液相色譜法分析植物多糖中單糖組成及含量

王 成, 李真真, 邵世華, 甄榮英, 劉英學(xué), 馬紅偉, 袁 梅, 張麗燕， 王 芳, 蔣永毅

(青島菲優(yōu)特檢測有限公司,山東青島 266100)

多糖是由單糖和寡糖縮合而成的多聚物，在植物樣本中廣泛分布，植物多糖是植物細胞代謝產(chǎn)生的聚合度大于10的聚糖[1]。植物多糖具有抗腫瘤、降血糖、降血脂、提高機體免疫力等多種生物活性，且多糖的生物活性與其分子量和單糖組成緊密相關(guān)，多糖的單糖組成為植物多糖研究中的重要參數(shù)[2]。檢測多糖中單糖的組成及含量時，通常采用酸水解和酶水解的方法破壞糖苷鍵，將多糖水解成單糖，再對單糖進行檢測[1 - 3]。酸水解用于較難水解的單糖,酸水解反應(yīng)比較劇烈，可以水解大部分多糖，但反應(yīng)過程中容易發(fā)生降解[2]。目前多糖中單糖組成的檢測方法有液相色譜-質(zhì)譜法[2]、糖腈乙酸酯衍生化-氣相色譜法[4]、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生-液相色譜法[1,2]、3-氨基-9-乙基咔柱前衍生-液相色譜法等[5]。與質(zhì)譜相比液相色譜的紫外檢測器不易被污染，因此維護成本較低，其中PMP衍生柱前衍生法應(yīng)用最為廣泛[6 - 8]。由于多糖水解過程容易出現(xiàn)水解不充分、在酸作用下水解生成的單糖發(fā)生降解等情況[2]，因而使用PMP衍生-液相色譜法分析單糖時常出現(xiàn)回收率低、穩(wěn)定性差等問題而影響檢測的準確性。為此，本研究以海帶多糖為樣本，對多糖水解時間、PMP衍生物穩(wěn)定時間等因素進行探究，旨在找到單糖組成及含量分析的關(guān)鍵點，提高該方法的準確性和穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

標準品L-古羅糖醛酸、D-甘露糖醛酸、D-甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、巖藻糖(標準品純度>95%，上海安譜實驗科技股份有限公司)；三氟乙酸、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、NaOH、HCl、(分析純，中國醫(yī)藥集團有限公司)；三氯甲烷、甲醇、乙腈(色譜純，Merck Millipore)。本實驗中使用的樣品為市售海帶。

島津LC-20A液相色譜儀，帶紫外檢測器(島津企業(yè)管理(中國)有限公司)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；TDZ5-WS離心機(湘儀離心機儀器有限公司)；電子天平(XSE205，梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司)；真空干燥箱(DZF-6051，上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 分析方法

1.2.1 色譜條件色譜柱：UG120 C18(4.6 mm×250 mm×5 μm)，檢測波長：254 nm，柱溫：40 ℃，進樣量：20 μL。流動相A：0.05 mol/L KH2PO4溶液，加4 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值為6.8；流動相B：乙腈[8]。流動相洗脫程序為：0～25 min,85%～60%A;25～30 min,60%～85%A;30～36 min,85%A。

1.2.2 單糖水解及衍生方法的研究(1) 三氟乙酸水解時間對水解效率的影響：精密稱取0.2 g烘干后的海帶樣品于25 mL水解管中，加入10 mL 4 mol/L三氟乙酸，充氮后放入110 ℃烘箱中，分別水解0、0.5、1、1.5、2 h，冷卻后加入4 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至中性，加水定容到25 mL，取1 mL于10 mL離心管中，加0.3 mol/L NaOH溶液1 mL，加0.5 mol/L PMP(甲醇)1 mL，70 ℃水浴70 min，冷卻后加0.3 mol/L HCl 1 mL，加水定容到10 mL。取2 mL加入4 mL三氯甲烷凈化，離心后過膜待測[8 - 10]。

(2) 單糖水解損失率對比：精密量取0.5 mL 1 mg/mL標準品溶液于25 mL水解管中，加入10 mL 4 mol/L三氟乙酸，充氮后放入110 ℃烘箱中，分別水解0、0.5、1、1.5、2 h，冷卻后加入4 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值到中性，加水定容到25 mL，取1 mL于10 mL離心管中，加0.3 mol/L NaOH溶液1 mL，加0.5 mol/L PMP(甲醇)1 mL，70 ℃水浴70 min，冷卻后加0.3 mol/L HCl 1 mL，加水定容到10 mL。取2 mL 加入4mL三氯甲烷凈化，離心后過膜待測。

(3)真空干燥除酸單糖的熱損失率研究：精密量取0.05 mL 100 mg/L標準品溶液于10 mL離心管中，加入2 mL甲醇后放入60 ℃真空干燥箱中，烘干后加0.3 mol/L NaOH溶液0.5 mL，加0.5 mol/L PMP(甲醇)0.5 mL，70 ℃水浴70 min，冷卻后加0.3 mol/L HCl 0.5 mL，加水定容到5 mL。取2 mL加入4 mL三氯甲烷凈化，離心后過膜待測。

(4) PMP單糖衍生物穩(wěn)定性實驗：將10 mg/L標準品溶液分別在衍生后6、12、14、16、18、20 h進樣分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解用酸的選擇

用于水解多糖的酸有鹽酸、硫酸和三氟乙酸，鹽酸通常用于低聚糖的酸解制備，但在高溫條件下鹽酸具有強氧化性，會破壞多糖和已經(jīng)水解下來的單糖，水解損失率較大，反應(yīng)不易控制[1]。但是對于較難水解的單糖可以選擇用鹽酸水解，如殼寡糖中的氨基葡萄糖[11]。硫酸也具有強氧化性，而且還可與單糖發(fā)生反應(yīng)。三氟乙酸氧化性不強，對多糖的破壞較小，其帶有-CF基團，可以吸引更多氫離子，催化促進多糖的水解[1]。海帶等植物樣品中L-古羅糖醛酸、D-甘露糖醛酸、D-甘露糖、葡萄糖、半乳糖、巖藻糖的含量較高，且這些單糖比較容易水解，多糖水解成單糖后，單糖在酸的作用下會發(fā)生降解[2]，導(dǎo)致檢測結(jié)果偏低。為了降低海帶樣品的單糖水解損失率，選擇三氟乙酸對樣品進行水解。

2.2 水解時間對水解效率的影響

圖1為海帶樣品水解時間對水解效率的影響，由圖1可以看出，海帶樣品中游離單糖只有葡萄糖和半乳糖，且含量較小。隨著水解時間的增加，L-古羅糖醛酸、D-甘露糖醛酸、D-甘露糖、葡萄糖、半乳糖、巖藻糖的含量顯著增加。L-古羅糖醛酸和D-甘露糖醛酸最難水解，水解2 h時含量達到最大值，含量分別為8.53±0.21%和24.69±1.35%，且顯著高于1.5 h的含量，其含量分別為7.62±0.58%和22.73±0.85%。D-甘露糖和葡萄糖水解2 h時含量達到最大值，含量分別為1.07±0.87%和1.36±0.65%，但水解1.5 h后繼續(xù)水解含量增加不顯著。1.5 h時含量分別為0.86±0.12%和1.31±0.24%，半乳糖和巖藻糖最容易水解，水解1 h后含量沒有顯著增加。由此可以得出，各單糖的水解速率是不同的，確定水解時間時要綜合考慮各單糖的水解速率，由圖1可以得出，2 h時海帶樣品水解最為充分。

本實驗旨在研究單糖在高濃度三氟乙酸和高溫條件的降解比率。由圖2可以看出L-古羅糖醛酸和巖藻糖水解時含量顯著降低，水解0.5 h時L-古羅糖醛酸和巖藻糖的含量分別為90.5±2.09%和95.9±0.51%，水解2 h時分別降解到68.48±0.44%和91.6±2.11%，其它單糖沒有發(fā)生降解。因此可以得出，多糖水解成單糖后隨著水解時間的延長，游離單糖在三氟乙酸的作用下會發(fā)生降解，這與Matthew J等人的研究結(jié)果一致[2]。L-古羅糖醛酸的穩(wěn)定性最差，但植物樣品中L-古羅糖醛酸的水解速率較慢，減緩了L-古羅糖醛酸單糖的降解，對結(jié)果準確性影響不大。圖1中海帶巖藻糖在水解1 h時含量為11.18±1.09%，水解2 h后含量顯著下降到10.05±1.35%(P<0.05)，也是由于水解后游離的巖藻糖在三氟乙酸的作用下發(fā)生降解導(dǎo)致的。

D-甘露糖，鼠李糖，葡萄糖和半乳糖在水解0.5 h時含量顯著升高，L-古羅糖醛酸，D-甘露糖醛酸和巖藻糖在水解0.5 h時含量顯著降低，因此在水解初期，單糖在三氟乙酸的作用下可發(fā)生相互轉(zhuǎn)化[2]。但相互轉(zhuǎn)化比率較低，不超過10%，由單糖相互轉(zhuǎn)化引入的實驗誤差是可以接受的[9]。因此水解時間的確定需要分析各單糖的水解速率和水解后的降解速率，綜合考慮得出海帶樣品的最佳水解時間為2 h。

圖1 海帶樣品水解時間對水解效率的影響Fig.1 Effect of hydrolysis time on hydrolysis efficiency of kelp

圖2 水解時間對單糖損失率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time on loss rate of standard substance

2.3 水解后三氟乙酸去除方式的選擇

PMP需要在弱堿性條件下與單糖發(fā)生衍生，因此水解后需要去除三氟乙酸。目前去除三氟乙酸的方法有兩個，一是加堿中和除酸[6]，二是真空干燥除酸[5]。圖3為加堿除酸和真空干燥除酸對單糖損失率的影響，從圖中可以看出采用真空干燥除酸時單糖的損失較大，說明單糖在干燥狀態(tài)下的熱穩(wěn)定性不好，其中L-古羅糖醛酸和D-甘露糖醛酸全部降解，其它5種單糖的加標回收率為32.12%～46.67%。加堿中和除酸的空白加標回收率較好，為100.01%～103.20%。因此海帶樣品水解后應(yīng)采用加堿中和的方式去除三氟乙酸。

2.4 PMP衍生物穩(wěn)定性分析

圖4為PMP衍生物穩(wěn)定性分析，從圖4可以看出，12 h前7種單糖PMP衍生物沒有發(fā)生降解，12 h后7種單糖的空白加標回收率顯著下降(P<0.05)，14 h時7種單糖的回收率為61.20±1.45%～98.20±1.09%。巖藻糖的PMP衍生物降解比率最大，20 h后加標回收率只有44.29±1.35%。由此可以得出，樣品完成衍生后要在12 h之內(nèi)完成上機分析，分析一針樣品需要36 min，12 h可分析20針樣品，因此同時衍生的樣品數(shù)量不要超過20個。

圖3 加堿除酸和真空干燥除酸對單糖損失率的影響Fig.3 Effect of deacidification manners (adding alkali and vacuum drying) on monosaccharide loss rate

圖4 PMP衍生物穩(wěn)定性分析Fig.4 Stability analysis of PMP derivatives

2.5 方法檢出限、精密度及準確性分析

本研究對高效液相色譜法分析單糖的精密度進行評價,表1為7種單糖標準品(20 mg/L)連續(xù)進樣的相對標準偏差(RSD)和標準曲線r2。從表2可以看出，7種單糖連續(xù)進樣6針的RSD均小于2%，說明該方法穩(wěn)定性較好。GB/T 27404-2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》中規(guī)定：對于確證方法的標準曲線相關(guān)系數(shù)不應(yīng)低于0.99[12]。在線性范圍5～100 mg/L內(nèi)標準曲線r2均大于0.999，可以得出該方法的線性較好。液相分析時有雜質(zhì)干擾，因此將5倍信噪比設(shè)為檢出限，10倍信噪比設(shè)為定量限，7種單糖5倍信噪比的檢測濃度為0.8～1 mg/L，與王鳳芹等人的結(jié)果接近[12,13]，換算至樣品中單糖的檢出限為100～125 mg/kg。對海帶樣品進行加標回收實驗，加標水平為0.5%，樣品加標回收率為81.5%～91.2%，表明方法的準確性較好。

表1 單糖衍生物的標準方程、相關(guān)系數(shù)、檢測限及回收率

2.6 本文方法與文獻方法結(jié)果對比

圖5 文獻方法與本文方法單糖檢測結(jié)果對比Fig.5 Comparison of monosaccharide detection results between the literature method and the optimized method

圖5為液相色譜法分析海帶中單糖組成及含量文獻方法和本文方法的對比，文獻方法是參考Lv等人檢測茶中多糖[7]和Liu等人檢測茯苓多糖[8]的方法。文獻方法的前處理加入三氟乙酸后放入沸水浴中加熱6 h，冷卻后取出0.5 mL,加入2 mL甲醇后放入60 ℃真空干燥箱中烘干，真空干燥除酸后進行PMP衍生。由圖1可以看出，使用文獻方法檢測時L-古羅糖醛酸和D-甘露糖醛酸全部降解。本文方法的兩種單糖檢測結(jié)果分別為8.21±0.12%和25.76±0.29%。本文方法檢測D-甘露糖、葡萄糖、半乳糖、巖藻糖的含量顯著高于原有方法(P<0.05)。使用文獻方法時巖藻糖含量為1.28±1.24%，本文方法的含量為10.08±1.28%，由圖5可以看出，文獻方法檢測的D-甘露糖、葡萄糖、半乳糖、巖藻糖誤差大于本文方法，本文優(yōu)化后方法的數(shù)據(jù)平行性較好，適用于海帶樣品多糖的檢測。

3 結(jié)論

分析植物類樣品中單糖組成的關(guān)鍵控制點為：水解用酸，水解時間和單糖PMP衍生物穩(wěn)定時間。本實驗通過優(yōu)化海帶樣品中單糖的PMP柱前衍生化-液相色譜測定方法條件，找到了多糖水解單糖分析過程中的關(guān)鍵控制點。解決了單糖分析時常出現(xiàn)回收率低、穩(wěn)定性差等問題。為多糖樣品中單糖組成分析提供了新的方法優(yōu)化模式,可應(yīng)用于其它植物或動物多糖樣品中單糖組成的分析。