miR-213靶向SRC抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷徙

侯花屏，劉新奇，石菲

1.榆林市第一醫(yī)院普外科，陜西 榆林 719000；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)航空航天醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710032

胃癌又稱胃腺癌，是世界上第四大癌癥類型，也是癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[1]。研究表明，胃癌發(fā)生與性別和年齡有關(guān)，男性發(fā)病率高于女性。50 歲以上人群中胃癌的發(fā)病率明顯升高[2-3]。胃癌在亞洲、拉丁美洲、中歐和東歐的發(fā)病率較高[1]。由于在早期階段，胃癌沒有臨床表現(xiàn)，許多患者在疾病的晚期才被診斷，因此胃癌的治療效果欠佳[2]。雖然病理診斷和手術(shù)治療是提高胃癌患者生存率的有效手段，但由于胃癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，胃癌患者的5 年生存率仍然很低[3]。越來越多的證據(jù)表明，miRNA 對胃癌發(fā)生發(fā)展有著重要調(diào)節(jié)作用，miRNA 代謝的紊亂可能是胃癌的潛在發(fā)病機(jī)制[4-6]。有研究表明，miR-213在乳腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌和舌細(xì)胞癌中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[7-10]，而miR-213對胃癌的調(diào)控作用尚不明確。本研究擬探究miR-213 對胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器 澳洲胎牛血清(美國Gibco 公司，貨號：10100147)、低糖的DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基(美國Gibco 公司，貨號：31330095)、Ⅰ型膠原(美國Gibco公司，貨號：A1048301)；Lipofectamine 2000(美國Invitrogen 公 司，貨 號：11668030)；miRNA 核 苷 酸 序 列(miR-213 序列)(生工生物公司)；RNA 的抽提試劑盒(日本TaKaRa 公司，貨號：639505)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa 公司，貨號：639549)、擴(kuò)增試劑盒(日本Ta-KaRa 公司，貨號：639503)；q-PCR 引物由生工生物公司合成；CCK-8細(xì)胞增殖檢測試劑盒(碧云天公司，貨號：b4758)；抗Ki67 抗體(美國Abcam 公司，貨號：ab32147)、抗E-cadherin 抗體(美國Abcam 公司，貨號：ab128873)、抗N-cadherin 抗體(美國Abcam 公司，貨號：ab135745)和抗GAPDH 抗體(美國Abcam 公司，貨號：ab78453)；DNA 內(nèi)切酶及連接酶(北京百奧萊博科技有限公司，貨號：BTN130639 和BTN130653)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司，型號：ABI7500fast)；酶標(biāo)儀(上海沛歐分析儀器有限公司，型號：SPS5845)；顯微鏡(日本Olympus 公司，型 號：cx21fs1)；電泳儀及發(fā)光儀(中國天能公司，型號：天能EPS600)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集 選取2018年1月至2020年1月期間在榆林市第一醫(yī)院行胃腺癌切除術(shù)的患者30例，收集患者胃癌組織及癌旁組織。標(biāo)本收集均經(jīng)過患者知情同意并簽署知情同意書后進(jìn)行。納入標(biāo)準(zhǔn)：首次行手術(shù)切除的胃癌患者，術(shù)后經(jīng)病理診斷為胃腺癌者；年齡為45～75歲男性。排除標(biāo)準(zhǔn)：不同意參加本次試驗(yàn)者；存在心、肝及腎臟等重要臟器功能障礙者；不能夠配合者；長期服用藥物者；近5 年間罹患高血壓、糖尿病、冠心病及其他惡性腫瘤者；有過胃腸道手術(shù)病史者。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1 和胃癌細(xì)胞系MNK-45、MGC803、SCG-7901、AGS 購買自蘇州思瑞坦細(xì)胞庫。根據(jù)轉(zhuǎn)染寡核苷酸序列不同分為轉(zhuǎn)染miR-213 陰性對照序列(5'-CAG GGC UAU GGC UAU GGC UAU GC-3')的對照組和轉(zhuǎn)染miR-213 模擬序列(5'-AGC AGC CUU GUA CAG GGC UAU GA-3')的模擬物組[11]。轉(zhuǎn)染時(shí)將普通培養(yǎng)基去除，換為低血清的、不含抗生素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6 h；在此期間，將Lipofectamine 2000 和由公司合成的miRNA 相關(guān)核苷酸序列混合均勻，室溫放置30 min，待脂質(zhì)體將核苷酸序列充分包裹；在培養(yǎng)6 h后將適量上述脂質(zhì)體混合液加入到上述低血清培養(yǎng)基中(miRNA 相關(guān)核苷酸序列濃度為80 nmol/L)繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)6 h，隨后更換上述培養(yǎng)基為常規(guī)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。

1.2.3 q-PCR 檢測miRNA 表達(dá)量 按照說明書利用RNAiso進(jìn)行細(xì)胞裂解，室溫裂解2 min 后加入適量的三氯甲烷震蕩，待溶液完全乳化，室溫放置10 min后見萃取分層，高速離心后取無色上清加入等體積的異丙醇，充分混合后冰凍過夜。離心后棄去上清，加入無水乙醇充分洗滌沉淀，棄去上清，加入DEPC水溶解RNA。根據(jù)說明書配制反應(yīng)液并設(shè)置參數(shù)，反轉(zhuǎn)錄條件：37℃預(yù)熱15 min，42℃加熱15 min，85℃加熱5 s，反應(yīng)結(jié)束后得到的cDNA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)擴(kuò)增試劑盒說明書配制反應(yīng)液，經(jīng)過預(yù)變性和擴(kuò)增反應(yīng)等步驟完成擴(kuò)增步驟，利用相對定量法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃維持5 s，60℃維持34 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)[11]。

1.2.4 細(xì)胞增殖能力檢測 根據(jù)CCK-8 試劑盒說明書配制反應(yīng)液，將上述反應(yīng)液按照一定濃度加入到MNK-45 細(xì)胞中，隨后再將細(xì)胞放入常規(guī)孵箱培養(yǎng)，利用酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞的吸光度[11]。

1.2.5 transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷徙 利用常規(guī)方法在transwell 的上、下培養(yǎng)室中加入基質(zhì)凝膠和相應(yīng)培養(yǎng)基。將MNK-45 細(xì)胞接種到上部培養(yǎng)室，48 h 后利用固定液固定MNK-45細(xì)胞，染色后利用顯微鏡對細(xì)胞進(jìn)行觀察，記錄發(fā)生遷徙的細(xì)胞數(shù)目[12]。

1.2.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷徙 使用移液器的細(xì)槍頭在培養(yǎng)有融合度達(dá)到80%左右MNK-45 細(xì)胞的培養(yǎng)板上進(jìn)行劃線，隨后將劃線后的培養(yǎng)板繼續(xù)放入孵箱中常規(guī)培養(yǎng)，分別記錄各時(shí)間點(diǎn)不同組別細(xì)胞劃痕的愈合情況[12]。

1.2.7 Western blot 技術(shù)檢測蛋白表達(dá)量 利用蛋白酶裂解液裂解細(xì)胞，在上述液體中加入緩沖液，利用煮沸方法制備上樣蛋白樣品。電泳參數(shù)：95 V進(jìn)行30 min 完成濃縮膠的電泳，隨后調(diào)整為120 V 電泳90 min 完成分離膠的電泳；轉(zhuǎn)膜參數(shù)：250 mA 恒流轉(zhuǎn)膜2 h。按照Ki67 (1∶3 000 稀釋)、E-cadherin(1∶5 000 稀釋)、N-cadherin(1∶3 000稀釋)和GAPDH(1∶10 000稀釋)抗體說明書配制抗體，室溫孵育4 h，取出條帶后沖洗干凈，配制帶有辣根過氧化物酶的二抗孵育液，隨后室溫孵育1 h，進(jìn)行發(fā)光[11]。

1.2.8 熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)的構(gòu)建和檢測 通過靶基因預(yù)測軟件發(fā)現(xiàn)潛在靶基因肉瘤基因(sarcoma gene，SRC)的結(jié)合序列，并對其人工合成，即可得到非編碼(untraslated regions，UTR)序列，對上述序列進(jìn)行突變即可得到突變(mutation，MUT)序列。利用DNA內(nèi)切酶及連接酶將合成的上述基因插入到質(zhì)粒中，將上述質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增并抽提。隨后利用制備得到的質(zhì)粒和UTR 或者M(jìn)UT 序列共轉(zhuǎn)染入MNK-45 細(xì)胞(細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法同前)。隨后利用酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞內(nèi)熒光素酶活性[11-12]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示；當(dāng)進(jìn)行兩樣本間比較時(shí)采用獨(dú)立t 檢驗(yàn)，當(dāng)進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)多次測量的樣本分析時(shí)采用重復(fù)測量方差分析；組間比較采用Bonferroni post hoc檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-213 在胃腺癌組織和胃癌細(xì)胞系中低表達(dá) 與癌旁組織比較，胃癌組織中miR-213低表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖1A。與正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1 比較，胃癌細(xì)胞系MNK-45、MGC803、SCG-7901 和AGS 中miR-213 低表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖1B。

圖1 q-PCR檢測臨床胃癌樣本及細(xì)胞系內(nèi)miR-213的含量

2.2 轉(zhuǎn)染miR-213 模擬序列能夠上調(diào)細(xì)胞內(nèi)miR-213 的水平 與對照組比較，模擬物組細(xì)胞內(nèi)miR-213含量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖2。

圖2 q-PCR檢測胃癌細(xì)胞系MNK-45內(nèi)miR-213的含量

2.3 轉(zhuǎn)染miR-213 模擬序列抑制胃癌細(xì)胞系MNK-45 的增殖 與對照組比較，模擬物組細(xì)胞增殖能力降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖3。

2.4 transwell 驗(yàn)證轉(zhuǎn)染miR-213 模擬序列抑制胃癌細(xì)胞的遷徙 與對照組比較，模擬物組細(xì)胞遷徙能力下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖4。

2.5 劃痕實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染miR-213 模擬序列抑制胃癌細(xì)胞的遷徙 與對照組比較，模擬物組細(xì)胞遷徙能力下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖5。

圖3 CCK-8法檢測MNK-45細(xì)胞的增殖能力

2.6 miR-213模擬序列調(diào)控相關(guān)蛋白表達(dá) 與對照組比較，模擬物組細(xì)胞Ki67 和N-cadherin 表達(dá)下降，但E-cadherin 表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖6。

2.7 SRC 是miR-213 的靶基因 為進(jìn)一步研究miR-21 的抑癌機(jī)制，利用Targetscan 和MiRanda 等靶基因預(yù)測軟件預(yù)測了miR-213 的潛在靶基因，發(fā)現(xiàn)SRC 基因的3’UTR 上存在miR-213 的潛 在結(jié)合位點(diǎn)。繼而，利用熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模擬物組質(zhì)粒的熒光素酶活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖7。

圖4 transwell檢測MNK-45細(xì)胞的遷徙能力

圖5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測MNK-45細(xì)胞的遷徙能力

圖6 Western Blot檢測MNK-45細(xì)胞中Ki67、E-cadherin和N-cadherin蛋白的表達(dá)

圖7 熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果驗(yàn)證

3 討論

胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的胃腸道疾病之一，是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。由于胃癌在早期沒有明顯臨床表現(xiàn)，大多數(shù)患者在后期才被發(fā)現(xiàn)，往往錯(cuò)過治愈機(jī)會[1-3]。故深入研究胃癌發(fā)病機(jī)制及尋求治療新靶點(diǎn)成為近年來的研究熱點(diǎn)。而miRNA研究較為深入，已有多種miRNA藥物已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)[13]。

在文獻(xiàn)回顧中發(fā)現(xiàn)，miR-213在乳腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌和舌細(xì)胞癌中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[7-10]。為探究miR-213 在胃腺癌中的作用，課題組首先在患者知情同意下，按照嚴(yán)格的納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)收集胃腺癌樣本30 例。與癌旁組織比較，胃腺癌組織中miR-213低表達(dá)；與正常胃黏膜細(xì)胞比較，多種胃癌細(xì)胞系中miR-213 低表達(dá)。上述結(jié)果表明，miR-213 可能在胃癌中發(fā)揮抑癌作用。隨后課題組證明，上調(diào)miR-213 抑制胃癌細(xì)胞系的增殖和遷徙，這與之前學(xué)者研究報(bào)道一致[9-10]。GREITHER 等[9]發(fā)現(xiàn)，miR-213在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中低表達(dá)，上調(diào)miR-213 能夠抑制鱗狀細(xì)胞癌的增殖和遷徙。WONG 等[10]證實(shí)，miR-213能夠抑制舌細(xì)胞癌的增殖和侵襲作用。但也有學(xué)者報(bào)道，miR-213在乳腺癌中高表達(dá)，其能夠促進(jìn)乳腺癌的增殖和侵襲[7-8]。miR-213在調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖方面的差異可能是由于腫瘤細(xì)胞來源不同，這同時(shí)也說明了miR-213在細(xì)胞增殖調(diào)控中的復(fù)雜性。

Ki67 是臨床和基礎(chǔ)研究中較為常見的細(xì)胞增殖標(biāo)志物，其含量越高，增殖能力越強(qiáng)[14]。N-cadherin 和E-cadherin兩種蛋白在上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化這一腫瘤轉(zhuǎn)移的始動環(huán)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。N-cadherin作為常用間葉細(xì)胞標(biāo)志物，而E-cadherin 作為常見的上皮細(xì)胞標(biāo)志物，廣泛用于臨床診斷。細(xì)胞從上皮細(xì)胞向間葉細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變的一個(gè)標(biāo)志是：E-cadherin 的表達(dá)下降以及N-cadherin 的表達(dá)升高，此時(shí)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)[15-16]。在本實(shí)驗(yàn)中，課題組發(fā)現(xiàn)miR-213能夠下調(diào)Ki67 和N-cadherin 的表達(dá)，而上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，這從另一方面證實(shí)了miR-213能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷徙。

目前研究表明，在人類的多種腫瘤中SRC 基因被過度激活，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的生長及侵襲[17]。已有研究證實(shí)，抑制SRC 基因的活化可以發(fā)揮有效的抑癌作用[18-19]。為了探究miR-213抑制胃癌細(xì)胞增殖和遷徙的機(jī)制，首先利用生物信息學(xué)分析技術(shù)預(yù)測了miR-213 可能的靶基因，發(fā)現(xiàn)miR-213 與SRC 基因有著較高的匹配度。隨后課題組通過熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)證明了miR-213 直接靶向作用于癌基因SRC，這可能是miR-213 發(fā)揮抑癌作用的重要方式。后續(xù)研究將進(jìn)一步在體驗(yàn)證miR-213的抑癌作用。

綜上所述，胃癌組織及胃癌細(xì)胞系內(nèi)低表達(dá)miR-213，miR-213 可靶向SRC 抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷徙。