奶牛NR1D1基因的真核表達(dá)載體構(gòu)建、表達(dá)譜及其在卵巢組織的定位

王逸群，劉祖培，李雅婷,2，張海森,2，李 丹，靳亞平,2，陳華濤,2*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，楊凌 712100)

地球的自轉(zhuǎn)帶來(lái)了光照、溫度等外界環(huán)境因素的晝夜節(jié)律性變化，生物體為預(yù)測(cè)并適應(yīng)這些外界環(huán)境因素的節(jié)律性變化，在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中逐漸形成了一套內(nèi)源性的自主調(diào)控系統(tǒng)，稱為生物鐘[1]。生物鐘廣泛存在于動(dòng)物、植物、細(xì)菌以及真菌等地球上的大部分生命體中，是機(jī)體晝夜節(jié)律產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)[2-3]。哺乳動(dòng)物生物鐘是一個(gè)完整的層級(jí)控制系統(tǒng)，位于下丘腦視交叉上核(suprachiasmatic nucleus，SCN)的中樞生物鐘接收并整合視網(wǎng)膜下丘腦束傳遞的周期性光線信號(hào)的明暗變化，通過(guò)神經(jīng)與體液途徑將時(shí)間信息傳遞至肝、肺、肌肉、卵巢與睪丸等組織器官，從而協(xié)調(diào)同步化大量的外周生物鐘，共同維持機(jī)體生理穩(wěn)態(tài)[4-6]。

在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，幾乎所有的細(xì)胞都存在自主維持的晝夜節(jié)律振蕩器，即由多個(gè)生物鐘基因及其編碼蛋白相互作用構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)路[7]。核受體NR1D1是晝夜節(jié)律生物鐘系統(tǒng)的重要組分，由于該蛋白缺乏對(duì)配體依賴性共激活因子募集和核受體轉(zhuǎn)錄激活至關(guān)重要的C端螺旋結(jié)構(gòu)，因此主要表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄抑制作用[8-10]。近年來(lái)應(yīng)用基因組學(xué)、生化以及藥理學(xué)技術(shù)的眾多研究證據(jù)表明，NR1D1在晝夜節(jié)律以及肝、胰腺、卵巢與睪丸等組織正常生理功能的穩(wěn)態(tài)維持過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[11-15]。

目前，對(duì)于哺乳動(dòng)物生物鐘系統(tǒng)的研究多以嚙齒類動(dòng)物為模型，關(guān)于反芻動(dòng)物NR1D1基因生物學(xué)功能的研究則相對(duì)較少。在前期的研究中，人們發(fā)現(xiàn)環(huán)境因素(光照、溫度等)與飼養(yǎng)方式(飼糧配比、限制性飼喂等)的改變能夠通過(guò)反芻動(dòng)物的生物鐘系統(tǒng)影響其生產(chǎn)性能[16-21]。然而，目前人們對(duì)反芻動(dòng)物生物鐘系統(tǒng)分子基礎(chǔ)的認(rèn)識(shí)相對(duì)有限，深入探究反芻動(dòng)物生物鐘基因的生物學(xué)功能，或可為人們尋找提高反芻動(dòng)物生產(chǎn)性能的新方法和新靶點(diǎn)提供思路。

基于前期研究基礎(chǔ)，本試驗(yàn)旨在克隆奶牛NR1D1基因的蛋白編碼序列(coding sequence，CDS)，構(gòu)建該基因的真核表達(dá)載體，同時(shí)使用生物信息學(xué)軟件對(duì)該基因編碼蛋白的理化特性進(jìn)行初步的預(yù)測(cè)和分析，并利用qPCR及免疫組織化學(xué)技術(shù)(IHC)檢測(cè)NR1D1基因在奶牛不同組織的表達(dá)譜，以期為深入探究奶牛NR1D1基因的生物學(xué)功能提供前期基礎(chǔ)和關(guān)鍵材料。

1 材料與方法

1.1 組織與細(xì)胞

5頭成年(24月齡)健康雌性奶牛的心、肝、脾、肺、瘤胃、結(jié)腸、小腸、胰腺、肌肉及皮下脂肪、卵巢組織采自陜西省咸陽(yáng)市某屠宰場(chǎng)，DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，HEK293T細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)提供。

1.2 主要試劑

Trizol、PrimeSTAR Max DNA Polymerase、QuickCutBamH Ⅰ均購(gòu)自日本TaKaRa公司，F(xiàn)SQ-301反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TOYOBO公司，DNase/RNase-Free Water購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，ClonExpress II One Step Cloning Kit、SYBR qPCR Master Mix均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司，無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，Turbofect轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，Anti-HA tag Antibody、Anti-NR1D1 Antibody均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，多聚甲醛固定液購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司，免疫組化超敏UltraSensitiveTMSP試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因序列信息，在線設(shè)計(jì)可擴(kuò)增奶牛NR1D1基因CDS區(qū)全長(zhǎng)的PCR引物、可同時(shí)擴(kuò)增奶牛與人NR1D1基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)引物；并設(shè)計(jì)擴(kuò)增人、奶牛GAPDH基因與奶牛RPLP0基因的qPCR內(nèi)參引物，引物序列信息見(jiàn)表1(小寫(xiě)字母表示同源臂，下劃線部分表示BamH Ⅰ的酶切位點(diǎn))。引物均由西安擎科生物科技有限公司合成。

表1 引物信息Table 1 Primer sequences information

1.4 奶牛NR1D1基因真核表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定

1.4.1 PCR擴(kuò)增奶牛NR1D1基因的CDS區(qū) 使用Trizol法提取奶牛肝組織的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA。以cDNA為模板，使用帶有同源臂的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系50 μL：2×PrimeSTAR Max Premix 25 μL，cDNA模板(50 ng·μL-1)4 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，ddH2O 19 μL。反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s，63 ℃退火15 s，72 ℃延伸56 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸2 min。

1.4.2 同源重組法構(gòu)建奶牛NR1D1基因真核表達(dá)載體 使用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ對(duì)pcDNA3.1-Puro-N-3HA載體進(jìn)行單酶切使其線性化，按照ClonExpress Ⅱ試劑盒說(shuō)明書(shū)配制同源重組反應(yīng)體系，37 ℃反應(yīng)30 min后立即置于冰上冷卻。重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將菌液涂布至含羧芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后，挑取單克隆菌落接種至含有羧芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃ 200 r·min-1搖床培養(yǎng)12 h后，使用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒提取質(zhì)粒。

1.4.3NR1D1基因真核表達(dá)載體的鑒定 使用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ對(duì)獲得的重組質(zhì)粒進(jìn)行單酶切，同時(shí)使用空載體作為對(duì)照；以重組質(zhì)粒為模板，使用NR1D1基因CDS區(qū)擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。酶切及PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，將結(jié)果符合預(yù)期的樣本送至西安擎科生物科技有限公司測(cè)序，比較插入片段序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中奶牛NR1D1基因序列是否一致。

1.5 奶牛NR1D1基因序列及其編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

在NCBI中查找不同物種NR1D1基因序列(表2)，結(jié)合測(cè)序結(jié)果，利用MegAlign軟件分析各物種間NR1D1基因CDS區(qū)的同源性，并利用MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；利用在線軟件分析預(yù)測(cè)奶牛NR1D1蛋白性質(zhì)及生物學(xué)功能，在線軟件及網(wǎng)址見(jiàn)表3。

表2 各物種NR1D1基因CDS序列來(lái)源Table 2 The sources of NR1D1 gene’s CDS in each species

表3 所用生物信息學(xué)在線軟件Table 3 Bioinformatics online softwares

1.6 檢測(cè)奶牛NR1D1基因在HEK293T細(xì)胞的過(guò)表達(dá)

1.6.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 復(fù)蘇HEK293T細(xì)胞并傳代，待細(xì)胞長(zhǎng)滿60 mm培養(yǎng)皿后，將其消化傳代至兩個(gè)6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)到60%以上時(shí)，每個(gè)6孔板分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-3HA-cNR1D1重組質(zhì)粒(過(guò)表達(dá)組)及pcDNA3.1-Puro-N-3HA空質(zhì)粒(對(duì)照組)各3孔，培養(yǎng)24 h后，收取一個(gè)6孔板中的細(xì)胞樣品，用于檢測(cè)NR1D1基因在mRNA水平的過(guò)表達(dá)效果；培養(yǎng)48 h后，收取另一6孔板中的細(xì)胞樣品，用于檢測(cè)NR1D1蛋白的過(guò)表達(dá)效果。

1.6.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)奶牛NR1D1基因在mRNA水平的表達(dá) 提取對(duì)照組和過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為qPCR反應(yīng)的模板。20 μL反應(yīng)體系：2×ChemQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL，cDNA模板(2.5 ng·μL-1)5 μL，上、下游引物各0.4 μL(10 μmol·L-1)，ddH2O 4.2 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火與延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線95 ℃ 10 s；65 ℃ 60 s，后以每秒0.2 ℃升溫至97 ℃，采集熔解曲線熒光信號(hào)。

1.6.3 Western blotting檢測(cè)奶牛NR1D1蛋白的表達(dá)水平 提取對(duì)照組和過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，上樣量為15 μg；將35～100 ku區(qū)域的蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素(PVDF)膜，10%脫脂奶粉室溫封閉2 h后洗膜(TBST溶液洗膜3次，每次10 min，下同)；根據(jù)目的蛋白大小將PVDF膜剪開(kāi)，分別置于一抗(兔抗HA多克隆抗體、兔抗NR1D1單克隆抗體、兔抗β-Actin單克隆抗體)中，4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜；將PVDF膜轉(zhuǎn)移至二抗(HRP共扼羊抗兔抗體)，室溫孵育1 h，洗膜；將PVDF膜置于暗室，均勻滴加適量ECL發(fā)光液，進(jìn)行曝光。

1.7 qPCR檢測(cè)NR1D1基因在奶牛不同組織的表達(dá)譜

分別稱取20 mg奶牛的不同組織，加入1 mL Trizol，使用組織勻漿器將其研磨至勻漿，Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為模板，以奶牛GAPDH、RPLP0基因?yàn)閮?nèi)參，qPCR檢測(cè)奶牛NR1D1基因在不同組織的表達(dá)情況。qPCR反應(yīng)體系與反應(yīng)程序同“1.6.2”。

1.8 IHC檢測(cè)NR1D1蛋白在奶牛卵巢組織的分布

將固定后的奶牛卵巢組織修整為2 cm×0.5 cm×2 cm左右的小塊，注意保持較大黃體及卵泡結(jié)構(gòu)的完整性。將修整后的組織塊置于梯度乙醇溶液中脫水，脫水后置于二甲苯中透明，隨后將組織浸蠟、包埋，制作石蠟切片。取奶牛卵巢組織石蠟切片，使用二甲苯將石蠟切片充分脫蠟，依次經(jīng)梯度乙醇水化后，將石蠟切片放入檸檬酸抗原修復(fù)液中，使用微波爐高火加熱至沸騰后，中火繼續(xù)加熱20 min，進(jìn)行抗原修復(fù)，待完全冷卻至室溫后，PBS清洗(每次5 min，共計(jì)4次)，用油筆在組織周圍3 mm處畫(huà)圈。按照免疫組化超敏UltraSensitiveTMSP試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)抗原修復(fù)后的切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，使用光學(xué)顯微鏡觀察NR1D1在卵巢不同發(fā)育階段卵泡中的表達(dá)分布情況并拍照保存[22]。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用2-ΔΔCt法將qPCR中的Ct值轉(zhuǎn)化為基因相對(duì)表達(dá)量，利用GraphPad Prism 6分析定量數(shù)據(jù)。進(jìn)行非配對(duì)t檢驗(yàn)，比較對(duì)照組與過(guò)表達(dá)組HEK293T細(xì)胞中NR1D1 mRNA表達(dá)水平的差異性；進(jìn)行單因素方差分析，以比較奶牛不同組織中NR1D1 mRNA表達(dá)水平的差異性。P< 0.05表示差異顯著，P< 0.01表示差異極顯著，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié) 果

2.1 奶牛NR1D1基因CDS區(qū)全長(zhǎng)序列的獲取

對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1所示，奶牛NR1D1基因CDS區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在接近2 000 bp處有一清晰、明亮的條帶，且條帶大小與預(yù)期一致(奶牛NR1D1基因CDS區(qū)全長(zhǎng)序列1 842 bp，同源臂42 bp)，說(shuō)明成功獲得奶牛NR1D1基因CDS區(qū)全長(zhǎng)片段。

M. 5 000 bp DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.NR1D1基因CDS區(qū)全長(zhǎng)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M. 5 000 bp DNA marker; 1. PCR amplification product of NR1D1 gene’s full-length CDS region圖1 奶牛NR1D1基因CDS區(qū)全長(zhǎng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定結(jié)果Fig.1 Identification results of the PCR amplification products of the cow NR1D1 gene’s full-length CDS region

2.2 奶牛NR1D1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建

重組質(zhì)粒單酶切及PCR鑒定產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2所示，重組質(zhì)粒單酶切后，分別在預(yù)期的位置出現(xiàn)2個(gè)條帶(5 211 bp和1 842 bp)，條帶大小與空質(zhì)粒單酶切條帶及重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶大小一致。測(cè)序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒中插入片段序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中牛NR1D1基因CDS區(qū)序列完全一致，表明pcDNA3.1-3HA-cNR1D1重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M. 10 000 bp DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.空質(zhì)粒單酶切產(chǎn)物；2.重組質(zhì)粒單酶切產(chǎn)物；3.重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M. 10 000 bp DNA marker; 1. Single digestion product of empty plasmid; 2. Single digestion product of recombinant plasmid; 3. PCR amplification product of recombinant plasmid圖2 奶牛NR1D1基因真核表達(dá)載體酶切及PCR鑒定Fig.2 Enzyme digestion and PCR identification of cow NR1D1 gene’s eukaryotic expression vector

2.3 奶牛NR1D1基因CDS區(qū)序列分析

對(duì)不同物種NR1D1基因CDS區(qū)進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果如圖3所示，NR1D1基因CDS區(qū)在反芻動(dòng)物間高度保守，同源性在97%以上，且牛NR1D1基因CDS區(qū)與豬、馬、大鼠、小鼠、人的同源性超過(guò)85%，說(shuō)明哺乳動(dòng)物NR1D1基因CDS區(qū)總體較為保守。根據(jù)同源性比對(duì)結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖4所示，牛NR1D1基因CDS區(qū)與山羊、綿羊遺傳距離最近，與斑馬魚(yú)的遺傳距離最遠(yuǎn)。

圖3 不同物種NR1D1基因CDS區(qū)同源性比對(duì)Fig.3 Homology comparison of NR1D1 gene’s CDS region in different species

圖4 奶牛NR1D1基因CDS區(qū)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of the cow NR1D1 gene’s CDS region

2.4 奶牛NR1D1蛋白理化性質(zhì)與功能預(yù)測(cè)分析

2.4.1 奶牛NR1D1蛋白的基本理化性質(zhì) 利用ProtParam預(yù)測(cè)奶牛NR1D1蛋白的基本理化性質(zhì)，結(jié)果顯示，NR1D1蛋白共包含613個(gè)氨基酸，分子量為67 ku，理論等電點(diǎn)為8.75。利用ProtScale預(yù)測(cè)NR1D1蛋白親水性，結(jié)果如圖5所示，NR1D1蛋白第212位氨基酸分值最低(-2.822)，表明該位點(diǎn)親水性最強(qiáng)；第541位氨基酸分值最高(2.633)，表明該位點(diǎn)疏水性最強(qiáng)。且NR1D1蛋白總平均親水性(GRAVY)為-0.494，多數(shù)氨基酸表現(xiàn)出親水性，說(shuō)明奶牛NR1D1蛋白為親水性蛋白。

圖5 奶牛NR1D1蛋白親水性預(yù)測(cè)Fig.5 Hydrophilic prediction of cow NR1D1 protein

2.4.2 奶牛NR1D1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位分析 應(yīng)用DeepTMHMM對(duì)奶牛NR1D1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖6A所示，奶牛NR1D1蛋白為胞內(nèi)蛋白，不含跨膜區(qū)。應(yīng)用DeepLoc-1.0預(yù)測(cè)奶牛NR1D1蛋白的亞細(xì)胞定位，結(jié)果如圖6B顯示，奶牛NR1D1蛋白定位于細(xì)胞核中，其核定位序列位于第200位氨基酸附近。

A. NR1D1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；B. NR1D1蛋白核定位序列預(yù)測(cè)A. Prediction of NR1D1’s transmembrane structure; B. Prediction of NR1D1’s nuclear localization sequence圖6 奶牛NR1D1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)及核定位序列分析Fig.6 Transmembrane structure and nuclear localization sequence analysis of cow NR1D1

2.4.3 奶牛NR1D1蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè) 應(yīng)用NetPhos-3.1軟件預(yù)測(cè)奶牛NR1D1蛋白磷酸化位點(diǎn)，結(jié)果如圖7所示，奶牛NR1D1蛋白共存在86個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，其中包含63個(gè)絲氨酸位點(diǎn)、18個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)以及5個(gè)酪氨酸位點(diǎn)。

圖中紅色表示絲氨酸位點(diǎn)；綠色表示蘇氨酸位點(diǎn)；藍(lán)色表示酪氨酸位點(diǎn)；紫色表示閾值In this figure, red stands for serine; green stands for threonine; blue stands for tyrosine; purple stands for threshold圖7 奶牛NR1D1蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.7 Prediction of phosphorylation sites of cow NR1D1 protein

2.4.4 奶牛NR1D1蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用SOPMA預(yù)測(cè)奶牛NR1D1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖8A所示，奶牛NR1D1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無(wú)規(guī)則卷曲、α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角組成，占比依次為55.30%、25.77%、13.05%和5.87%。利用SWISS-MODEL對(duì)奶牛NR1D1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，并用PyMOL軟件比較奶牛、山羊、小鼠NR1D1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的相似性，結(jié)果如圖8B所示，奶牛與山羊NR1D1蛋白間的原子均方根差(RMSD)為1.576，奶牛與小鼠NR1D1蛋白間RMSD為1.933，說(shuō)明奶牛NR1D1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)與山羊、小鼠較為相似。

A. 奶牛NR1D1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，圖中藍(lán)色表示α-螺旋，紅色表示延伸鏈，綠色表示β-轉(zhuǎn)角，紫色表示無(wú)規(guī)則卷曲；B. 奶牛(a)、山羊(b)、小鼠(c)NR1D1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，圖中藍(lán)色表示α-螺旋，紅色表示β-折疊，紫色表示無(wú)規(guī)則卷曲A. Prediction of the secondary structure of cow NR1D1 protein, blue represents α-helix, red represents extended strand, green represents β-turn, and purple represents random coil; B. Predicted tertiary structure of NR1D1 protein in cow (a), goat (b) and mouse (c), blue represents α-helix, red represents β-sheet, and purple represents random coil圖8 奶牛NR1D1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及比較Fig.8 Prediction and comparison of the tertiary structure of cow NR1D1 protein

2.4.5 奶牛NR1D1蛋白互作與功能分析 使用STRING對(duì)奶牛NR1D1蛋白互作進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果如圖9所示，與NR1D1發(fā)生互作的前10位蛋白包括芳香烴受體核轉(zhuǎn)位因子樣蛋白(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like protein 1，ARNTL)、時(shí)鐘晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)蛋白(circadian locomotor output cycles kaput protein，CLOCK)、隱花色素晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)蛋白2(cryptochrome circadian clock 2，CRY2)、神經(jīng)元PAS結(jié)構(gòu)域蛋白2(neuronal PAS domain protein 2，NPAS2)、基本螺旋-環(huán)-螺旋家族成員e41(basic helix-loop-helix family member e41，BHLHE41)、熱休克轉(zhuǎn)錄因子2(heat shock transcription factor 2，HSF2)、磷脂酶C-β2(phospholipase C-β2，PLCB2)、核受體輔抑制因子1(nuclear receptor co-repressor 1，NCOR1)、含金屬β內(nèi)酰胺酶結(jié)構(gòu)域蛋白1(metallo-β-lactamase domain-containing protein 1，MBLAC1)與RAS激活劑樣蛋白3(RAS protein activator-like 3，RASAL3)。功能預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示，NR1D1能夠直接抑制核心生物鐘組分ARNTL(BMAL1)、CLOCK和CRY2的表達(dá)，負(fù)反饋調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律生物鐘系統(tǒng)；此外，其還與脂質(zhì)和膽汁酸代謝、脂肪生成、糖異生和巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)等生理過(guò)程密切相關(guān)；在細(xì)胞層面，NR1D1可能參與氧化還原狀態(tài)應(yīng)答、類固醇激素受體及糖皮質(zhì)激素受體信號(hào)通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)等過(guò)程。

圖9 奶牛NR1D1蛋白互作預(yù)測(cè)Fig.9 Prediction of cow NR1D1 protein’s interaction

2.5 奶牛NR1D1基因在HEK293T細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后，奶牛NR1D1基因在mRNA和蛋白水平的過(guò)表達(dá)效果如圖10所示，與對(duì)照組相比，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組奶牛NR1D1 mRNA表達(dá)水平升高約2 000倍(P< 0.01)；應(yīng)用HA及NR1D1抗體進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的奶牛NR1D1蛋白相對(duì)于對(duì)照組有顯著的過(guò)表達(dá)。

A. pcDNA3.1-3HA-cNR1D1轉(zhuǎn)染后mRNA相對(duì)表達(dá)量，**P<0.01表示差異極顯著；B. pcDNA3.1-3HA-cNR1D1轉(zhuǎn)染后NR1D1蛋白的表達(dá)，M表示蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；CON. 空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)照組；OVE. 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組A. Relative mRNA expression after transfecting pcDNA3.1-3HA-cNR1D1, **P<0.01 indicates a very significant difference; B. Expression level of NR1D1 protein after transfecting pcDNA3.1-3HA-cNR1D1, M denotes protein molecular weight standard; CON. Control group transfected empty plasmid; OVE. Test group transfected recombinant plasmid圖10 奶牛NR1D1基因在HEK293T細(xì)胞的過(guò)表達(dá)Fig.10 Overexpression of cow NR1D1 gene in HEK293T cells

2.6 NR1D1基因在奶牛不同組織的表達(dá)譜

如圖11所示，NR1D1基因在奶牛不同組織中的mRNA表達(dá)豐度存在顯著性差異(P<0.05),奶牛NR1D1基因在瘤胃、結(jié)腸與肝中表達(dá)量較高，在小腸、胰腺、皮下脂肪與肌肉中表達(dá)量較低。

圖中不同字母表示差異顯著(P<0.05)In each set of bars, different letters mean significant difference (P<0.05)圖11 奶牛NR1D1基因mRNA在不同組織的表達(dá)豐度Fig.11 Expression abundance of cow NR1D1 gene’s mRNA in different tissues

2.7 NR1D1蛋白在奶牛卵巢組織的表達(dá)分布

如圖12所示，NR1D1表達(dá)于不同發(fā)育時(shí)期卵泡的顆粒細(xì)胞中，且該蛋白主要表達(dá)分布于細(xì)胞核內(nèi)。

A.初級(jí)卵泡(400×，NR1D1抗體)；B.次級(jí)卵泡(200×，NR1D1抗體)；C.卵丘-卵母細(xì)胞(200×，NR1D1抗體)；D.顆粒細(xì)胞(200×，NR1D1抗體)；E.卵丘-卵母細(xì)胞(200×，陰性對(duì)照)；F.顆粒細(xì)胞(200×，陰性對(duì)照)A. Primary follicle (400×, Anti-NR1D1); B. Secondary follicle (200×, Anti-NR1D1); C. Cumulus-oocyte (200×, Anti-NR1D1); D. Granulosa cells (200×, Anti-NR1D1); E. Cumulus-oocyte (200×, negative control); F. Granulosa cells (200×, negative control)圖12 NR1D1在奶牛卵巢組織的表達(dá)分布Fig.12 The distribution of NR1D1 in dairy cow’s ovary

3 討 論

近年來(lái)在嚙齒類動(dòng)物中的研究發(fā)現(xiàn)，NR1D1不僅是哺乳動(dòng)物生物鐘系統(tǒng)的重要組分，同時(shí)也參與調(diào)控生殖、代謝與免疫等多個(gè)重要生理過(guò)程，但奶牛NR1D1基因的功能還未被深入研究。本課題組前期已成功構(gòu)建了多個(gè)山羊生物鐘基因的真核表達(dá)載體，并以此為材料探究了生物鐘基因BMAL1對(duì)山羊睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮合成的調(diào)控作用[23-25]。BMAL1基因在山羊睪丸間質(zhì)細(xì)胞過(guò)表達(dá)后，上調(diào)類固醇激素合成關(guān)鍵基因StAR和HSD17B3在mRNA及蛋白水平的表達(dá)，睪酮合成增加。此外，本課題組利用pcDNA3.1-gRORα載體在HEK293T細(xì)胞中進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)，檢測(cè)到山羊RORα蛋白顯著上調(diào)了山羊BMAL1和NR1D1基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，探究了該蛋白的生物學(xué)功能[26-27]。上述證據(jù)說(shuō)明，以pcDNA3.1為骨架構(gòu)建的真核表達(dá)載體是一個(gè)可靠的載體工具，可幫助研究者們深入探究反芻動(dòng)物生物鐘系統(tǒng)相關(guān)基因在生殖與代謝等生理過(guò)程中的功能與作用機(jī)制。

NR1D1作為一種重要的核受體，主要通過(guò)結(jié)合靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件RORE抑制其轉(zhuǎn)錄，是哺乳動(dòng)物生物鐘補(bǔ)充反饋環(huán)路中重要的負(fù)調(diào)控因子，同時(shí)也參與調(diào)控糖脂代謝、炎癥與免疫、繁殖等過(guò)程中關(guān)鍵基因的表達(dá)[8, 13, 28-30]。本研究利用多種生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)分析了奶牛NR1D1基因及其編碼蛋白的理化性質(zhì)和生物學(xué)特性，結(jié)果顯示NR1D1基因在哺乳動(dòng)物間同源性較高，說(shuō)明該基因在進(jìn)化過(guò)程中相對(duì)保守；而牛、山羊及小鼠NR1D1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)較為相似，提示NR1D1蛋白功能可能在反芻動(dòng)物與小鼠之間存在相似之處。因此，有關(guān)小鼠NR1D1基因的研究結(jié)果或可為探究奶牛NR1D1基因功能提供一定的參考。

蛋白質(zhì)相互作用預(yù)測(cè)結(jié)果表明，與NR1D1發(fā)生互作的前10位蛋白中，除ARNTL(BMAL1)、CLOCK、CRY2等晝夜節(jié)律生物鐘蛋白外，還包括轉(zhuǎn)錄抑制因子NCOR1，以及PLCB2、RASAL3等一些參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)且與免疫過(guò)程相關(guān)的調(diào)控因子[31-32]。其中，HSF2在哺乳動(dòng)物精子發(fā)生中發(fā)揮重要作用，其缺失導(dǎo)致睪丸體積縮小、精子數(shù)目減少并損害雄性動(dòng)物生殖能力[33]；此外，一項(xiàng)近期的研究發(fā)現(xiàn)，HSF2能夠緩解腸道炎癥，在結(jié)腸炎中發(fā)揮保護(hù)作用[34]。以上結(jié)果表明，NR1D1可能在奶牛生物鐘系統(tǒng)以及免疫、糖脂代謝與生殖等眾多生理過(guò)程中發(fā)揮特定的作用，但這些僅為初步預(yù)測(cè)分析結(jié)果，尚需進(jìn)一步的驗(yàn)證。

因此，在功能預(yù)測(cè)分析的基礎(chǔ)上，本研究利用qPCR技術(shù)檢測(cè)了NR1D1基因在奶牛不同組織的表達(dá)分布。此前，Dai等[35]檢測(cè)到生物鐘基因NR1D1在雄性天祝白牦牛下丘腦-垂體-性腺軸(HPG軸)的不同組織中均有表達(dá)分布，且IHC結(jié)果顯示，NR1D1主要表達(dá)于牦牛睪丸組織各種生精細(xì)胞以及合成類固醇激素的睪丸間質(zhì)細(xì)胞中。上述研究重點(diǎn)關(guān)注的是NR1D1在雄性牦牛生殖過(guò)程中的功能，而本研究檢測(cè)到NR1D1基因在奶牛多個(gè)組織中均有表達(dá)，其mRNA在瘤胃中的表達(dá)豐度極顯著高于其他組織，其次是結(jié)腸與肝，推測(cè)該基因可能參與奶牛體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收以及能量代謝等過(guò)程。瘤胃是反芻動(dòng)物特有的消化器官之一，也是其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化分解的主要部位[36]。Gao等[37]通過(guò)體外試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，山羊瘤胃上皮細(xì)胞增殖和短鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的mRNA豐度與生物鐘蛋白PER2有關(guān)，提示生物鐘可能參與瘤胃中某些生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控。那么，作為生物鐘系統(tǒng)重要組分的NR1D1在其中發(fā)揮了何種功能，值得進(jìn)一步探究。

卵巢顆粒細(xì)胞主要分泌雌二醇(E2)，是參與哺乳動(dòng)物類固醇激素合成與分泌的重要細(xì)胞類群，它能夠?yàn)槁涯讣?xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量，對(duì)卵母細(xì)胞的發(fā)育、成熟以及正常功能的維持具有重要意義[38]。已有證據(jù)表明，NR1D1在大鼠卵巢中能夠調(diào)節(jié)類固醇激素合成和雌性生殖能力[39-40]。本研究采用IHC染色的方法，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)NR1D1主要分布在卵巢顆粒細(xì)胞中。類似地，Wang等[41]通過(guò)IHC及免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，NR1D1在豬卵巢顆粒細(xì)胞中高表達(dá)，且主要分布在細(xì)胞核中，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的豬卵巢顆粒細(xì)胞中NR1D1與類固醇合成關(guān)鍵基因CYP19A1、CYP11A1和StAR的表達(dá)呈現(xiàn)節(jié)律性。因此，推測(cè)在奶牛卵巢中，NR1D1基因可能同樣參與調(diào)控類固醇激素合成、卵泡發(fā)育等過(guò)程，但其具體作用以及調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究成功構(gòu)建了奶牛NR1D1基因真核表達(dá)載體，并實(shí)現(xiàn)了奶牛NR1D1基因在HEK293T細(xì)胞的高效表達(dá)。對(duì)奶牛NR1D1基因及其編碼蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并獲得了該基因的組織表達(dá)譜，該基因在奶牛多個(gè)組織中均有分布，但表達(dá)水平存在顯著差異，在瘤胃、結(jié)腸與肝中的表達(dá)量顯著高于其他組織。在奶牛卵巢組織中，NR1D1的表達(dá)具有細(xì)胞類型的特異性，主要分布在不同發(fā)育階段卵泡的顆粒細(xì)胞中。本研究結(jié)果為深入探究奶牛NR1D1基因的生物學(xué)功能提供了前期基礎(chǔ)與關(guān)鍵材料。