基于HMGB1/Beclin-1信號(hào)通路探討雷公藤多苷對(duì)腎病綜合征模型大鼠保護(hù)機(jī)制

羅亞丹 袁立英 裘志成 何鴻

(遵義醫(yī)科大學(xué) 1第三附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，貴州 遵義 563000;2第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科;3遵義醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校健康管理系)

腎病綜合征(NS)是一種具有復(fù)雜發(fā)病機(jī)制的代謝綜合征，表現(xiàn)為尿蛋白增加，高脂血癥等〔1〕。目前，該病的臨床治療主要以激素干預(yù)為基礎(chǔ)，但由于激素的不良反應(yīng)和患者身體敏感性的差異，其效果有限〔2〕。 MicroRNA是小非蛋白質(zhì)單鏈RNA，可通過(guò)組織中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。研究表明，MicroRNA參與了一系列過(guò)程，包括細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞凋亡和自噬〔2，3〕。研究發(fā)現(xiàn)〔4〕，miR-141和HMGB1/Beclin-1之間的平衡是引起NS的重要原因。雷公藤多苷是一種具有強(qiáng)效的調(diào)節(jié)免疫作用與廣泛性的消炎作用的生物大分子，它從雷公藤植物中提取〔3〕。本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究雷公藤多苷在治療NS中的潛在應(yīng)用價(jià)值及驅(qū)動(dòng)這種效應(yīng)產(chǎn)生可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)的成年Wistar大鼠60只，全部選用雄性，體重200～250 g,8周齡。實(shí)驗(yàn)用大鼠由北京維通利華動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(京)2014-0002。大鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)環(huán)境下，定時(shí)輻照滅菌，實(shí)驗(yàn)全程給予所有大鼠便捷自由的飲水和采食設(shè)備，隨時(shí)觀察大鼠狀態(tài)，排除飼養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，開(kāi)始實(shí)驗(yàn)建模。

1.1.2實(shí)驗(yàn)用藥 雷公藤多苷片，每片10 mg，使用時(shí)研磨成細(xì)粉。批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥Z43020138，湖南千金謝利制藥有限公司生產(chǎn)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)試劑 注射用鹽酸阿霉素，購(gòu)自深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司，產(chǎn)品批號(hào)為：國(guó)藥準(zhǔn)字H44024359。醋酸潑尼松龍片，購(gòu)自上海上藥信誼藥廠有限公司，產(chǎn)品批號(hào)為：國(guó)藥準(zhǔn)字H31020771。兔抗大鼠 LC3 購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，產(chǎn)品批號(hào)為：3950。腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(批號(hào)：E201609)、兔抗大鼠 HMGB1 抗體(批號(hào)：11570-1-AP) 、山羊抗大鼠 Beclin-1抗體(批號(hào)：9144-3-CB)、白細(xì)胞介素(IL)-4 ELISA試劑盒(批號(hào)：P201912)和IL-8 ELISA試劑盒(批號(hào)：P201905 ) 均由北京森和優(yōu)生物有限公司生產(chǎn)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1分組和建模 60只大鼠隨機(jī)分為6個(gè)實(shí)驗(yàn)組。除空白對(duì)照組外其余組所有大鼠尾靜脈注射鹽酸阿霉素5 mg/kg，建立NS模型〔5〕。大鼠24 h尿蛋白顯著增加，說(shuō)明模型成功建立〔6〕?？瞻讓?duì)照組的大鼠注射等體積生理鹽水。

1.2.2藥物處理 模型建立5 d后開(kāi)始進(jìn)行藥物處理。低、中、高劑量組分別給予3、6、12 g/kg雷公藤多苷灌胃處理；陽(yáng)性對(duì)照組給予醋酸潑尼松0.2 g/kg灌胃處理；模型對(duì)照組和空白對(duì)照組每日給予等體積的蒸餾水。共持續(xù)14 d，并且藥物處理組固定時(shí)間給藥，空白對(duì)照組于相同時(shí)刻灌胃蒸餾水。

1.2.3檢測(cè)方法

1.2.3.1大鼠一般狀態(tài) 給藥期間，觀察大鼠毛發(fā)、進(jìn)食量、精神、大便、體重情況等。

1.2.3.2蘇木素-伊紅(HE)染色組織學(xué)觀察 給藥結(jié)束后24 h觀察組織，7.5 ml/kg氨基甲酸乙酯麻醉大鼠并處死。從腹部取出腎臟組織，并分兩部分保存，其中一份-80℃冰箱保存，另一份10%多聚甲醛常溫保存。將固定好的腎臟組織包被在石蠟中，切片，進(jìn)行HE染色。首先，應(yīng)將固定好的切片放至顯微鏡下，調(diào)整視距使鏡內(nèi)的細(xì)胞細(xì)節(jié)清晰，然后觀察切片組織發(fā)生的細(xì)胞病理學(xué)變化。病理學(xué)變化的程度以腎臟組織的病理學(xué)評(píng)分為標(biāo)準(zhǔn)，分別為：0分：無(wú)充血、水腫、炎癥浸潤(rùn)等現(xiàn)象的正常組織；1分：血管輕度水腫且組織界限模糊，表現(xiàn)為皮質(zhì)及髓質(zhì)模糊，并出現(xiàn)炎性浸潤(rùn)；2分：組織明顯充血水腫，腎皮質(zhì)與髓質(zhì)之間的界限消失，細(xì)胞的炎性浸潤(rùn)顯著；3分：腎組織各結(jié)構(gòu)模糊不清，顯著受損，血管模糊，細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重的炎性浸潤(rùn)。

1.2.3.3TUNEL法腎組織凋亡觀察 取出-80℃放置的腎組織冷凍切片，加入50 μl蛋白酶K，37℃孵育20 min，加入TUNEL反應(yīng)液，37℃孵育1 h，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗兩次切片，添加過(guò)氧化物酶結(jié)合抗體，37℃孵育1 h，孵育結(jié)束后，使用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色，然后用蘇木素復(fù)染。脫水封片，并在顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。凋亡細(xì)胞核染色呈棕色。用ImageJ軟件定量分析細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡率(%)=棕色細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù) × 100%。

1.2.3.4外周血細(xì)胞TNF-α、IL-4、IL-8含量的測(cè)定 處死大鼠后，收集10 ml血液，并以3 000 r/min進(jìn)行離心，放置在15 ml離心管中離心10 min，取上層分離的血清液采用ELISA檢測(cè)血清中TNF-α，IL-4和IL-8的水平。

1.2.3.5ELISA測(cè)定HMGB1、LC3與Beclin-1的蛋白表達(dá)水平 將腎臟組織添加到IPA裂解緩沖液中，并放置于冰上，低溫裂解20 min。BCA法處理樣本，使用96孔分別添加，對(duì)樣本進(jìn)行總蛋白濃度定量，確定后續(xù)加樣量，以進(jìn)行Western印跡實(shí)驗(yàn)。通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離轉(zhuǎn)膜質(zhì)量相等的蛋白質(zhì)條帶，添加一抗與β-actin內(nèi)參(1∶500)然后在4℃搖床孵育過(guò)夜。 過(guò)夜后，先檢查膜上是否有沒(méi)浸潤(rùn)的地方，若浸潤(rùn)充分則使用TBST進(jìn)行洗滌，洗滌3次，每次同樣在搖床放置5 min，提高洗滌效率。洗滌后，添加二抗(1∶500)，使用電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑曝光顯色，并使用QuantityOne軟件分析相對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1大鼠一般狀態(tài)比較 空白對(duì)照組精神狀態(tài)良好，反應(yīng)靈敏，毛發(fā)光滑發(fā)亮，進(jìn)食正常。模型對(duì)照組造模后第7天，大鼠尿量減少并伴有少量的腹水現(xiàn)象，精神狀態(tài)日漸萎靡，進(jìn)食減少，體重下降；造模后第7～14天，大鼠腹水顯著增多，出現(xiàn)嗜睡、反應(yīng)遲鈍，有弓背聳肩現(xiàn)象，蜷臥少動(dòng)，體毛發(fā)灰發(fā)暗，大便稀溏等體征；與模型對(duì)照組相比，低、中、高劑量組在5 d給藥后，大鼠的活躍度較高，精神好轉(zhuǎn)，毛發(fā)漸有光澤。

2.2各組腎組織HE染色 空白對(duì)照組腎臟大小正常且組織細(xì)胞邊界清晰，無(wú)炎癥，浸潤(rùn)未出現(xiàn)充血。模型對(duì)照組腎臟腫大，腎皮質(zhì)與腎髓質(zhì)出現(xiàn)分界模糊，血管充血癥狀，炎癥和浸潤(rùn)明顯。低、中、高劑量組上述癥狀程度較模型對(duì)照組輕。

與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組腎組織病理評(píng)分較高，且差異顯著(P<0.05)；與模型對(duì)照組相比，藥物處理各組的腎組織病理評(píng)分均較低，且差異顯著(P<0.05)。雷公藤多苷的治療效果具有顯著劑量依賴(lài)性(P<0.01)。見(jiàn)圖1、表1。

圖1 各組腎組織形態(tài)(HE染色，×200)

2.3各組腎組織凋亡比較 與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組與藥物處理各組的凋亡細(xì)胞數(shù)量增加，且差異顯著(P<0.05)；與模型對(duì)照組相比，藥物處理各組腎臟中凋亡細(xì)胞數(shù)量降低，且差異顯著(P<0.05)。雷公藤多苷治療效果具有顯著劑量依賴(lài)性(P<0.01)。見(jiàn)表1，圖2。

2.4各組腎組織TNF-α，IL-4，IL-8含量比較 與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組及藥物處理各組TNF-α、IL-4、IL-8含量增加，且差異顯著(P<0.05)；與模型對(duì)照組相比，藥物處理各組腎臟中TNF-α、IL-4和IL-8的含量降低，且差異顯著(P<0.05)。雷公藤多苷的治療效果具有顯著劑量依賴(lài)性(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組腎組織病理評(píng)分、凋亡及TNF-α、IL-4、IL-8表達(dá)比較

2.5各組腎組織中HMGB1/Beclin-1信號(hào)通路的蛋白表達(dá)對(duì)比 與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組及藥物處理各組HMGB1、LC3、Beclin-1蛋白表達(dá)出現(xiàn)增加，且差異顯著(P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，藥物處理各組中HMGB1/Beclin-1信號(hào)蛋白的表達(dá)量均降低，且差異顯著(P<0.05)，與低劑量組相比，高、中劑量組HMGB1/Beclin-1信號(hào)蛋白的表達(dá)均降低，且差異顯著(P<0.01)。見(jiàn)圖3、表2。

圖2 各組腎組織凋亡影響的比較(TUNEL染色，×200)

1～6：模型對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組、空白對(duì)照組

表2 HMGB1/Beclin-1信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)〔7，8〕，NS具有復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制，可能機(jī)制與炎癥反應(yīng)，微循環(huán)阻礙及機(jī)體代謝異常有關(guān)。在中醫(yī)中，NS屬于“水”和“缺乏”兩類(lèi)。其發(fā)病原因，可能主要是由肺、脾和腎的功能障礙導(dǎo)致，其實(shí)質(zhì)是腎虛。處理原則應(yīng)為除風(fēng)促水。要移動(dòng)脾虛消濕，促進(jìn)血液循環(huán)消瘀，促進(jìn)排濕熱，解濕熱毒等〔9〕。雷公藤多苷是一種植物提取的生物大分子，具有調(diào)節(jié)免疫作用與消炎作用〔3〕，有“中草藥激素” 之稱(chēng)，其為我國(guó)首先研究利用的一種具有消炎免疫作用的中草藥。自噬是一種程序化的生存模式，通過(guò)自噬相關(guān)因子調(diào)節(jié)自噬囊泡的降解，以維持內(nèi)部環(huán)境的穩(wěn)定性和細(xì)胞代謝的平衡〔10〕。研究表明miR-141可以與HMGB1啟動(dòng)子結(jié)合以靶向并抑制HMGB1的表達(dá)，從而阻斷HMGB1/Beclin-1途徑，減弱由急性腎損傷(AKI)誘導(dǎo)的NS〔11〕。生理自噬不能觸發(fā)NS的病理過(guò)程。當(dāng)人體中發(fā)生了炎癥反應(yīng)時(shí)，人體外周血內(nèi)白細(xì)胞的比例類(lèi)型將發(fā)生變化。在免疫機(jī)制下，人體白細(xì)胞會(huì)發(fā)生過(guò)多變化〔12〕。

有研究指出，TNF-α、IL-4和IL-8可以通過(guò)調(diào)節(jié)多種細(xì)胞信號(hào)通路來(lái)增強(qiáng)炎癥反應(yīng)〔13〕。雷公藤多苷對(duì)NS有較好的改善和治療作用，但具體作用機(jī)理尚不清楚。本文結(jié)果表明，雷公藤多苷可能通過(guò)調(diào)節(jié)NS大鼠的免疫變化，發(fā)揮了抗炎作用。

HMGB1可以在染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)中發(fā)揮重要作用，影響核中的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制、重組的效率及基因組的整體穩(wěn)定性，還可以用作胞外信號(hào)分子，來(lái)進(jìn)行炎癥，免疫反應(yīng)，自噬和癌癥的微觀調(diào)節(jié)〔14〕。Beclin-1是第一個(gè)被證實(shí)的自噬基因，在炎癥中起重要作用〔15〕。 有研究表明，細(xì)胞質(zhì)HMGB1可將Beclin-1分子從其抑制伴侶Beclin-2分子中分離出來(lái)，并通過(guò)Beclin-2分子促進(jìn)Beclin-1分子和Ⅲ型磷酸肌醇3激酶的結(jié)合，來(lái)激活自噬〔16〕。有證據(jù)〔17〕表明，miR-141可以與HMGB1mRNA啟動(dòng)子上的HMGB1受體結(jié)合來(lái)阻斷其表達(dá)，從而抑制HMGB1/Beclin-1途徑來(lái)阻斷刺激自噬體的過(guò)程。NS發(fā)作期間上述指標(biāo)是否有變化尚未得到證實(shí)〔18〕。本研究表明，HMGB1/Beclin-1信號(hào)通路的傳導(dǎo)信號(hào)增強(qiáng)。這也證實(shí)了HMGB1/Beclin-1信號(hào)通路及其調(diào)控機(jī)制與NS的發(fā)病機(jī)制有關(guān)〔19〕。本實(shí)驗(yàn)表明，雷公藤多苷可有效降低腎臟組織中HMGB1、LC3和Beclin在NS模型大鼠的表達(dá)，并通過(guò)降低蛋白表達(dá)的方式調(diào)整了HMGB1/Beclin-1的信號(hào)通路HMGB1、LC3、Beclin-1的負(fù)反饋機(jī)制，從而有效地控制了信號(hào)通路的傳導(dǎo)并控制了疾病的進(jìn)程。

因?yàn)槔坠俣嘬諏?duì)蛋白尿的短期作用相對(duì)明顯，沒(méi)有激素治療導(dǎo)致臉圓、身胖的不良反應(yīng)，由于原產(chǎn)地國(guó)內(nèi)，且前期研究國(guó)內(nèi)較為深入，作為國(guó)內(nèi)的平價(jià)藥物具有價(jià)格不貴，服用方便的優(yōu)點(diǎn)。但有研究表明，其可能對(duì)女性腎病患者具有一定的毒害作用〔20〕。后續(xù)研究中，應(yīng)進(jìn)行對(duì)應(yīng)方面研究的拓展。

綜上所述，雷公藤多苷可通過(guò)調(diào)節(jié)HMGB1/Beclin-1通路，降低蛋白表達(dá)的方式，降低腎細(xì)胞凋亡，控制細(xì)胞內(nèi)負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，從而影響NS大鼠的病程。表明miR-141可能是NS治療的潛在靶標(biāo)。下一步可以從分子和遺傳學(xué)的角度，繼續(xù)深入探討雷公藤多苷對(duì)NS的治療作用。