缺氧調(diào)控耳蝸聽(tīng)神經(jīng)元電壓門(mén)控性鉀通道的表達(dá)*

馮 爽，劉少鋒，周佳霖，黃振云，羅仁忠，孫昌志

(廣州市婦女兒童醫(yī)療中心耳鼻咽喉科，廣東 廣州 510120)

耳蝸缺氧性損傷是新生兒缺氧性腦病常見(jiàn)的并發(fā)癥，可引起中到重度感音神經(jīng)性耳聾。此外，耳蝸組織缺血缺氧，同樣是眾多感音神經(jīng)性耳聾，如噪音性聾、突發(fā)性聾、藥物性聾等的病理生理學(xué)機(jī)制之一。因此，探索缺氧后耳蝸損傷的機(jī)制，對(duì)耳聾防治具有重要的臨床治療指導(dǎo)意義。已知聽(tīng)神經(jīng)元對(duì)缺氧十分敏感，缺氧程度越重，持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)聽(tīng)神經(jīng)元不可逆的損害越嚴(yán)重，聽(tīng)力恢復(fù)也越困難。缺氧后可導(dǎo)致耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(spiral ganglion neurons,SGN)水腫、壞死，聽(tīng)神經(jīng)傳入纖維大量崩解及缺失，損傷SGN。SGN的損傷程度與缺氧時(shí)間呈正比[1]?？梢?jiàn)SGN是缺氧引起耳蝸損傷的靶器官之一。最近研究還發(fā)現(xiàn)，缺氧后可影響聽(tīng)神經(jīng)元的興奮性。SGN急性缺氧后，可增強(qiáng)其外向鉀電流，促進(jìn)鉀離子外流到細(xì)胞外，使SGN細(xì)胞膜電位超極化，影響聽(tīng)神經(jīng)動(dòng)作電位發(fā)放頻率[2]?？梢?jiàn)，缺氧可影響聽(tīng)神經(jīng)動(dòng)作電位。缺氧對(duì)SGN外向鉀電流的促進(jìn)過(guò)程，主要通過(guò)TEA敏感的大電導(dǎo)鈣激活鉀通道電流(BKCa)介導(dǎo)，但對(duì)SGN電壓門(mén)控性鉀通道(Kv)電流無(wú)明顯影響，可能并不作用于Kv電流。然而，在中樞神經(jīng)缺氧后可影響Kv的表達(dá)及功能，而且該作用具有亞型特異性的特點(diǎn)，不同的Kv亞型有不同的表現(xiàn)，如缺氧可增大Kv2.1的電流大小，并使其在神經(jīng)元的表達(dá)定位發(fā)生變化，使細(xì)胞膜電位超極化而抑制神經(jīng)元的興奮性；對(duì)于Kv4.2和Kv4.3，缺氧后則降低其在神經(jīng)元的表達(dá)，并抑制電流大小，促進(jìn)細(xì)胞膜去極化而增強(qiáng)神經(jīng)元興奮性[3-5]。目前尚不明確缺氧后對(duì)SGN Kv表達(dá)的作用特點(diǎn)。已知Kv1.1、Kv1.2和Kv3.1均在SGN表達(dá)，可介導(dǎo)聽(tīng)神經(jīng)動(dòng)作電位的產(chǎn)生和傳導(dǎo)，確保維持正常聽(tīng)力[6]。因此，本研究將探討缺氧后SGN Kv1.1、Kv1.2和Kv3.1表達(dá)的特點(diǎn)，明確缺氧對(duì)SGN Kv表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1材料 SD大鼠由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，出生后3～5 d，不論雄雌。

1.2方法

1.2.1SGN的原代培養(yǎng) 大鼠斷頭處死后，取出耳蝸，迅速置于4 ℃ Hank′s平衡鹽溶液中，在立體顯微鏡下，打開(kāi)耳蝸，剝離螺旋韌帶、血管紋及Corti′s器，將螺旋神經(jīng)節(jié)組織切碎，置入0.25%胰蛋白酶中，37 ℃下孵育10 min。吸去胰酶并終止消化，吹打后收集上清液，離心后再棄去上清液，細(xì)胞重懸后，種植到裝有預(yù)熱好的DMEM/F12+10%FBS培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)24 h后，給予缺氧處理。

1.2.2缺氧處理及分組 將載有SGN的培養(yǎng)皿隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組置于缺氧罐內(nèi)(“無(wú)氧環(huán)境”下)培養(yǎng)24 h(37 ℃，氣體濃度為95%N2、5%CO2、O2<0.5%)。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR) 利用Trizol法分別提取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的總RNA,隨后將提取到的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以ACTB為內(nèi)參，在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，ACTB的上游引物序列為5′- TCAGCAAGCAGGAGTACGATG-3′；下游引物序列為5′- GTGTAAAACGCAGCTCAGTAACA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為88 bp。Caspase-3上游引物序列為5′- GAGCTTGGAACGCGAAGAAA-3′，下游引物序列為5′-AGTCCATCGACTTGCTTCCA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為112 bp。Kv1.1α亞單位的上游引物序列為5′-GCCGCAGCTCCTCTACTATC-3′，下游引物序列為5′-CCTGCCTGTAGTGGGCTATG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為84 bp。Kv1.2α亞單位的上游引物序列：5′-AGTGAGAAGATGTGACGGGAC-3′，下游引物序列為5′-GGAGCTGAGGTTCTCTTCCTTG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為85 bp。Kv3.1α亞單位的上游引物序列為5′-TACGGACCCTGCTTCCTCTT-3′，下游引物序列為5′-TGCAAAGATCCTTTCTCATTCCT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為76 bp。將擴(kuò)增完畢的cDNA，按照qPCR法進(jìn)行定量分析，結(jié)果重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1缺氧對(duì)caspase-3在SGN表達(dá)的影響 原代培養(yǎng)的SGN進(jìn)行無(wú)氧處理24 h后，收集細(xì)胞。提取全部RNA后，qPCR結(jié)果顯示凋亡執(zhí)行因子caspase-3 mRNA在SGN的表達(dá)出現(xiàn)明顯上調(diào)，與對(duì)照組相比增加78.3%(n=5,P<0.05)，見(jiàn)圖1。

注：aP<0.05。圖1 無(wú)氧處理24 h后SGN caspase-3 mRNA表達(dá)上調(diào)

2.2缺氧對(duì)Kv在SGN表達(dá)的影響 進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在無(wú)氧環(huán)境下，SGN Kv1.1、Kv1.2及Kv3.1α亞單位mRNA表達(dá)水平均顯著上調(diào)；與對(duì)照組相比，其相對(duì)表達(dá)量分別增加3.71倍(n=5,P<0.05)、3.59倍(n=5,P<0.05)及4.33倍(n=5,P<0.05)，見(jiàn)圖2～4。

注：aP<0.05。圖2 無(wú)氧處理24 h后SGN Kv1.1 α亞基 mRNA表達(dá)上調(diào)

注：aP<0.05。圖3 無(wú)氧處理24 h后SGN Kv1.2 α亞基 mRNA表達(dá)上調(diào)

注：aP<0.05。圖4 無(wú)氧處理24 h后SGN Kv3.1 α亞基 mRNA表達(dá)上調(diào)

3 討 論

Kv主要由α和β兩種亞單位構(gòu)成。關(guān)于Kv的分類(lèi)，曾有多種不同分類(lèi)方法，但各有缺陷。按照最新的分類(lèi)方法，根據(jù)通道蛋白結(jié)構(gòu)和種系發(fā)生特點(diǎn)，將Kv分為3大類(lèi)38種亞型[7]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，神經(jīng)元對(duì)缺氧十分敏感。當(dāng)出現(xiàn)缺氧后，神經(jīng)元出現(xiàn)短暫的超極化后，神經(jīng)元迅速顯著地去極化，并伴隨鈣離子內(nèi)流，從而使神經(jīng)元過(guò)度興奮，加重缺氧引起的神經(jīng)元損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，缺氧后出現(xiàn)短暫超極化，主要是由于缺氧早期后，大量消耗ATP，對(duì)ATP十分敏感的ATP敏感型鉀通道開(kāi)放，鉀離子外流，細(xì)胞膜超極化，這可能有助于防止神經(jīng)元過(guò)度興奮而損傷。然而，隨著缺氧的持續(xù)，神經(jīng)元逐漸去極化，出現(xiàn)興奮毒性作用，此過(guò)程較為復(fù)雜，主要包括兩方面，抑制Kv，減少鉀離子外流，以及促進(jìn)鈉離子通過(guò)電壓門(mén)控性鈉通道或其他離子通道大量?jī)?nèi)流。如在海馬神經(jīng)元，缺氧后可使Kv2.1發(fā)生快速可逆的磷酸化反應(yīng)，鉀離子外流減少，使NMDA受體出現(xiàn)過(guò)度興奮，介導(dǎo)以鈣離子及鈉離子內(nèi)流為主要特征的興奮毒性作用。因此，有觀點(diǎn)認(rèn)為，激活Kv有助于防止缺氧后對(duì)神經(jīng)元造成的興奮毒性損傷。研究發(fā)現(xiàn)，氟吡啶作為Kv通道開(kāi)放劑，可減輕缺氧導(dǎo)致的神經(jīng)組織損傷，部分恢復(fù)由缺氧引起的學(xué)習(xí)及記憶能力受損[8]。然而，另有研究發(fā)現(xiàn)，缺氧后可使有活性的Kv離子通道增加，電流密度增加[9]?？梢?jiàn)在不同部位神經(jīng)元，缺氧后Kv的表現(xiàn)差異較大。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)所有Kv的亞型均在SGN上表達(dá)，其中Kv1.1、Kv1.2和Kv3.1在SGN是高表達(dá)，主要定位于基底回[6]。Kv1.1、Kv1.2主要介導(dǎo)低電壓激活的外向鉀電流，具有快速激活、快速失活的特點(diǎn)，使細(xì)胞膜電位保持在接近動(dòng)作電位閾值的狀態(tài)，有助于聽(tīng)神經(jīng)元高頻放電[10]。Kv3.1是介導(dǎo)延時(shí)整流外向電流的主要成分，有助于SGN膜電位快速?gòu)?fù)極化，有利于動(dòng)作電位的產(chǎn)生，因此也是確保聽(tīng)神經(jīng)元高頻放電的重要因素[11]。因此，Kv1.1、Kv1.2和Kv3.1在基底回高表達(dá)的原因，可能是有利于此處SGN易于高頻放電的原因。在本研究中，SGN處于無(wú)氧環(huán)境下處理24 h后，Kv1.1、Kv1.2和Kv3.1α亞單位mRNA表達(dá)均顯著上調(diào)，說(shuō)明長(zhǎng)時(shí)間嚴(yán)重缺氧，可上調(diào)Kv1.1、Kv1.2和Kv3.1在SGN的表達(dá)。由此可推測(cè)，增加神經(jīng)元放電頻率，將影響聽(tīng)神經(jīng)動(dòng)作電位的傳導(dǎo)，這可能是其引起聽(tīng)力下降的機(jī)制之一。

然而，本研究結(jié)果與既往文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果不同。有研究發(fā)現(xiàn)，急性缺氧(無(wú)氧處理5～15 min)后SGN的TEA敏感的BKCa電流大小增加，而4-AP敏感的Kv則無(wú)明顯改變，因此認(rèn)為介導(dǎo)缺氧對(duì)外向鉀通道電流作用的主要是BKCa，認(rèn)為Kv可能不參與此過(guò)程[2]。結(jié)合本研究結(jié)果，分析產(chǎn)生差異的原因，可能與缺氧處理時(shí)間不同有關(guān)。在本研究中，SGN持續(xù)處于無(wú)氧環(huán)境下24 h，屬于長(zhǎng)期嚴(yán)重缺氧；而文獻(xiàn)報(bào)道的無(wú)氧狀態(tài)最長(zhǎng)僅維持15 min，屬于短期急性缺氧。缺氧時(shí)間的不同，可能對(duì)SGN不同類(lèi)型鉀通道有不同的作用。推測(cè)在缺氧早期，主要影響SGN BKCa的功能，隨著缺氧持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)，可能進(jìn)一步影響Kv的表達(dá)，共同促使細(xì)胞膜電位超極化，抑制SGN放電，影響聽(tīng)覺(jué)動(dòng)作電位。

本研究還發(fā)現(xiàn)，缺氧后可以增加caspase-3的表達(dá)，這說(shuō)明缺氧可促進(jìn)SGN凋亡過(guò)程，導(dǎo)致SGN損傷。既往有研究發(fā)現(xiàn)，Kv與凋亡過(guò)程有關(guān)。如通過(guò)調(diào)控細(xì)胞膜表面Kv1.1及Kv1.3的表達(dá)及其電生理學(xué)特性，增加開(kāi)放頻率，促進(jìn)鉀離子外流，使胞質(zhì)鉀離子濃度降低，細(xì)胞內(nèi)容量降低，細(xì)胞皺褶，引起細(xì)胞凋亡過(guò)程[12]。另有研究也發(fā)現(xiàn)，敲除Kv1.1在細(xì)胞的表達(dá)，可增加抑制-Bcl的表達(dá)；而敲除Kv1.3，則減少caspase-3和促凋亡因子Bad的表達(dá)?？梢?jiàn)在凋亡過(guò)程中，Kv可影響caspase-3等凋亡相關(guān)因子的表達(dá)，從而影響凋亡過(guò)程[13]。因此，推測(cè)缺氧后SGN Kv1.1、Kv1.2和Kv3.1表達(dá)增加，增加鉀離子外流，可能引發(fā)caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程，加重SGN的損傷，這有待進(jìn)一步研究證實(shí)。