朱砂根葉綠體全基因組解析及系統(tǒng)發(fā)育分析

劉雄偉 劉暢 曾憲法 楊小英 俸婷婷 趙杰宏 周英

（貴州中醫(yī)藥大學藥學院 藥食兩用資源應用與開發(fā)研究中心，貴陽 550025）

朱砂根為紫金牛屬植物朱砂根（Ardisia crenata）的干燥根或根莖，至今有多年的民間藥用歷史，其含有三萜類、黃酮類、香豆素類等多種化學成分，具有清熱解毒、散瘀止痛功效，主要用于治療咽喉腫痛、扁桃體炎等病癥。對本草著作中紫金牛屬藥物進行基原考，《本草綱目》及《圖考》記載的“朱砂根”是指葉背紅色的紅涼傘，其鮮根斷面皮部有多個朱砂色小點［1］。紅涼傘（Ardisia crenatavar.bicolor）與朱砂根在植株外形上無大差別，僅葉背、花梗、花芬及花瓣均帶紫紅色而有所不同，F(xiàn)lora of China中紅涼傘已合并至朱砂根，但僅僅是從形態(tài)學方面判斷紅涼傘為朱砂根的變種尚缺乏科學的依據(jù)。對朱砂根和紅涼傘進行性狀鑒別、顯微鑒別、DNA條形碼、遺傳變異等研究［2-5］，表明朱砂根和紅涼傘親緣關系較近，但已有DNA 條形碼序列分辨率較低，并不能很好地明確物種界限，未能理清朱砂根和紅涼傘的進化演變，對其起源、擴張和遷移的過程，種內(nèi)遺傳變異空間分布與環(huán)境條件關系等尚不清楚，其系統(tǒng)發(fā)育關系尚不明朗。

葉綠體基因組序列的結(jié)構(gòu)、大小和順序相對穩(wěn)定，并且突變率較緩慢［6］，是系統(tǒng)發(fā)育研究和物種鑒定有效工具之一［7］，其突變熱點區(qū)域已經(jīng)被用于物種及物種以下水平（品種）親緣關系研究［8-9］。隨著第二代測序技術（next generation sequencing）的興起，葉綠體基因組在解析植物系統(tǒng)進化發(fā)育關系研究中得到廣泛應用，如青牛膽［10］、白頭翁［11］、牛蒡［12］、罌粟［13］等已經(jīng)完成了葉綠體基因組分析，對其系統(tǒng)發(fā)育和親緣關系進行研究。針對紫金牛屬物種系統(tǒng)發(fā)育關系尚不清楚的問題，對紫金牛屬百兩金Ardisia crispa、走馬胎Ardisia gigantifolia、紐子果Ardisia polysticta、朱砂根A.crenata、紫金牛Ardisia japonica、虎舌紅Ardisia mamillata、雪下紅Ardisia villosa、皺葉紫金牛Ardisia bullata等進行葉綠體基因組測序，解析其物種進化關系，同時發(fā)現(xiàn)紫金牛屬與長柱金牛屬親緣關系較近［14-17］。但關于紫金牛屬歸屬于紫金?？七€是報春花科尚且存在爭議［14-17］，同時2020 版《中國藥典》認為藥材朱砂根為紫金牛科植物朱砂根的干燥根。植物化學方面研究表明紫金?？婆c報春花科在親緣關系上是相近的科（http://www.iplant.cn/info/Primulaceae），將紫金牛屬合并到報春花科，這種分類方法是否科學合理尚缺乏科學依據(jù)。

因此，本研究對不同地區(qū)朱砂根A.crenata、紅涼傘A.crenatavar.bicolor3 個紫金牛屬物種的新鮮葉片進行葉綠體基因組測序，解析其葉綠體基因組序列與結(jié)構(gòu)特征，篩選種間高變異序列；同時下載紫金牛科和報春花科代表性葉綠體全基因組序列信息，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，進而為紫金牛屬藥用植物的分類鑒定、遺傳進化關系及資源開發(fā)利用等提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

朱砂根（貴州）和紅涼傘新鮮葉片采自貴州中醫(yī)藥大學種質(zhì)資源圃，朱砂根（江西）新鮮葉片采自江西武功山，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學魏升華教授鑒定為朱砂根A.crenata、紅涼傘A.crenatavar.bicolor。取新鮮健康葉片，用無菌水沖洗干凈，晾干后置于-80℃冰箱保存。通過NCBI 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索報春花目的紫金?？坪蛨蟠夯频?3 個葉綠體全基因組序列信息，共檢索到紫金?？谱辖鹋?4 個種、蠟燭果屬1 個種、酸藤子屬2 個種、鐵仔屬3 個種及報春花科報春花屬3 個種的信息（表1）。

表1 紫金牛科和報春花科物種的葉綠體基因組GenBank 登記號Table 1 Chloroplast GenBank accession numbers of the species in Myrsinaceae and Primulaceae

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 提取與測序 利用植物基因組DNA 提取試劑盒（TIANGEN，北京）提取總DNA，0.8%瓊脂糖電泳檢測DNA 樣品是否有降解及雜質(zhì)，Nanodrop 分光光度計檢測樣品濃度及純度。檢測合格的DNA 樣品根據(jù)Illumian DNA 文庫構(gòu)建流程，構(gòu)建插入片段大小為350 bp 的雙末端測序文庫。對質(zhì)檢合格測序文庫，利用Illumina Novaseq6000 高通量測序平臺進行測序。測序結(jié)果經(jīng)CASAVA 軟件進行堿基識別（base calling）后轉(zhuǎn)化為原始測序序列（raw reads），利用NGS QC ToolKit 軟件對raw reads 進行質(zhì)控，過濾去除接頭和低質(zhì)量序列，得到高質(zhì)量序列（clean reads）。

1.2.2 葉綠體全基因組序列組裝、拼接與注釋 采用SPAdes v.3.15.2 軟件（http://cab.spbu.ru/software/spades/）對葉綠體基因組序列進行拼接組裝，利用CpGAVAS［18］和ORF Finder 對葉綠體基因組進行注釋。對注釋的初步結(jié)果，運用Blastn 和Blastp 的方法與已報道的近緣物種葉綠體基因組編碼蛋白和rRNA 進行比對，驗證結(jié)果的準確性并進行修正。tRNA 的注釋采用ARWEN［19］軟件進行注釋，生成tRNA 二級結(jié)構(gòu)圖。利用OGDRAW［20］軟件繪制葉綠體基因組環(huán)狀結(jié)構(gòu)圖。

1.2.3 SSR 和重復序列分析 利用MISA 在線軟件（https://webblast.ipk-gatersleben.de/misa/index.php）分析微衛(wèi)星序列（SSR）［21］，參數(shù)閾值設置為：1、2、3、4、5、6，核苷酸參數(shù)為8、4、4、3、3、3，且兩個SSRs 之間的距離不小于100 bp，并對SSRs 的類型、數(shù)量等進行分析。利用REPuter（https://bibis erv.cebitec.uni-bielefeld.de/reputer）在線工具對長重復序列進行分析［22］。

1.2.4 葉綠體全基因組比較及共線性分析 利用mVISTA 軟 件（https://genome.lbl.gov/vista/mvista/submit.shtml）在Shuffle-LAGAN（全局比對模式）下［23］，以本研究新獲得的朱砂根葉綠體基因組為參考，對紫金牛屬其它物種葉綠體全基因組序列同源性進行比較分析；采用 Geneious10.2.2 軟件中Mauve多重基因組比對法檢測紫金牛物種的葉綠體基因組的重排和共線性［24］，包括月月紅A.faberi、虎舌紅A.mamillata、雪下紅A.villosa、走馬胎A.gigantifolia和酸苔菜A.solanacea。

1.2.5 系統(tǒng)進化分析 選擇已發(fā)表的紫金?？迫~綠體基因組為內(nèi)類群和與紫金?？朴H緣關系較近的3個報春花科植物鐘花報春P.sikkimensis、鄂報春P.obconica、騰沖燈臺報春P.chrysochlora為外類群，構(gòu)建最大似然（maximum likelihood，ML）系統(tǒng)發(fā)育樹。利用MAFFT 7（https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/）在線軟件對其葉綠體基因組進行全基因組比對［25-26］，采用IQ-TREE 2.0.5（http://www.iqtree.org/）軟件［27］，基于最大似然法，通過比較不同樣本葉綠體基因組序列的差異構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，25 條序列共包含8 867 個簡約性信息位點（parsimonyinformative），6 759 個自裔位點（singleton sites），136 494 個不變位點（constant sites），構(gòu)樹參數(shù)設置為：-s .fasta -st DNA -m TEST -bb 1 000 -alrt 1 000-abayes，優(yōu)構(gòu)樹模型為：TVM+F+I+G4。

2 結(jié)果

2.1 朱砂根及紅涼傘葉綠體基因組基本特征

葉綠體基因組圖譜顯示朱砂根及紅涼傘葉綠體基因組均為雙鏈環(huán)形結(jié)構(gòu)（圖1），包括大單拷貝區(qū)（large single copy region，LSC）、小單拷貝區(qū)（One small single copy region，SSC）、反向重復區(qū)（reverse repeat regions，IRa）和反向重復區(qū)（reverse repeat regions，IRb）4 個邊界區(qū)，4 個邊界區(qū)長度大小基本一致，GC 含量無差異（表2）。相比于LSC 和SSC區(qū)，IR 區(qū)的GC 含量最高，可能是由于IR 區(qū)含有高GC 含量的RNA 基因造成。

表2 朱砂根及紅涼傘葉綠體基因組基本信息統(tǒng)計Table 2 Basic information statistics of chloroplast genomes between A.crenata and A.crenata var.bicolor

圖1 葉綠體基因組圖譜Fig.1 Chloroplast genome map

2.2 朱砂根及紅涼傘葉綠體基因組功能及分類

在朱砂根和紅涼傘葉綠體全基因組序列中注釋得到132 個基因（表3），包括87 個蛋白編碼基因、37 個tRNA 基因和8 個rRNA 基因，主要分為光合作用基因、復制基因、未知功能基因以及乙酰輔酶A 羧化酶亞基（accD）、成熟酶基因（matK）、其他基因。有 10 個蛋白質(zhì)編碼基因ndhB、rpl2、rpl23、rps12、rps7、ycf15、ycf2，7 個 tRNA 編碼基因及4個 rRNA 編碼基因位于 IR 區(qū)。

表3 朱砂根及紅涼傘葉綠體基因組分類Table 3 Chloroplast genome classification between A.crenata and A.crenata var.bicolor

對葉綠體基因內(nèi)含子進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，共有15 個基因含有內(nèi)含子，其中ycf3和clpP蛋白質(zhì)編碼基因含有 2 個內(nèi)含子。

2.3 朱砂根及紅涼傘葉綠體基因組長重復序列及簡單重復序列分析

利用REPuter 在線工具對的長重復序列進行分析。朱砂根和紅涼傘均有50 個長重復序列，包括正向重復（forward，F(xiàn)）、回文重復（palindrome，P）、反 向重復（reverse，R）和互補重復（complement，C），但其類型個數(shù)稍有不同（表4）。簡單重復序列（simple sequence repeat，SSRs）分析表明（表5），朱砂根共有207 個SSRs 位點，紅涼傘有205 個SSRs位點，均為未發(fā)現(xiàn)六核苷酸重復基序。

表4 朱砂根及紅涼傘葉綠體基因組長重復序列分析Table 4 Analysis of long repeats of chloroplast genome between A.crenata and A.crenata var.bicolor

表5 朱砂根及紅涼傘葉綠體基因組SSR 分析Table 5 Analysis of SSR of chloroplast genome between A.crenata and A.crenata var.bicolor

2.4 朱砂根及紅涼傘葉綠體基因組IR-LSC/SSC 區(qū)的收縮和擴張分析

邊界分析顯示紫金牛屬葉綠體基因組雖然在序列長度、基因組成以及GC 含量等方面相對穩(wěn)定保守，但4 個邊界區(qū)的過渡區(qū)域卻存在有多樣性（圖2）。紫金牛屬8 個物種的IRb-LSC 邊界均位于rps19的編碼區(qū)。走馬胎、月月紅、雪下紅、酸苔菜、虎紅舌、朱砂根（貴州）IRb-SSC 邊界均位于ndhF編碼區(qū)，朱砂根（江西）距ndhF編碼區(qū)5 bp。紫金牛屬8 個物種IRa-SSC 邊界，除了紅涼傘位于ndhF編碼區(qū)外，其他種均位于ycf1基因內(nèi)。走馬胎、月月紅、雪下紅IRa-LSC 邊界均位于rpl2和tRNA 基因間區(qū)內(nèi)，酸苔菜、紅涼傘、朱砂根（江西）位于rpl2和trnH間區(qū)內(nèi)，朱砂根（貴州）位于rps1和trnH基因編碼區(qū)，虎紅舌位于rps19和trnH基因編碼區(qū)。

圖2 葉綠體基因組IR 與 SC 邊界Fig.2 Chloroplast genome IR and SC boundary

2.5 朱砂根及紅涼傘葉綠體基因組序列變異分析

以朱砂根（貴州）作為參考基因組，采用mVISTA 軟件檢測基因重排和倒位的全局比對模式（Shuffle-LAGAN），對紅涼傘、朱砂根（江西）、月月紅、虎紅舌、雪下紅、走馬胎和酸苔菜葉綠體全基因組序列同源性進行比較研究（圖3）。結(jié)果表明，紫金牛屬物種葉綠體基因組LSC、IRa、SSC、IRb四個區(qū)域排列順序較為一致、保守性較高，非基因編碼區(qū)變異程度較高，其中 SSC 區(qū)的變異程度最高；基因編碼區(qū)差異不明顯。紫金牛屬葉綠體基因組中psaB、psbA、psbC、matK、atpA、atpB、rpoC2、rpoC1、ropB、ndhD、ndhF、ndhK、rbcL、accD、ropA等基因的編碼區(qū)存在差異。此外，朱砂根與紅涼傘葉綠體基因組相比，psbA、matK、rpoC2、ropB、ndhK、accD、ndhF、ndhD、ndhH及ycf1等基因的編碼區(qū)存在差異，這些位點為紅涼傘的分子鑒定提供了新的位點資源。

圖3 葉綠體基因組全局比對圖Fig.3 Chloroplast genome global alignment map

2.6 朱砂根及紅涼傘葉綠體基因組共線性分析

采用 Mauve 多重基因組比對法檢測紅涼傘、朱砂根（貴州）、朱砂根（江西）、月月紅、虎紅舌、雪下紅、走馬胎和酸苔菜8 個物種的葉綠體基因組的重排和共線性。通過多重基因組比對法檢測出 8 個物種的葉綠體基因組之間有 5 個局部共線塊（locally collinear block,LCB）（圖4），這表明8 個物種之間的基因組具有高度的相似性。葉綠體全基因組序列的比對顯示，葉綠體基因組之間沒有重排或倒置，從葉綠體基因組4 個組分上看，IR 區(qū)序列變異最低，SSC 區(qū)的變異程度最高。

圖4 葉綠體基因組的共線性分析Fig.4 Covariance analysis of the chloroplast genome

2.7 朱砂根及紅涼傘系統(tǒng)發(fā)育分析

選擇已發(fā)表的紫金?？迫~綠體基因組為內(nèi)類群和與紫金?？朴H緣關系較近的3 個報春花科植物鐘花報春P.sikkimensis、鄂報春P.obconica、騰沖燈臺報春P.chrysochlora為外類群，構(gòu)建ML 系統(tǒng)發(fā)育樹。在系統(tǒng)發(fā)育樹中（圖5），可確定為不包括外類群物種的3 個主要類群：蠟燭果屬和杜莖山屬為一個類群，酸藤子屬為一個類群，紫金牛屬為一個類群，支持率為100%，酸藤子屬和紫金牛屬可能是在蠟燭果屬和杜莖山屬基礎上進化的。這與前人研究略有不同，Xie 等［14］認為紫金牛屬與長柱金牛屬親緣關系較近。基于系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)朱砂根與紐子果親緣關系較近，與已有研究結(jié)果一致［14］。進一步分析發(fā)現(xiàn)，朱砂根與紅涼傘親緣關系最密切，從分子水平為紅涼傘作為朱砂根變種提供了科學解釋。系統(tǒng)進化樹結(jié)果表明，葉綠體基因組構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹可用于紫金牛屬物種植物的鑒定。

圖5 葉綠體基因組序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree constructed from chloroplast genome sequence

3 討論

本研究對不同地區(qū)朱砂根及變種紅涼傘進行葉綠體基因組測序，測序結(jié)果表明三者葉綠體基因組均具有典型的環(huán)狀四分體結(jié)構(gòu)，包括 LSC、SSC、IRa 和IRb 四個區(qū)，其序列總長度、CG 含量、基因數(shù)量基本一致，且IRs 區(qū)序列GC 含量最高。葉綠體基因組包括蛋白編碼區(qū)和非編碼區(qū)，編碼區(qū)包含100-120 類不同的基因,涉及光合作用、復制等作用［28］，朱砂根和紅涼傘葉綠體全基因組序列中注釋得到132 個基因，包括87 個蛋白編碼基因、37 個tRNA 基因和8 個rRNA 基因。葉綠體基因組的突變不是隨機的，而是存在突變熱點區(qū)域，這些突變熱點區(qū)域已經(jīng)被用于物種及物種以下水平（品種）親緣關系研究［8-9］。通過對變異位點的分析，發(fā)現(xiàn)psaB、psbA、psbC、matK、atpA、atpB、rpoC2、rpoC1、ropB、ndhD、ndhF、ndhK、rbcL、accD、ropA、ccsA、ycf2及ycf1等基因的編碼區(qū)存在差異，為該屬的分子鑒定奠定了基礎。

葉綠體基因標記物，如簡單重復序列（simple sequence repeats,SSRs）己經(jīng)被用于基因流、種群分化和遺傳多樣性研究［29］。本研究從朱砂根葉綠體基因組中共檢測到207 個 SSR 位點，SSR 以單核苷酸重復為主，且隨著拷貝數(shù)目增加，SSR 數(shù)量明顯減少，朱砂根和紅涼傘的SSR 位點類型和數(shù)量基本一致，但略有不同，可為朱砂根分子標記開發(fā)或基原鑒定提供理論依據(jù)。朱砂根葉綠體基因組序列中單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸SSR 類型分別以A/T、AT/TA、AAT/ATT 為主，表明朱砂根葉綠體基因組序列中SSRs 主要由polyA 或 polyT 所構(gòu)成，與已有研究結(jié)果結(jié)論一致［30］。

Liu 等［31］利用形態(tài)特征和matK 分子標記對24種紫金牛屬的親緣關系進行研究，但由于形態(tài)特征不穩(wěn)定和遺傳信息不足，仍不能推斷紫金牛屬物種親緣關系。而完整的葉綠體基因組序列具有更高的分辨率，可以用于紫金牛屬物種鑒定及進化的分析，Xie 等［14］認為紫金牛屬與長柱金牛屬親緣關系較近。這與本文的研究結(jié)果不同，系統(tǒng)進化樹表明紫金牛屬可能是在蠟燭果屬和杜莖山屬基礎上進化的，支持率為100%。同時Xie 等［14］認為紫金牛屬為報春花科，但亦有說法紫金牛屬為紫金?？?。植物化學方面研究表明紫金?？婆c報春花科在親緣關系上相近的科，目前紫金牛屬已合并到報春花科（http://www.iplant.cn/info/Primulaceae）。但本研究構(gòu)建的葉綠體系統(tǒng)發(fā)育樹，通過支持率可將紫金?？坪蛨蟠夯品譃閮蓚€分支，紫金牛屬是否可以劃分為報春花科值得進一步商榷，需要進一步結(jié)合貝葉斯樹及溯祖理論進行分析。

對朱砂根原植物的考證［32］，認為紅涼傘更符合《本草綱目》記載的朱砂根，吳征鎰認為紅涼傘與朱砂根在植株外形上無大差別，僅葉背、花梗、花芬及花瓣均帶紫紅色而有所不同，二者作為兩個單獨種并不適當，因此將紅涼傘作為朱砂根的變種，在最新版的Flora of China中紅涼傘已合并至朱砂根。葉綠體基因組系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，朱砂根與紅涼傘親緣關系最為親密，在朱砂根的基礎上進化，這也為紅涼傘作為朱砂根變種提供了科學解釋。

4 結(jié)論

基于Illumina 測序平臺對不同地區(qū)朱砂根及變種紅涼傘葉綠體全基因組進行測序，psbA、matK、rpoC2、ropB等基因編碼區(qū)存在差異，為朱砂根和紅涼傘的分子鑒定提供了新的位點資源。系統(tǒng)發(fā)育表明朱砂根與紅涼傘親緣關系最為親密，紫金牛屬可能是在蠟燭果屬和杜莖山屬基礎上進化，為進一步研究紫金牛屬藥用植物的分子進化和親緣關系提供了充分的信息。但需要進一步結(jié)合貝葉斯樹及溯祖理論探討紫金牛屬與報春花科之間的關系，以明確紫金牛屬的劃分。