瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病菌拮抗細(xì)菌的篩選及其抑菌作用

張玲 張榮意 劉盛科 譚志瓊

（海南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，?？?570228）

哈密瓜為葫蘆科植物，口味清爽、甘甜多汁，有“瓜中之王”的美稱。隨著19世紀(jì)20年代哈密瓜無(wú)土栽培技術(shù)的推廣，哈密瓜逐漸成為了海南省的重要經(jīng)濟(jì)作物。在哈密瓜的生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)伴隨著多種病害的發(fā)生，其中細(xì)菌性果斑?。╞acterial fruit blotch,BFB）又稱細(xì)菌性果腐病，是一種由西瓜噬酸菌（Acidovorax citrulli）引起的毀滅性病害。我國(guó)新疆、內(nèi)蒙古、海南、云南、福建等地均有該病害發(fā)生的報(bào)道，其主要危害哈密瓜的葉片（子葉及真葉）和果實(shí)（幼果和成熟果），對(duì)哈密瓜種植業(yè)造成了極其嚴(yán)重的影響［1］。

目前，瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病的防治主要以化學(xué)防治為主，如利用1%的鹽酸、200 倍的15%過(guò)氧乙酸［2］或300 mg/L 的3%噻霉酮WP［3］處理種子后，可有效除去種子表面的病原菌。在出苗后可采用90%新植霉素可溶性粉劑和3%噻霉酮、47%春雷·王銅對(duì)哈密瓜苗期進(jìn)行噴霧［4］，可有效地防治細(xì)菌性果斑病的發(fā)生。在日常生產(chǎn)中，使用化學(xué)農(nóng)藥防治病害十分普遍，但卻很難做到科學(xué)合理地施用化學(xué)農(nóng)藥，且長(zhǎng)期施用化學(xué)農(nóng)藥會(huì)帶來(lái)環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留以及病原菌產(chǎn)生抗藥性等一系列問(wèn)題，威脅人畜健康，亟需探索生物防治措施［5］。

生物防治因具有環(huán)境友好、無(wú)毒無(wú)殘留、不傷害非靶標(biāo)微生物、防病持效期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，備受學(xué)者關(guān)注，是植物病害防治新的研究熱點(diǎn)。BFB 生物防治常用菌株為酵母菌（Pichia anomala Kurtzman）、熒光假單胞菌工程菌株（Pseudomonas fluorescence）和芽孢桿菌（Bacillus）等，國(guó)內(nèi)研究防治BFB 的生防菌以芽孢桿菌居多。武芳等［6］使用篩選出的芽孢桿菌在哈密瓜種植區(qū)域進(jìn)行拮抗菌株對(duì)哈密瓜植株促生、防效等研究，結(jié)果顯示，每株拮抗菌對(duì)哈密瓜植株不僅有促生作用，而且均能不同程度地預(yù)防細(xì)菌性果斑病的發(fā)生，防治效果可達(dá)到 19.98%-50.42%。謝心悅等［7］篩選出解淀粉芽孢桿菌BJ-10，其對(duì)甜瓜白粉病和甜瓜細(xì)菌性果斑病均具有較高的防效。芽孢桿菌以其優(yōu)秀的定殖［8］、抗逆以及能抑制多種植物病害的能力成為生物防治的重要材料［9］。目前對(duì)于真菌性病害的研究較多，而細(xì)菌性病害研究較少。已有研究表明，不同的菌株其生長(zhǎng)特性不同，如溫度、pH 以及營(yíng)養(yǎng)條件等因素均會(huì)顯著影響芽孢桿菌的生長(zhǎng)情況［10-11］，從而影響其對(duì)病原菌的拮抗效果。因此，明確菌株的生長(zhǎng)條件以及廣譜性，更有利于菌株的田間應(yīng)用以及開(kāi)發(fā)出適用于海南熱帶地區(qū)的生物菌制劑。

近年來(lái)，隨著海南哈蜜瓜種植面積擴(kuò)大，哈密瓜細(xì)菌性果斑病發(fā)生愈發(fā)嚴(yán)重，化學(xué)農(nóng)藥用量的增加，導(dǎo)致哈密瓜生產(chǎn)食品安全隱患愈發(fā)突出，生物防治措施亟待完善。本研究通過(guò)試驗(yàn)篩選出對(duì)細(xì)菌性果斑病效果較好的生防菌，并確定菌株的最佳培養(yǎng)條件、抑菌活性以及防治效果，為菌株后續(xù)的開(kāi)發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品 實(shí)驗(yàn)樣品采集自海南省昌江、東方、三亞和陵水等哈密瓜大棚的根際土壤，用密封袋密封后于4℃保存，48 h 內(nèi)對(duì)土壤細(xì)菌進(jìn)行分離。

1.1.2 供試菌株 西瓜噬酸菌A.citrulli、荔枝霜疫霉Peronophythoralitchii、火龍果炭疽病病菌Colletotrichum gloeosporioides、黃瓜葉斑病病菌Pseudonwnas cichorii、小麥赤霉病病菌Fusarium graminearum、甜瓜蔓枯病病菌Didymella bryoniae，由海南大學(xué)微生物資源開(kāi)發(fā)與利用實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，水1 000 mL，pH 7.2。LB 培養(yǎng)基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，水1 000 mL，pH 7。NB 培養(yǎng)基：聚蛋白胨5 g，酵母提取物1 g，牛肉浸膏3 g，蔗糖15 g，水1 000 mL，pH 7.0。KB 培養(yǎng)基：蛋白胨20 g，甘油10 mL，K2HPO41.5 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，水1 000 mL，pH 7.2。PDB 培養(yǎng)基：土豆200 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL。固體培養(yǎng)基：上述液體培養(yǎng)基＋18 g 瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 土壤細(xì)菌的分離 采用平板稀釋法［12］進(jìn)行分離，稱取5 g 土樣，加入45 mL 無(wú)菌水中，振蕩培養(yǎng)30 min，靜置5 min 后，吸取100 μL 的土壤懸浮液于900 μL 的無(wú)菌水中，依次進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)?02、103、104），分別吸取稀釋倍數(shù)為102、103和104的土樣懸浮液100 μL 到牛肉膏平板中，用無(wú)菌涂布棒涂布，28℃恒溫培養(yǎng)2 d，挑取形態(tài)、大小、顏色不同的菌落多次純化后保藏備用。

1.2.2 拮抗菌的篩選 以西瓜噬酸菌為指示菌，篩選有拮抗作用的生防菌［13］。在融化并冷卻至50℃的LB 培養(yǎng)基中加入3 mL 濃度為1×108CFU/mL 病菌菌液，混勻后倒平板，將分離出的細(xì)菌等距離接種于平板上，28℃恒溫培養(yǎng)，2 d 后觀察有無(wú)抑菌圈生成，采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。篩選出抑菌作用強(qiáng)的菌株接種至斜面試管培養(yǎng)基中，4℃下保藏菌種。

1.2.3 拮抗菌的鑒定

1.2.3.1 形態(tài)特征和革蘭氏染色反應(yīng) 采用平板劃線法將獲得的具有抗細(xì)菌性果斑病菌的菌株131、791 接種于牛肉膏培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)24 h 至長(zhǎng)出單菌落，觀察菌落形狀，顏色和大小等。挑取培養(yǎng)至14 h 的兩株菌株，進(jìn)行革蘭氏染色，并在光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)和染色反應(yīng)。

1.2.3.2 生理生化特征測(cè)定 參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［14］的方法進(jìn)行接觸酶、氧化酶、明膠液化、V-P 試驗(yàn)、碳氮源利用等生理生化實(shí)驗(yàn)測(cè)定。

1.2.3.3 16S rRNA 和gyrB 基因特征 使用EZNA?Bacteria DNA Kit（Omega）提取兩株細(xì)菌的基因組DNA，提取的基因組DNA 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后用于PCR 擴(kuò)增。PCR 的引物及反應(yīng)條件見(jiàn)表1［15-16］。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)符合要求，送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast 比對(duì)，下載相似性高的序列，使用MEGA 7.0 軟件利用鄰接法（neighbor-joining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Bootstrap 為1 000［17］。

1.2.4 生長(zhǎng)曲線測(cè)定 將菌株131、791 分別刮取單個(gè)菌落，接種至牛肉膏液體培養(yǎng)基，恒溫培養(yǎng)12 h，作種子液備用。將種子液分別接種至牛肉膏液體培養(yǎng)基，在28℃、180 r/min 的條件下振蕩培養(yǎng)24 h。每隔2 h 取樣，用分光光度計(jì)測(cè)量其OD600的值，重復(fù)3 次，并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 生長(zhǎng)條件的測(cè)定

1.2.5.1 最佳培養(yǎng)基的篩選 按2%的接種量將種子液分別加入100 mL 的牛肉膏、LB、NB、KB、PDB培養(yǎng)基中，在28℃、180 r/min 的條件下?lián)u培至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，分別測(cè)量其OD600值。

1.2.5.2 最佳pH 的篩選 按2%的接種量將種子液分別加入100 mL pH 梯度為3、4、5、6、7、8、9、10 的牛肉膏培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min 搖培至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，分別測(cè)量其OD600值。

1.2.5.3 最佳培養(yǎng)溫度的篩選 按2%的接種量將種子液分別加入100 mL 溫度梯度為25、28、31、34、37 和40℃牛肉膏培養(yǎng)基中，180 r/min 搖培至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，分別測(cè)量其OD600值。

1.2.5.4 最佳接種量的篩選 將0.2%、0.5%、1%、2%、10%的種子液分別接種至100 mL 牛肉膏培養(yǎng)基中，在28℃、180 r/min的條件下?lián)u培至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，分別測(cè)量其OD600值。

1.2.6 防病試驗(yàn)

1.2.6.1 離體葉片防病試驗(yàn) 采用針刺接種法［18］，挑取生長(zhǎng)狀況一致的哈密瓜葉片，表面消毒后洗凈晾干，用無(wú)菌針頭在葉片背后葉脈兩邊各刺3 處接種點(diǎn)，用注射器從葉片的針刺部位緩慢注射接種菌液，實(shí)驗(yàn)分為兩組處理：（1）先接種131 菌液，后接種BFB 菌液；（2）先接種791 菌液，后接種BFB菌液。以只接種BFB 菌液和只接種水為對(duì)照組，葉片置于水瓊脂平板上培養(yǎng)，3 d 后開(kāi)始逐日觀察發(fā)病情況，于處理后的第7 天統(tǒng)計(jì)并計(jì)算防效。

1.2.6.2 室內(nèi)盆栽防病試驗(yàn) 選取若干長(zhǎng)至2-3 片真葉的哈密瓜盆栽幼苗，采用葉面噴施法分別接種A.citrulli、菌株131、791，清水處理為空白對(duì)照。處理組1：先將1×108CFU/mL 生防菌株菌液噴施于真葉的正反面，1 h 后噴施同等濃度的病菌菌液。處理組2：只噴BFB 菌液，平行試驗(yàn)3 次，噴施后逐日觀察發(fā)病情況，于處理后的第7 天統(tǒng)計(jì)并計(jì)算防效。病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參考李新宇等［19］方法并略作修改，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。

表2 病情等級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Classification criteria of disease grade

1.2.7 抑菌作用測(cè)試 采用平板對(duì)峙法［20］測(cè)定菌株131、791 對(duì)荔枝霜疫霉、火龍果炭疽病病菌、黃瓜葉斑病病菌、小麥赤霉病病菌、甜瓜蔓枯病病菌等5 種病原真菌的拮抗效果，將直徑7 mm 的病原真菌菌餅倒扣至PDA 平板中央，距離菌餅2.5 cm 處接種待測(cè)細(xì)菌，每個(gè)處理重復(fù)4 次，以只接病原真菌的平板作對(duì)照，28℃恒溫培養(yǎng)至病菌長(zhǎng)滿對(duì)照組的培養(yǎng)皿，十字交叉法測(cè)量病原真菌的對(duì)照組菌落直徑、處理組直徑，并計(jì)算抑菌率。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 采用Excel 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、作圖，采用SPSS 軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 拮抗菌的篩選

從土樣中共分離出196 株細(xì)菌，通過(guò)平板對(duì)峙法篩選出具有明顯抑制圈的拮抗菌株共20 株，其中編號(hào)為131、791 的兩株細(xì)菌對(duì)哈密瓜果斑病菌具有較強(qiáng)的平板拮抗效果，平板抑菌直徑分別為（19.03±0.13）mm，（17.55±0.29）mm（圖1）。

圖1 兩株拮抗菌對(duì)西瓜噬酸菌的抑制效果Fig.1 Inhibitory effects of two strains on A.citrulli

2.2 形態(tài)學(xué)觀察和生理生化鑒定

圖2為菌株131、791 的菌落形態(tài)圖及革蘭氏染色圖。菌株131 在牛肉膏培養(yǎng)基上菌落為白色，不透明，菌落邊緣呈波浪狀，頂端光滑凸起，中心呈淡黃色。菌體呈藍(lán)紫色、桿狀，為革蘭氏陽(yáng)性菌株。菌株791 在牛肉膏培養(yǎng)基上菌落呈乳白色、有黏性、不透明、邊緣不規(guī)則、表面光滑。菌體呈藍(lán)紫色、桿狀，革蘭氏染色結(jié)果為陽(yáng)性。

圖2 菌株131、791 的菌落圖及革蘭氏染色圖Fig.2 Colony and Gram stain of strain 131 and 791

表3結(jié)果表明，菌株131、791 均為好氧菌，接觸酶、氧化酶、明膠液化、淀粉水解、MR 和V-P試驗(yàn)等生理生化測(cè)定結(jié)果均為陽(yáng)性，兩株菌株均可在2%-10%的NaCl 培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，綜合形態(tài)學(xué)和生理生化結(jié)果與《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行對(duì)照，將菌株131、791 初步判定為芽孢桿菌屬細(xì)菌。

表3 菌株131、791 的生理生化鑒定結(jié)果Table 3 Physiological and biochemical identification results of strain 131 and 791

2.3 16S rRNA基因和gyrB基因鑒定

菌株131、791 的16S rRNA 基因序列長(zhǎng)度分別為1 453 bp、1 453 bp，gyrB 基因序列長(zhǎng)度分別為1 187 bp、1 189 bp（圖3）。圖4、圖5分別為菌株131、791 的16S rRNA 基因和gyrB 基因的聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。通過(guò)blast 比對(duì)，菌株131 與沙福芽孢桿菌（Bacillus safensis）相似度為99%，在16S rRNA 基因和gyrB 基因的進(jìn)化樹(shù)上也都與B.safensis位于同一分支。菌株791 與貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）相似度為98%，與B.velezensis在進(jìn)化樹(shù)中位于同一分支，且分支值高達(dá)98。綜合形態(tài)學(xué)、生理生化和16S rRNA 基因、gyrB 基因等多方面特征結(jié)果，將菌株131 鑒定為沙福芽孢桿菌，菌株791 為貝萊斯芽孢桿菌。

圖3 菌株131、791 的16S rRNA 基因電泳圖（A）和gyrB 基因電泳圖（B）Fig.3 16S rRNA gene electropherogram (A) and gyrB gene electropherogram (B) of strain 131 and 791

圖4 菌株131 基于16S rRNA 基因和gyrB 基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of strain 131 based on 16S rRNA genes and gyrB genes

圖5 菌株791 基于16S rRNA 基因和gyrB 基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of strain 791 based on 16S rRNA genes and gyrB genes

2.4 生長(zhǎng)曲線

菌株131、791 在前6 h 為延緩期，在8-12 h 生長(zhǎng)迅速，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，到18 h 菌量均到達(dá)最大值并進(jìn)入穩(wěn)定期（圖6）。

圖6 菌株131、791 的生長(zhǎng)曲線Fig.6 Growth curves of strain 131 and 791

2.5 生長(zhǎng)條件的測(cè)定

菌株131 在NB 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)量最大，OD600值可高達(dá)1.76；菌株791 在KB 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀況最好，OD600值為1.43（圖7-A）。菌株131 在pH 3-5的時(shí)候生長(zhǎng)量小，在pH 7 時(shí)達(dá)到最大值；菌株791的pH 生長(zhǎng)范圍為pH 5-9，且在pH 為6 時(shí)，菌量達(dá)到最大值（圖7-B）。菌株131、791 在25-40℃時(shí)均可生長(zhǎng)，且最適生長(zhǎng)溫度均為37℃（圖7-C）。菌株131 在接種量為2%時(shí)生長(zhǎng)最好，菌株791 在接種量為1%時(shí)生長(zhǎng)量最大（圖7-D）。

圖7 菌株131、791 在不同條件下的生長(zhǎng)狀況Fig.7 Growth status of strain 131 and 791 under different conditions

2.6 防病試驗(yàn)

如圖8所示，只接種BFB 菌液的葉片從第3天開(kāi)始出現(xiàn)病斑，病斑面積約占整個(gè)葉片面積的49.26%，而接種了生防菌液的葉片，從第5 天才開(kāi)始出現(xiàn)病斑，且病斑明顯減少，其對(duì)哈密瓜細(xì)菌性果斑病的防效分別為83.33%和87.53%。

圖8 兩株生防菌對(duì)哈密瓜細(xì)菌性果斑病的離體葉片效果Fig.8 Effects of two biocontrol bacteria on the isolated leaves of bacterial fruit blotch of cantaloupe

2.7 室內(nèi)盆栽防效

盆栽試驗(yàn)結(jié)果如表4和圖9所示，只接種BFB菌液的處理組哈密瓜幼苗真葉及子葉出現(xiàn)明顯的水漬狀壞死斑，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)葉緣干枯萎縮，植株生長(zhǎng)明顯較CK 差，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析得到病情指數(shù)為77.41，發(fā)病較嚴(yán)重。同時(shí)接種生防菌菌液和BFB 菌菌液處理組幼苗葉片無(wú)明顯的壞死斑點(diǎn)，少數(shù)葉片存在水漬狀小斑點(diǎn)，葉緣無(wú)干枯壞死現(xiàn)象，葉片伸展正常，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，分別同時(shí)接種131、791 和BFB 病菌處理組的病情指數(shù)依次為23.33、17.04，較只接種BFB 菌菌液處理組，植株發(fā)病情況明顯改善。上述結(jié)果表明，BFB 病原菌對(duì)哈密瓜幼苗的生長(zhǎng)具有明顯的危害，癥狀為水漬狀壞死斑，嚴(yán)重時(shí)呈干枯狀壞死，接種生防菌菌液后，植株病情指數(shù)明顯降低，發(fā)病情況得到抑制，在室內(nèi)盆栽中，菌株131、791具有較好的防治哈密瓜果斑病的效果，盆栽防效分別達(dá)69.86%、77.99%。

圖9 兩株菌株對(duì)細(xì)菌性果斑病的盆栽防治效果Fig.9 Control efficacy of two strains against BFB in potting

表4 菌株131 和791 的盆栽防病效果Table 4 Control efficacy of strain 131 and 791 in potting

2.8 兩株拮抗菌對(duì)其它植物病原菌的抑菌作用

菌株131 和菌株791 對(duì)供試的5 株農(nóng)業(yè)病原菌的抑菌結(jié)果見(jiàn)表5。經(jīng)測(cè)定，所有對(duì)照組菌落直徑均為85.00 mm。菌株131 對(duì)荔枝霜疫霉、火龍果炭疽病病菌、黃瓜葉斑病病菌表現(xiàn)出抑菌作用，其中對(duì)荔枝霜疫霉的抑制效果最好，抑菌直徑為12.00 mm，抑菌率為14.12%，對(duì)其他病菌無(wú)活性。菌株791 對(duì)5 株農(nóng)業(yè)病原菌均表現(xiàn)出不同程度的抑菌活性，其中對(duì)黃瓜葉斑病病菌的抑菌效果最好，抑菌直徑可達(dá)21.25 mm，抑菌率為25.00%。

表5 菌株131、791 對(duì)其它病原菌的抑菌作用Table 5 Inhibition percentage of strain 131，791 against other pathogen

3 討論

3.1 芽孢桿菌分離篩選的重要性

芽孢桿菌屬（Bacillus）是植物表面、根際和土壤中重要的微生物種群，能夠產(chǎn)生抗逆性孢子，是研究人員制成生物制劑的第一選擇，有著促進(jìn)生長(zhǎng)和有效拮抗多種病害的作用［21］。枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）、短小芽孢桿菌（B.pumilus）等均已用于防治細(xì)菌性果斑病，但關(guān)于貝萊斯芽孢桿菌對(duì)BFB 防治還鮮有研究，貝萊斯芽孢桿菌是近年來(lái)芽孢桿菌屬的一株新種，既有促生作用、又有生防作用，還能產(chǎn)生多種酶類(lèi)和抑菌活性物質(zhì)［22］，如表面活性素（surfactin）、伊枯草菌素（iturin）、芬薺素（fengycin）等具有廣譜抑真菌活性的脂肽類(lèi)物質(zhì)［23-24］。已有研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌對(duì)黃瓜灰霉病菌Botrytis cinerea［25］、花生白絹病菌Sclerotium rolfsii、玉米黑曲霉病Aspergillus niger［26］、梨灰霉病菌Botrytis cinerea和青霉病菌Penicillium expansum［27］均有顯著的抑菌效果。本試驗(yàn)以哈密瓜細(xì)菌性果斑病病原菌作為靶向菌，篩選出2 株拮抗作用較強(qiáng)的細(xì)菌，其盆栽防效分別為69.86%、77.99%，其中菌株791 對(duì)BFB 的離體葉片防治效果最佳且具有良好的穩(wěn)定性，對(duì)荔枝霜疫霉、火龍果炭疽病病菌和黃瓜葉斑病病菌等病菌都有很強(qiáng)的拮抗效果，說(shuō)明菌株791 不僅能產(chǎn)生可以有效拮抗植物病原真菌的脂肽類(lèi)物質(zhì)，還能產(chǎn)生有效防控細(xì)菌性植物病害的活性物質(zhì)，極具開(kāi)發(fā)成微生物農(nóng)藥的潛力。

3.2 芽孢桿菌鑒定的可靠性

芽孢桿菌屬種主要根據(jù)生理生化特性和16S rRNA 基因序列分析進(jìn)行鑒定，但是由于沙福芽孢桿菌（B.safensis）和貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）無(wú)論從表型還是系統(tǒng)發(fā)育來(lái)說(shuō)與枯草芽孢桿菌（B.

subtilis）、解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）親緣關(guān)系都非常接近。對(duì)該類(lèi)菌株準(zhǔn)確鑒定的難度越來(lái)越大，因此將傳統(tǒng)鑒定方法與分子生物學(xué)方法相結(jié)合，才能對(duì)該類(lèi)菌株進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定［28］，本研究采用形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性測(cè)定與16S rRNA 基因以及gyrB 基因序列分析相結(jié)合的方法，最終將菌株131 鑒定為沙福芽孢桿菌，菌株791 鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。

3.3 不同條件對(duì)芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是微生物菌群生長(zhǎng)以及繁殖的必須條件，并且為其代謝產(chǎn)物提供了原料。研究表明，最適的培養(yǎng)條件可以增加菌量，從而產(chǎn)生更多的活性物質(zhì)來(lái)提高防效［29］，因此，為生防菌提供合適的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并提供最適的生長(zhǎng)條件是非常有必要的。在本研究中已明確了兩株菌株的最佳生長(zhǎng)條件，為后續(xù)菌株化合物的分離實(shí)驗(yàn)提供一定的參考價(jià)值，但菌株的最佳生長(zhǎng)條件能否等于菌株產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的優(yōu)化條件，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證［30］。梁艷瓊等［31］以菌量和無(wú)菌發(fā)酵液的抑菌活性作為指標(biāo)，采用單因素和正交試驗(yàn)對(duì)菌株JNC2 進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，結(jié)果顯示，該菌株的最佳生長(zhǎng)條件等于產(chǎn)生活性物質(zhì)的最佳發(fā)酵條件。而洪鵬等［32］在優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciensHF 01 的發(fā)酵過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基成分中不同的無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌體生長(zhǎng)和活性物質(zhì)的產(chǎn)生的影響不同，MgSO4能使菌量達(dá)到最大值，CaCl2能使抑菌圈直徑達(dá)到最大值，說(shuō)明每株菌株都有自己的生長(zhǎng)特性，后續(xù)需對(duì)生長(zhǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，希望在今后的實(shí)驗(yàn)中能進(jìn)一步對(duì)其活性物質(zhì)進(jìn)行分離純化，并且開(kāi)展田間防治研究等。

4 結(jié)論

從哈密瓜根際土壤中分離得到196 株細(xì)菌，其中菌株131、791 具有較好拮抗BFB 病原菌效果，其抑菌直徑分別為（19.03±0.13）mm，（17.55±0.29）mm。經(jīng)鑒定，菌株131 為沙福芽孢桿菌（Bacillus safensis），菌株791 為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。菌株131、791 對(duì)BFB 室內(nèi)盆栽防效分別為69.86%、77.99%，還對(duì)黃瓜葉斑病病菌等5 種病原真菌具有較好的抑菌效果。