腸道菌群及其代謝產物調節(jié)動物線粒體功能的研究進展

袁 銅，黃 靚，楊 琳，王文策，朱勇文

(華南農業(yè)大學動物科學學院，廣州 510642)

腸道微生物群作為動物最大的微生態(tài)系統(tǒng)，將動物消化道無法消化的飼糧成分降解成可吸收的成分和一些具有生理活性的小分子化合物。腸道菌群(如乳酸菌、鏈球菌、腸桿菌、梭桿菌)及其代謝產物(短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFA)、膽汁酸、內毒素等)對宿主營養(yǎng)素消化吸收、免疫系統(tǒng)發(fā)育、腸道健康有重要作用[1]。越來越多研究發(fā)現，腸道微生物及其代謝產物在調節(jié)線粒體功能方面產生影響[2-3]，進而影響畜禽機體的抗氧化能力、生長發(fā)育、營養(yǎng)代謝周轉速度及飼料轉化效率等[4]。短鏈脂肪酸(乙酸、丙酸和丁酸等)可提高宿主細胞氧氣消耗和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)水平，改善線粒體氧化磷酸化(oxidative phosphorylation，OXPHOS)水平和抗氧化性能[5]；腸道微生物有害代謝產物(如毒膽酸)可增加活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量、抑制線粒體呼吸鏈復合體的活性[6]。腸道微生物中間產物吲哚丙酸(Indole propionic acid，IPA)誘導線粒體Ca2+超載以及O2過度消耗，從而導致線粒體功能障礙[7]。此外，腸道微生物區(qū)系及其代謝產物類型與飼糧營養(yǎng)水平密切相關。研究表明，日糧纖維增加了腸道菌群多樣性，并顯著升高毛螺菌科豐度以及丁酸濃度[8]。因此，期望通過飼糧營養(yǎng)手段靶向調控腸道微生物菌群及其代謝物來調節(jié)畜禽線粒體功能，改善其生長與健康水平。

1 線粒體的生物學功能

線粒體是真核細胞中的一種重要的細胞器，能夠產生三磷酸腺苷(ATP)、維持細胞Ca2+穩(wěn)態(tài)和調節(jié)ROS產生[9]。細胞線粒體產生的ATP，參與糖酵解中底物的氧化、三羧酸循環(huán)(TCA)、丙酮酸脫羧[10-11]。其中，氧化磷酸化系統(tǒng)由4個多蛋白復合物(Ⅰ～Ⅳ)和ATP合酶(復合物Ⅴ)組成，OXPHOS是需氧產生ATP的主要來源，特別對神經元[12]等需要高能量的細胞至關重要。作為電子傳遞鏈(ETC)的起始位點，復合物Ⅰ、Ⅱ促進電子的傳遞并與電子受體O2結合，從而驅動ATP合成。鈣是線粒體功能的調節(jié)因子，在細胞器內的多水平上促進ATP合成，而氧化應激下，細胞中鈣相關通道功能障礙，大量Ca2+聚集于線粒體，從而導致線粒體損傷和細胞調亡[13]。當細胞內Ca2+超載時，線粒體內膜上的電子傳遞鏈產生ROS，而線粒體內ROS的產生是細胞氧化應激的主要來源[14]。畜禽機體內ROS生成與清除的動態(tài)平衡被打破對畜禽健康有害，當ROS的濃度超過抗氧化劑的緩沖能力時，ROS可導致關鍵生物分子(如脂類、蛋白質或DNA)過氧化損傷。機體線粒體ROS生成的增加可引起熱休克反應、生長緩慢、免疫失調等代謝疾病[15-17]。

2 腸道微生物及其代謝產物對線粒體功能的影響

胃腸道菌群是動物體內最復雜的共生微生物生態(tài)系統(tǒng)，微生物既可以通過代謝宿主的飼糧成分產生氨基酸、SCFA等，也可以通過自身的生物合成基因簇，產生獨特結構和功能的代謝產物影響動物生長發(fā)育。近年來的大量研究發(fā)現，腸道菌群參與調節(jié)宿主的神經生理功能，并提出 “微生物-腸-腦軸”[18]概念。但這些研究多側重于腸道微生物及其代謝產物對宿主組織和細胞的影響及其作用機制，對細胞器功能(如線粒體功能)調節(jié)作用的研究報道偏少。Saihara 等[19]研究發(fā)現，小鼠腸道菌群可介導過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)通路促進動物線粒體生物合成。線粒體功能方面，益生菌鼠李糖乳桿菌激活過氧化物酶增殖物激活受體α(peroxidase proliferators activate receptors-α，PPAR-α)上調脂肪細胞因子表達，提高線粒體OXPHOS水平[20]。此外，小鼠巨噬細胞中結核分枝桿菌抑制內毒素(LPS)介導的Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)信號通路，從而減少線粒體 ROS 的產生[21]。上述研究提示，腸道微生物菌群及其代謝產物可維持腸道穩(wěn)態(tài)或介導調節(jié)線粒體生物合成代謝途徑, 對宿主線粒體功能產生影響。

2.1 腸道微生物及其代謝產物調節(jié)線粒體能量代謝

SCFA是膳食纖維在動物腸道中的乳酸菌和雙歧桿菌等介導下發(fā)酵產生的代謝產物[22]，包括乙酸、丙酸和丁酸等。短鏈脂肪酸是結腸上皮細胞的主要能量來源[23]，其中丁酸作為首要能源物質，對維持腸道功能穩(wěn)態(tài)以及調節(jié)細胞能量代謝具有重要作用。丁酸鹽和乙酸鹽可通過激活小鼠結腸細胞腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)通路調控線粒體功能，AMPK可作為調節(jié)線粒體OXPHOS的能量感受器[24]；Mollica等[25]發(fā)現，N-丁酸鹽通過激活AMPK-乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylaseα，ACC)通路改善了線粒體呼吸能力，從而促進了肝中的線粒體能量代謝。目前，大量畜禽試驗已證實丁酸及其衍生物在畜禽生長發(fā)育和免疫健康及細胞能量與組織穩(wěn)態(tài)等方面具有顯著改善作用。同時，丁酸也可以通過能量底物這一作用，提高結腸上皮細胞線粒體功能，進而調節(jié)腸上皮細胞功能。Donohoe等[26]的體外試驗證實，丁酸鹽進入線粒體，經過β 氧化、TCA 循環(huán)后有助于提高NADH呼吸鏈酶活性及ATP合成，并促進腸細胞氧化代謝及抑制細胞自噬，當添加丁酸鹽到無菌小鼠的結腸細胞中時，OXPHOS水平增加，自噬情況得到改善。體內試驗同樣證實，飼糧中添加丁酸鈉可顯著提高飼料轉化效率[27]和抗氧化能力[28]，一方面，丁酸激活PGC-1α通路并增強線粒體功能來加快能量轉化效率；另一方面，丁酸作為信號分子，可以通過抑制組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)參與線粒體能量代謝酶活性的調控。肝組織中產生的初級膽汁酸[29]，經過部分腸道厭氧菌的降解成為次級膽汁酸，如去氧膽酸和石膽酸。次級膽汁酸是脂質和能量代謝調節(jié)劑，可激活核法呢素 X 受體(farnesoid X receptor，FXR)和 G 蛋白偶聯膽汁酸受體 1(G protein-coupled bile acid receptor 5，TGR5)信號通路與線粒體互作調控[30]。膽汁酸具有促進脂肪消化吸收、抑制腸道有害菌群的生長繁殖以及提高能量代謝水平的作用[31]。腸道中的膽汁酸與FXR 受體結合產生成纖維因子 19/15(fibroblast growth factor 19/15，FGF19/15)通過腦-腸軸到達下丘腦調節(jié)葡萄糖代謝，進一步研究發(fā)現，下丘腦中 FGF19 具有調節(jié)能量代謝的作用[32]。

2.2 腸道微生物及其代謝產物調節(jié)線粒體ROS的產生

OXPHOS產生ATP的過程中，線粒體內膜上的電子傳遞鏈產生ROS，畜禽機體ROS的產生隨著能量需要的增加呈上升趨勢，其原因是線粒體ETC泄漏導致的[33]。復合物 I 是 ROS產生的主要來源，其不穩(wěn)定的性質，將導致蛋白質、脂質和 DNA 發(fā)生氧化反應[34]。腸道微生物及其代謝產物通過調節(jié)ROS的產生靶向調控線粒體，動物機體ROS的大量增加主要源于膽汁酸引起的線粒體膜通透性改變。體外試驗證實，毒膽酸可增加人和小鼠肝細胞中ROS含量、破壞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)和抑制線粒體呼吸鏈復合體的活性[6]。研究表明脫氧熊膽酸(UDAC)濃度低于 50 μmol·L-1時可使線粒體膜通透性增加[35]。飼糧添加高濃度脫氧膽酸鈉(NaDOC)可能造成線粒體氧化損傷，NaDOC作為氧化應激誘導劑在結腸以及肝細胞上得到廣泛運用[36]，NaDOC抑制腸道 Ca2+吸收以及增加ROS 的產生和線粒體膜通透性的改變，導致線粒體氧化應激以及功能障礙[37]。Xavier等[38]研究表明，一定濃度的UDAC可以降低神經干細胞線粒體ROS產量并提高細胞色素含量，進而保護線粒體的完整性和功能，可作為一種靶向線粒體的抗凋亡和抗氧化物質。雖然在畜禽生產上相關的研究較少，但小鼠模型研究表明，丙酸可干擾線粒體代謝，導致線粒體ROS的產生。丙酸與輔酶A結合后生成重要的中間代謝產物丙酰輔酶A，進一步轉化后以琥珀酰輔酶A的形式進入檸檬酸循環(huán)[39]。琥珀酰輔酶A在正常生理濃度下可以提高線粒體基質功能水平，但高濃度的琥珀酰輔酶A抑制檸檬酸合成酶，直接導致線粒體ROS產生。在丙酸存在的情況下，檸檬酸循環(huán)的第一個步驟被抑制，NADH的產量減少導致線粒體呼吸鏈復合物I效率下降，線粒體功能受到影響。有研究表明，添加較高濃度的丙酸，可加劇ROS的產生[40]。其原因是ROS的存在導致細胞內產生活性氮，活性氮可與丙酸反應生成一種能有效抑制線粒體功能的化合物3-硝基丙酸[41]。飼糧中1%～2%的色氨酸可被一些帶有色氨酸酶的梭狀芽孢桿菌、大腸桿菌代謝成五羥色胺和褪黑素[23]。褪黑素的實質是一種內源性的吲哚胺，吲哚胺是強大的抗氧化劑和自由基清除劑，可以保護細胞膜、ETC和線粒體DNA免受氧化損傷。在心血管相關研究中發(fā)現，褪黑素可通過AMPK- PGC-1α- SIRT3信號通路，提高核因子(NRF)和線粒體轉錄因子A(mitochondrial transcription factor A，TFAM)的表達，改善呼吸鏈功能，減少ROS產生，保護心血管。且相比于傳統(tǒng)的抗氧化劑，褪黑素對線粒體的保護作用更具有靶向性[42]。

2.3 腸道微生物及其代謝產物調節(jié)線粒體Ca2+穩(wěn)態(tài)

線粒體 Ca2+穩(wěn)態(tài)與線粒體的能量代謝顯著相關。當線粒體對 Ca2+轉運能力降低時，可導致MMP降低、線粒體 Ca2+攝取減少，從而影響線粒體呼吸鏈的完整性[43]。近年來，研究者們發(fā)現了線粒體和細胞鈣穩(wěn)態(tài)新的生理作用，即線粒體 Ca2+的攝取通過調節(jié)細胞質 Ca2+穩(wěn)態(tài)影響細胞外 Ca2+進入，因此可能影響肌肉收縮、神經元興奮性和細胞遷移功能[44]。線粒體鈣單向轉運體蛋白(mitochondrial calcium uniporter，MCU)介導的線粒體 Ca2+攝取，是由ETC產生的內膜電位驅動的。添加SCFA能夠上調牛瘤胃上皮細胞MCU基因表達水平，從而促進線粒體Ca2+攝取以及ATP產生[45]。研究表明，飼糧添加丁酸鈉通過調控瞬時受體電位亞家族V成員6 (transient receptor potential channel subfamily V member 6, TRPV6)通路增加了小鼠腸道Ca2+水平[46]。腸道菌群在催化精氨酸的過程中，可以產生鳥氨酸和一氧化氮(NO)等物質[47]。鳥氨酸循環(huán)能夠促進線粒體能量代謝，鳥氨酸脫羧酶作為鳥氨酸循環(huán)、多胺合成代謝途中的第一個限速酶[48]，增加了多胺、NO的生成。多胺通過調控細胞Ca2+穩(wěn)態(tài)以及E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的基因表達，維持腸上皮屏障功能以及細胞膜通透性[49]。當腸道中革蘭陰性菌數量增加或腸道屏障受損時，腸道微生物會產生LPS，胡驍飛等[50]通過給肉仔雞腹腔注射500 μg·kg-1(BW) LPS，發(fā)現其對生長性能并無顯著作用，但是對胴體品質和胸肌肉品質產生了不良影響，其原因是LPS誘導線粒體功能損傷、線粒體 Ca2+-ATP酶活性下降，從而影響肌纖維鈣離子轉移系統(tǒng)功能[51]。

綜上所述，腸道微生物定植后調控機體生長發(fā)育，同時，產生大量代謝產物，在維持腸道穩(wěn)態(tài)、輔助動物抵御有害環(huán)境和調控線粒體功能方面具有重要作用。腸道微生物及其代謝產物具有很好地調節(jié)線粒體狀態(tài)的作用，通過影響微生物之間的群體響應和調控、線粒體功能相關蛋白表達等途徑來發(fā)揮作用(圖1)。

圖1 腸道微生物及其代謝產物對線粒體功能的調節(jié)途徑Fig.1 Regulation of mitochondrial function by intestinal microbes and their metabolites

3 腸道微生物對線粒體功能的影響因素

3.1 飼料營養(yǎng)

飼糧種類、水平和結構是影響動物腸道微生物組成和代謝的重要因素。有研究表明，低蛋白質水平(13%)飼糧顯著提高了育肥豬回腸中的消化鏈球菌與梭菌科相對豐度，有助于維持腸道微生物穩(wěn)態(tài)和乙酸的產生，這提示腸道微生物對蛋白質營養(yǎng)的利用與飼糧蛋白質水平相關[52-53]；而高蛋白質水平(23%)飼糧增加仔豬腸道內pH，抑制腸桿菌與乳酸桿菌屬的生成，促進致病微生物的增殖[54]。Ijaz等[55]研究發(fā)現，飼喂高脂飼糧顯著降低小鼠腸道中的阿克曼氏菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌屬豐度以及PGC-1α 蛋白水平，從而抑制線粒體生物合成。Regmi等[56]用不同直鏈淀粉含量(<5%、20%、28%和63%)飼糧飼喂仔豬，發(fā)現飼喂63%直鏈淀粉顯著提高仔豬糞中的乳酸桿菌、雙歧桿菌豐度以及短鏈脂肪酸與丁酸含量。與2.5%粗纖維飼糧水平相比，7.5%粗纖維飼糧水平顯著提高了母豬纖維降解菌豐度和SCFA濃度[57]。Zeitz等[58]發(fā)現，飼喂發(fā)酵木質纖維素粗纖維飼糧可降低肉雞腸道厚壁菌門和乳桿菌屬豐度和微生物代謝產物濃度[59]。添加劑方面，白藜蘆醇、姜黃素等植物提取物具有抗氧化、抗炎等生物功能。給飼喂高脂日糧的大鼠添加白藜蘆醇顯著提高了腸道丁酸產生菌的比例以及SCFA濃度，從而促進線粒體能量代謝水平[60]。姜黃素通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)、核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2related factor，Nrf2)信號通路降低ROS的水平，緩解熱應激誘導的線粒體氧化應激損傷[61]。此外，姜黃素能夠降低仔豬大腸桿菌相對豐度以及Toll樣受體4 (Toll-like receptors 4，TLR4)蛋白表達，從而抑制ROS的產生，最終緩解線粒體功能障礙[62]。

3.2 飼料轉化效率

飼料轉化效率與線粒體功能有著密切關系，相同的環(huán)境和飼糧條件下，與高飼料轉化率肉雞相比，低飼料轉化率肉雞肝線粒體功能和呼吸鏈復合物(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和 Ⅳ)的活性下降及ROS和蛋白質羰基含量升高[63-64]。同樣，與低飼料轉化率羔羊相比，高飼料轉化率羔羊相關的呼吸鏈復合物酶活性顯著下降[65]。轉錄組學分析表明，低剩余采食量豬肌肉中的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶3(glutathione peroxidase 3，GPX3)、過氧化氧化還原蛋白2(peroxiredoxins 6，PRDX6)mRNA水平顯著下降，從而抑制ROS的產生[66]。上述研究表明，動物飼料轉化效率與其線粒體功能密切相關。腸道菌群方面，不同飼料轉化效率肉雞的回腸、盲腸微生群多樣性差異不顯著，但低剩余采食量肉雞盲腸中Oscillibacter、梭狀芽孢桿菌科豐度顯著升高[67]。高飼料轉化率豬盲腸乳桿菌屬和擬桿菌綱中的普雷沃菌屬的相對豐度顯著高于低飼料轉化率豬[68-69]。因此，不同飼料轉化效率畜禽腸道微生物的改變是否參與調節(jié)機體線粒體功能值得進一步探究。

3.3 飼養(yǎng)階段

不同生長階段動物腸道微生物的組成和代謝水平對生長發(fā)育具有重要影響。Liu等[70]研究表明， 哺乳期間仔豬空腸中較高的乳酸桿菌和擬桿菌屬豐度，能夠促進線粒體生物合成相關基因的表達[71]。也有研究發(fā)現，仔豬斷奶后其結腸中Alloprevotella和Oscillibacter相對豐度降低，且肝線粒體功能相關基因泛素氧化酶A2亞基(ubiquinone oxidoreductase subunit A2，NDUFA2)和泛素氧化酶A5亞基(ubiquinone oxidoreductase subunit A5，NDUFA5)mRNA表達水平以及ATP含量顯著降低，表明仔豬斷奶誘導了線粒體氧化應激和功能障礙[72-73]。與妊娠后期相比，哺乳期母豬糞便中的擬桿菌屬豐度顯著增加，這意味著不可消化的飼糧成分可被發(fā)酵并產生SCFA，從而促進線粒體功能相關基因的表達水平[74]。Qi等[75]比較了不同生長階段對豬腸道菌群的影響，發(fā)現6月齡豬腸道中瘤胃球菌科以及有益細菌Oscillospira豐度增加，可促進機體丁酸鹽的產生[76]。肉鴨方面，相比生長后期(6～10周齡)，2～4周齡肉鴨十二指腸與空腸中乳酸乳球菌豐度相對較高，乳酸乳球菌與線粒體轉運蛋白表達水平密切相關，從而為早期生長發(fā)育提供能量[77-78]?？傊煌L階段動物腸道微生物的組成和代謝產物的變化可參與線粒體功能調節(jié)，進而影響宿主生長發(fā)育。

3.4 其他因素

動物機體各種應激可介導腸道微生物菌群及其代謝產物變化進而影響線粒體能量代謝水平。在小鼠上，高溫急性熱應激和中風應激顯著降低腸道乳酸桿菌豐度，并抑制抗氧化活性，從而導致ROS產量的增加以及線粒體氧化損傷[79-80]。高脂日糧誘導的小鼠慢性應激可降低其厚壁菌門與擬桿菌門比例及其代謝產物丁酸和SCFA濃度，從而影響線粒體生物合成[81]。Koncz等[82]發(fā)現，紫外線誘導小鼠腎細胞超氧化物的增加，從而降低線粒體NADH以及 Ca2+水平。日齡方面，研究發(fā)現5月齡豬腸道菌群多樣性隨著月齡增加呈上升趨勢，5月齡后保持穩(wěn)定，但其乳酸桿菌、雙歧桿菌的相對豐度呈降低趨勢[83]。Amit-Romach等[84]采用16S rRNA基因靶向分析4、14、25日齡肉雞腸道微生物多樣性，發(fā)現4日齡肉雞十二指腸和盲腸乳酸菌屬是主要優(yōu)勢菌屬，且其比例隨著日齡增加而增多。已有研究發(fā)現，乳酸桿菌增加可顯著提高腸道短鏈脂肪酸濃度和抗氧化酶活性，并抑制ROS產生，從而影響宿主線粒體功能[85]。

4 小 結

研究腸道微生物與線粒體功能的關系對動物健康有重要意義。目前，研究多側重于腸道微生物及其代謝產物對宿主組織和細胞的影響及其作用機制，需進一步加強對細胞器功能(如線粒體功能)的研究。腸道微生物組成和水平通過何種途徑影響線粒體功能，以及線粒體與腸道微生物對話機制如何實現尚不清楚。因此，今后應加強研究腸道微生物及其代謝產物對宿主線粒體的調節(jié)作用，為飼糧營養(yǎng)手段靶向線粒體功能調控動物生長發(fā)育提供新思路和新方法。