢，促進水稻種子胚根和胚芽的發(fā)育，提高水稻幼苗的株高、根長等各項生物量指標。在生理指標方面，長枝木霉菌使水稻葉片中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)的含量下降。在光合參數(shù)方面，接菌后水稻葉片凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導度和胞間CO2濃度都得到了顯著的提高。說明長枝木霉菌能減少鹽堿脅迫對植物的傷害，增強細胞抗氧化體系，提高水稻對鹽堿脅迫的抵御能力。