不同海拔高度和竹齡對黃甜竹葉精油成分及其生物活性的影響

陶士杰 宋艷冬 吳沁嬌 周宇峰 楊 杰

（1浙江農(nóng)林大學環(huán)境與資源學院，浙江杭州 311300；2麗水市農(nóng)林科學研究院，浙江麗水 323000；3福建省林業(yè)科學研究院，福建福州 350012）

植物精油是植物體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物，由分子量相對較小的化合物組成，可通過水蒸氣蒸餾進行提?。?］。研究表明，植物精油成分復雜，由幾十至上百種化合物組成，大都具有特殊香味，且具有一定的抗菌效果和抗氧化活性［2-4］。不同的植物精油具有不同的化學成分和生物活性，且同一種植物精油的化學成分和生物活性也往往會受植物自身年齡等內(nèi)部因素和海拔等外部環(huán)境的影響［5-7］。

竹子是一種重要的森林資源，挖掘其開發(fā)利用價值是當前竹產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級的前提和基礎。第九次森林資源清查結(jié)果顯示，中國竹資源豐富，竹林面積為641.16萬公頃，約占世界竹林總面積的20%［8］。黃甜竹（Acidosasa edulis）屬禾本科竹亞科酸竹屬，是一種優(yōu)質(zhì)的筍用竹種［9］。但黃甜竹葉的開發(fā)利用較少，造成了資源的較大浪費。關于竹葉精油，已有學者對部分竹種開展了相關研究，姚曦等［10］研究表明梁山慈竹竹葉精油對水稻自葉枯菌有很強的抑制能力。郭靜等［11］對淡竹葉和苦竹葉抗氧化活性做了分析，發(fā)現(xiàn)芹菜素和異葒草苷分別是淡竹葉和苦竹葉抗氧化活性的主要成分。Chuyen等［12］用二乙醚和乙酸乙酯溶劑對山白竹葉進行精油提取，發(fā)現(xiàn)山白竹葉精油具有很強的抑菌效果。而關于黃甜竹葉精油的化學成分鑒定以及抑菌效果和抗氧化活性的相關研究尚鮮見報道。為進一步了解黃甜竹葉精油的化學成分和生物活性，并探究海拔高度和竹子年齡對黃甜竹葉精油的化學成分和抑菌效果以及抗氧化活性的影響，本研究提取不同海拔的當年生新竹葉片（簡稱新葉）和非當年生竹葉片（簡稱老葉）精油后對其化學成分進行鑒定，并比較抑菌效果和抗氧化活性，以期為黃甜竹葉的進一步開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣地設置與樣品采集

試驗樣地設有3個海拔高度，分別為：高海拔（平均海拔800 m，浙江省麗水市縉云縣新建鎮(zhèn)魚川村）、中海拔（平均海拔560 m，浙江省麗水市云和縣霧溪畬族鄉(xiāng)礱頭村）和低海拔（平均海拔85 m，浙江省麗水市蓮都區(qū)白云街道城西村）。樣地均為2016年造林形成的竹林，坡度為15°～20°。每個樣地的種植土均為黃壤土，土層厚度為30～50 cm。土壤都經(jīng)過適當?shù)母牧继幚?，以保持樣地的土質(zhì)一致，且每個樣地的黃甜竹栽培管理技術也保持一致。每個海拔高度分別設置3個20 m×30 m的樣地作為重復。將各樣地內(nèi)的竹株分為兩個年齡段，分別為新竹（當年生竹）和老竹（非當年生竹），每個年齡段各選擇5株作為樣株。分別采集新竹樣株的葉片（簡稱新葉）和老竹樣株的葉片（簡稱老葉）各1 kg，采樣時間為2020年7月。

1.2 儀器與試劑

GX-05粉碎機，上海淀久中藥機械制造有限公司；ZNBC-CL程序控溫電熱套，鞏義市科瑞儀器有限公司；AB104-N電子分析天平，梅特勒托利多儀器上海有限公司；Trace GC/ISQ氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Thermo Fisher公司；57330-U手動固相微萃取進樣手柄、SAAB-57300U型聚二甲基硅氧烷萃取頭（100μm），上海安譜科學儀器有限公司。

分析純酒精，濟南鑫順化工有限公司。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：取洗凈去皮的馬鈴薯200 g，切成小塊，加水1 000 mL煮沸0.5 h，2層紗布過濾，加入稱量好的葡萄糖和瓊脂，攪拌均勻并溶解后，定容至1 000 mL，分裝于250 mL三角瓶中，121℃下0.1 MPa滅菌20 min，備用。葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）和干腐病菌（Fusarium）由麗水市農(nóng)林科學研究院提供。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH），上海通蔚實業(yè)有限公司。

1.3 樣品前處理

將新鮮竹葉在室內(nèi)自然陰干（2～3 d）后，放入40℃烘箱中烘干5 h，用粉碎機打碎后過40目篩，然后儲存于-40℃冰箱備用［13］。

1.4 竹葉精油提取與成分測定

參照文獻［13］，通過水蒸氣蒸餾法萃取竹葉精油。將50 g竹葉樣品置于1 L蒸餾瓶內(nèi)，加入400 mL水，用電熱套加熱至100℃，提取4 h。蒸餾液體用二氯甲烷萃取，然后置于通風櫥中，使二氯甲烷揮發(fā)完全。

提取完成后，用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）對精油成分進行分析。HP-5MS石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，膜厚0.25 μm）；程序升溫：柱初溫60℃，保持2 min，以30℃·min-1升溫 至190℃，再 以10℃·min-1升 溫至230℃，保持時間10 min；分流比10∶1；進樣量1μL；進樣口溫度180℃；輔助加熱器溫度280℃，質(zhì)譜EI離子源，電子能量70 eV，電子倍增器電壓1 250 V，掃描范圍30～500 m/z，譜庫NIST08。

1.5 抑菌試驗培養(yǎng)基制備及菌種培養(yǎng)

培養(yǎng)基制備采用PDA配制方法。

參照吳會杰等［14］的方法并稍作修改。取PDA培養(yǎng)基上28℃生長4～5 d（菌絲均勻布滿培養(yǎng)基）的葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）和干腐病菌（Fusarium），在菌落邊緣用直徑5 mm的無菌打孔器打取菌餅，并用接種針將菌餅移入涂有精油溶液培養(yǎng)基的中央。每菌株抑菌試驗重復3次，以不含精油溶液的空白PDA培養(yǎng)基為對照。28℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，采用十字交叉法測量菌絲生長直徑，取平均值。按照公式計算菌絲生長抑制率：

式中，I為菌絲生長抑制率，%；D0為空白對照菌落生長直徑；Dt為精油處理菌落生長直徑。

1.6 體外抗氧化活性測定

體外抗氧化活性測定采用DPPH法。將不同的竹葉精油樣品用無水乙醇稀釋，分別配置成濃度為5、2.5、1.25和0.625μL·mL-1的精油溶液。取不同濃度的精油溶液1 mL，加入1 mL配好的0.1 mmol·L-1DPPH乙醇溶液，搖勻后，放在暗處反應30 min，測定其在517 nm波長處的吸光度值；對照組以等體積的無水乙醇代替精油溶液測定吸光度值。每組重復3次并取平均值，參照諶迪等［15］的方法計算半抑制濃度（halfinhibitory concentration，IC50）值。

1.7 數(shù)據(jù)處理

用SPSS statistics 22統(tǒng)計分析軟件對所有試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（ANOVA analysis）。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃甜竹葉精油成分分析

按1.4中GC-MS條件對黃甜竹葉精油的化學成分進行分析，經(jīng)鑒定，共確定50種主要化學成分，其中烷類15種、醇類15種、萜烯類6種、芳香族化合物7種、酯類3種、酮類2種、醛類1種、酸類1種。

黃甜竹葉精油化學成分及相對含量如表1及圖1所示。從海拔高度來看，在高海拔葉片精油中，鑒定出34種成分，占總含量的94.23%，其中烷類占45.33%、醇類占12.34%、萜烯類占25.63%、芳香族占6.42%、酮類占3.35%、酯類占0.27%、醛類占0.30%、酸類占0.62%。其主要成分為1，7-二甲基-7-（4-甲基-3-戊烯基）-三環(huán)［2.2.1.0（2，6）］庚烷、（+）-喇叭烯、正己烷、氯代十八烷等。在中海拔葉片精油中，鑒定出37種成分，占總含量的95.42%，其中烷類占36.79%、醇類占11.62%、萜烯類占27.31%、芳香族占14.34%、酮類占2.91%、酯類占1.40%、醛類占1.06%。其主要成分為1，7-二甲基-7-（4-甲基-3-戊烯基）-三環(huán)［2.2.1.0（2，6）］庚烷、（+）-喇叭烯、2，3-二氫苯并呋喃、（1S-外）-2-甲基-3-亞甲基-2-（4-甲基-3-戊烯基）雙環(huán)［2.2.1］庚烷等。在低海拔葉片精油中，鑒定出38種成分，占總含量的94.80%，其中烷類占42.11%、醇類占23.24%、萜烯類占11.78%、芳香族占15.55%、酮類占0.63%、酯類占0.94%、醛類占0.55%。其主要成分為2，3-二氫苯并呋喃、3-己烯-1-醇、2，4-二甲基己烷、氯代十八烷等。

圖1 不同海拔和竹齡精油中各類成分相對含量Fig.1 Relative content of various components of essential oil at different altitudes and bamboo ages

表1 (續(xù))

表1 黃甜竹葉精油化學組分及相對含量Table 1 Chemical composition and relative content of Acidosasa edulis leaves essential oil /%

從竹齡上來看，在新葉精油中，鑒定出46種成分，占總含量的95.50%，其中烷類占35.46%、醇類占17.84%、萜烯類占23.77%、芳香族占14.10%、酮類占2.65%、酯類占0.60%、醛類占0.67%、酸類占0.41%。其主要成分為（+）-喇叭烯、2，3-二氫苯并呋喃、氯代十八烷、3-乙基-5-（2-乙基丁基）-十八烷等。在老葉精油中，鑒定出41種成分，占總含量的94.13%，其中烷類占47.36%、醇類占13.63%、萜烯類占19.38%、芳香族占10.10%、酮類占1.94%、酯類占1.13%、醛類占0.60%。其主要成分為1，7-二甲基-7-（4-甲基-3-戊烯基）-三環(huán)［2.2.1.0（2，6）］庚烷、（1S-外）-2-甲基-3-亞甲基-2-（4-甲基-3-戊烯基）雙環(huán)［2.2.1］庚烷、（+）-喇叭烯、2，3-二氫苯并呋喃等。

綜上，在竹葉精油中檢測并鑒定出多種成分，主要分為烷類、萜烯類、醇類和芳香族化合物四類。不同海拔和竹齡竹葉精油的主要化學成分基本相同，差異主要體現(xiàn)在各成分的含量上。從海拔高度來看，中高海拔下的竹葉精油中萜烯類化合物相對含量較高；從竹齡來看，新葉中的醇類、萜烯類和芳香族化合物相對含量較高。

2.2 黃甜竹葉精油的抑菌效果

由表2可知，從海拔高度來看，在高海拔、中海拔和低海拔下，黃甜竹葉精油對干腐病菌的抑制率分別為36.03%、34.82%和9.31%；對葡萄座腔菌的抑制率分別為34.81%、28.45%和18.06%。高海拔的黃甜竹葉精油對干腐病菌的抑制率比低海拔的黃甜竹葉精油高26.72個百分點，中海拔的黃甜竹葉精油對干腐病菌的抑制率比低海拔的黃甜竹葉精油高25.51個百分點，可見中高海拔竹葉精油抑菌效果強于低海拔。從竹齡來看，黃甜竹新葉精油對干腐病菌和葡萄座腔菌的抑制率分別為47.15%和41.55%，黃甜竹老葉精油對干腐病菌和葡萄座腔菌的抑制率分別為6.29%和12.66%。新葉精油對干腐病菌和葡萄座腔菌的抑制率比老葉精油分別高40.86和28.89個百分點，可見黃甜竹新葉精油的抑菌效果強于老葉。

表2 不同海拔和竹齡精油的抑菌效果Table 2 Bacteriostatic effect of essential oil at different altitudes and bamboo ages /%

由圖2可知，同一海拔高度下，黃甜竹新葉精油對干腐病菌和葡萄座腔菌的生長抑制作用均顯著高于老葉精油。在3個不同海拔高度下，黃甜竹新葉精油對干腐病菌的生長抑制率表現(xiàn)為中海拔>高海拔>低海拔，且不同海拔間差異顯著；隨著海拔高度的增加，黃甜竹老葉精油對干腐病菌和葡萄座腔菌兩種菌種的生長抑制率均顯著增加。

圖2 黃甜竹葉精油對干腐病菌和葡萄座腔菌的抑制效果Fig.2 Inhibition of Fusarium and Botryosphaeria dothidea by Acidosasa edulis leaves essential oil

2.3 黃甜竹葉精油抗氧化活性

黃甜竹葉精油清除DPPH自由基的能力可以用半抑制濃度（IC50）來表示，IC50值越小，表明精油對DPPH自由基的清除能力越強，抗氧化活性越好。由表3可知，從海拔高度上看，高海拔和中海拔下黃甜竹葉精油的IC50值分別為2.889和0.473 μL·mL-1，而低海拔下黃甜竹葉精油的IC50值小于0.001μL·mL-1?？梢?，低海拔地區(qū)的黃甜竹葉精油抗氧化活性最強，中海拔地區(qū)次之，高海拔地區(qū)最弱。從竹齡上看，黃甜竹新葉精油和老葉精油的IC50值分別為0.115和1.715μL·mL-1?？梢?，黃甜竹新葉精油的抗氧化活性強于老葉。

表3 不同海拔和竹齡竹葉精油的半抑制濃度值Table 3 The half-inhibitory concentration of Acidosqsq edulis leaves essential oil at different altitudes and bamboo ages

由圖3可知，在精油溶液濃度為2.5μL·mL-1及以下時，相同精油溶液濃度不同海拔黃甜竹新老葉精油之間的DPPH自由基清除率整體差異顯著，當精油溶液濃度為0.625μL·mL-1時，低海拔新葉的DPPH自由基清除率最高，高海拔老葉的DPPH自由基清除率最低，除高海拔新葉和中海拔老葉外，其余各葉片精油對DPPH自由基的清除率均存在顯著差異?？偟膩砜矗腿芤簼舛仍酱?，各海拔黃甜竹新老葉精油對DPPH自由基的清除率越高，抗氧化活性越強。

圖3 不同濃度下黃甜竹葉精油的抗氧化活性Fig.3 Antioxidant activity of Acidosasa edulis leaves at different concentrations

3 討論

本研究采用GC-MS技術，以高、中、低海拔地區(qū)的黃甜竹新老葉為原料進行黃甜竹精油提取，并用二氯甲烷萃取后進行成分分析，共鑒定出50種主要成分，以烷類、萜烯類、醇類和芳香族化合物等為主，且烷類物質(zhì)占比較大，這與何躍君［16］和呂兆林等［17］的研究結(jié)果相似，但具體種類和含量存在一定的差異，主要原因可能與竹種不同有關。同時，本研究在中高海拔的竹葉精油中檢測出更多含量的萜烯類物質(zhì)，這與Martz等［18］和Said等［19］的結(jié)論一致?？赡苁怯捎谕饨绛h(huán)境對植物內(nèi)部生理因素產(chǎn)生了作用，如海拔的變化會導致溫度、相對濕度、可用水量和輻射率產(chǎn)生相應變化；中高海拔地區(qū)的溫度更高，濕度更低，使植物中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的含量增加，從而抑制光合作用；為了保護細胞和光合器官，植物體內(nèi)會生成更多萜烯類物質(zhì)來減少脂質(zhì)過氧化、抑制NO釋放和ROS生成［19-20］。

許多植物具有廣譜的抑菌性，而真正具有抑菌效果的是植物精油［21］。與化學抑菌劑相比，植物精油在食品中的副作用小、殘留毒性小，是開發(fā)新型高效低毒天然香料、防腐殺菌劑的重要來源［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，竹葉精油中的萜烯類、醇類和酮類是發(fā)揮抑菌效果的主要化合物，且相同化合物對不同菌株表現(xiàn)出不同的抑制功效，這與前人研究結(jié)果相吻合［22-24］。另外，化合物的抑菌效果可能與其所含不飽和鍵的種類和數(shù)量有關，富含不飽和雙鍵的醇、醛、酮、酸類和萜烯類化合物可能對抑菌效果起著重要作用［22］。這些因素可能是黃甜竹葉精油起到抑菌效果的主要原因。本研究還發(fā)現(xiàn)，中高海拔黃甜竹新葉精油中的萜烯類和酮類化合物含量相比于低海拔黃甜竹老葉含量更多，體現(xiàn)出更強的生物活性和抑菌效果，劉林芳［6］的研究也得出了類似的結(jié)論。另外，姚永紅等［23］和楊萍等［24］研究指出竹葉精油中某些單一組分發(fā)揮著抑菌效果，而將這些單一組分混合之后，抑菌效果會得到提升。由此推測精油的抑菌效果是其所有抑菌組分及其他單獨抑菌效果不明顯的微量元素協(xié)同作用的結(jié)果，但具體的抑菌作用機制還需進一步深入探討。

植物精油的抗氧化活性可能在一些疾病的預防中發(fā)揮重要作用，如腦功能障礙、癌癥、心臟病和免疫系統(tǒng)衰退等［25］。本研究發(fā)現(xiàn)，黃甜竹葉精油體現(xiàn)出較強的抗氧化活性是因為竹葉精油的組成為醇類、酚類和酮類等具有各種官能團的化合物。梁榮等［26］研究指出酚類化合物的鄰位酚羥基極易被氧化成醌類結(jié)構(gòu)，并能捕捉環(huán)境中的自由基，因此酚類化合物具有很強的抗氧化活性。何躍君等［27］研究也指出竹葉精油中含有許多不飽和的醇、醛、酮、酸和萜烯類化合物，這些化合物具有抗氧化活性。本研究分析黃甜竹葉精油的物質(zhì)組成，推測凡是可以與自由基進行反應，使自由基形成穩(wěn)定狀態(tài)的成分都有可能起到清除DPPH自由基的作用，這與Priyadarsini等［28］的研究結(jié)論一致。另外，本研究結(jié)果顯示，低海拔地區(qū)黃甜竹葉精油的抗氧化活性強于中高海拔兩地，可能是由于低海拔地區(qū)黃甜竹葉精油中的醇類和芳香族化合物含量較高，具有更多的酚基及環(huán)結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)是抗氧化活性的重要基礎，這也與何躍君［16］的研究結(jié)論相吻合。而具體是哪種或哪些組分起到黃甜竹葉精油抗氧化活性的決定性作用，還需進一步深入研究。

4 結(jié)論

本研究分析鑒定了高、中、低三處不同海拔黃甜竹新老葉精油的化學成分，并比較了其抑菌效果和抗氧化活性。結(jié)果表明，在黃甜竹葉精油中檢測到烷類、萜烯類、醇類和芳香族化合物等多種化合物；黃甜竹葉精油具有較強的抑菌效果和抗氧化活性，且中高海拔黃甜竹葉精油的抑菌效果高于低海拔黃甜竹葉精油，新葉精油的抑菌效果和抗氧化活性高于老葉精油。因此，在黃甜竹葉精油的開發(fā)利用中，應優(yōu)先考慮中高海拔的新葉。