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    云南省石榴干腐病病菌生物學(xué)特性研究及其防治藥劑篩選

    2017-02-27 10:58魯海菊李河史淑義
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年1期
    關(guān)鍵詞:干腐病生物學(xué)特性石榴

    魯海菊+李河+史淑義

    摘要:以石榴干腐病病菌SGF1為供試菌株,采用菌絲生長速率法測定不同培養(yǎng)基、碳源、氮源、溫度、酸堿度、光照和濕度對其菌絲生長的影響,用血球計數(shù)板計測產(chǎn)孢量,并在室內(nèi)篩選有效抑菌藥劑。結(jié)果表明,該病原菌菌絲生長最佳培養(yǎng)條件為PDA培養(yǎng)基、以可溶性淀粉為碳源、蛋白胨為氮源、28 ℃、pH值為7、全光照、相對濕度60%。BA培養(yǎng)基、28 ℃、pH值8最適合產(chǎn)孢。58%甲霜靈·錳鋅可濕性粉劑、75%百菌清可濕性粉劑和50%撲海因可濕性粉劑3種藥劑抑菌效果最好,抑制率達(dá)100%。研究結(jié)果為云南石榴干腐病的防治提供了一定的理論依據(jù)。

    關(guān)鍵詞:石榴;干腐?。簧飳W(xué)特性;藥劑篩選

    中圖分類號: S436.65 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號:1002-1302(2017)01-0099-04

    石榴(Punia granatum)是滇南主要水果之一。云南省蒙自市由于北回歸線穿境而過,獨特的氣候條件適宜石榴種植,曾獲“中國石榴之鄉(xiāng)”的美譽(yù)。目前蒙自市石榴栽種面積躍居全國首位,然而隨著栽種面積不斷擴(kuò)大,石榴受到各種真菌病害的危害,嚴(yán)重影響其品質(zhì)和產(chǎn)量。蒙自市石榴干腐病在1979年,戴芳瀾先生的《中國真菌總匯》中早有記載[1]。1999年,周又生等研究蒙自市石榴干腐病發(fā)生規(guī)律及其防治,使蒙自市石榴干腐病得到有效控制[2]。2011年,蒙自市石榴干腐病再次暴發(fā)流行。據(jù)文獻(xiàn)記載蒙自市石榴干腐病由石榴鮮殼孢(Zythia versoniana)引起[1,3],而陜西省報道的石榴干腐病由石榴墊殼孢菌(Coniella granati)引起[4]。由此可見,不同地區(qū)石榴干腐病病菌種屬分類地位不同,其生物學(xué)特性也會存在差異。周又生等研究蒙自市石榴干腐病病菌生物學(xué)特性,僅限于溫度、濕度和pH值3個方面[2],未對其碳源、氮源、光照等方面進(jìn)行系統(tǒng)研究,防治化學(xué)藥劑也僅限于百菌清、甲基硫菌靈、代森鋅和波爾多液。鑒于此,筆者對蒙自市石榴干腐病病菌生物學(xué)特性及其抑菌劑做系統(tǒng)研究,以期為有效防控該病提供系統(tǒng)理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 供試菌株

    從云南省蒙自市石榴種植基地采集癥狀典型的石榴干腐病病果,采用常規(guī)組織分離和單孢分離法進(jìn)行分離純化,獲得的菌株(SGF1)于斜面培養(yǎng)基上低溫(4 ℃)保存。

    1.2 供試培養(yǎng)基

    PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基):馬鈴薯200 g、葡萄糖16 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水1 L;PSA(馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基):馬鈴薯200 g、蔗糖16 g、瓊脂粉 20 g、蒸餾水1 L;MA(玉米瓊指培養(yǎng)基):玉米30 g、瓊脂粉17 g、蒸餾水1 L;WA(燕麥瓊脂培養(yǎng)基):小麥30 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水1 L;CA(胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基):胡蘿卜200 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水1 L;CM(查氏培養(yǎng)基):硝酸鈉2.00 g、磷酸二氫鉀1.00 g、氯化鉀0.50 g、七水硫酸鎂0.50 g、硫酸鐵0.01 g、蔗糖30.00 g、瓊脂粉 20 g、蒸餾水1 L;BA(大豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基):大豆200 g、葡萄糖16 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水1 L;WJA(萬壽菊葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基):萬壽菊植株200 g、葡萄糖16 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水1 L。上述培養(yǎng)基配制好后均121 ℃高壓滅菌25 min。

    1.3 試劑

    碳源(可溶性淀粉、α-乳糖、麥芽糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖醇、D-甘露醇)、氮源(硫酸銨、硝酸銨、磷酸二氫銨、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、甘氨酸、尿素)。0.1% HCl、0.1% NaOH溶液,試劑均為分析純。

    1.4 供試殺菌劑

    甲霜靈·錳鋅、多菌靈、甲基硫菌靈、百菌清、撲海因、春雷霉素。上述材料均購自農(nóng)貿(mào)市場及試劑公司。

    1.5 不同培養(yǎng)基對菌絲生長的影響

    將石榴干腐病病菌在PDA平板培養(yǎng)基中,28 ℃擴(kuò)大培養(yǎng)7 d,在培養(yǎng)基同一半徑周圍用打孔器取直徑為5 mm的菌塊,同時接種于PDA、PSA、CM、MA、WA、CA、BA和WJA 8種培養(yǎng)基平板中央,設(shè)3次重復(fù),在25 ℃下恒溫培養(yǎng)7 d,十字交叉法測定菌落直徑,用血球計數(shù)板計數(shù)產(chǎn)孢量[5]。

    1.6 不同碳、氮源對菌絲生長的影響

    以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,分別用相等質(zhì)量分?jǐn)?shù)的碳源(可溶性淀粉、α-乳糖、麥芽糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖醇、D-甘露醇)和氮源(硫酸銨、硝酸銨、磷酸二氫銨、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、甘氨酸、尿素)替換蔗糖和硝酸鈉,設(shè)不加碳源、氮源為對照。接種及測量方法同“1.5”節(jié)。

    1.7 不同溫度對菌絲生長的影響

    以PDA為供試培養(yǎng)基,接種后分別在10、15、20、25、30、35、40 ℃下恒溫培養(yǎng)[5],接種及測量方法同“1.5”節(jié)。

    1.8 不同pH值對菌絲生長的影響

    以PDA為供試培養(yǎng)基,分別用0.1% HCl及0.1%NaOH溶液將pH值調(diào)至3、4、5、6、7、8、9、10[5],接種及測量方法同“1.5”節(jié)。

    1.9 光照對菌絲生長的影響

    以PDA為供試培養(yǎng)基,接種后分別在光—暗周期為 12 h—12 h、全黑暗和全光照3種光處理下培養(yǎng)[5],接種及測量方法同“1.5”節(jié)。

    1.10 不同濕度對菌絲生長的影響

    將病菌接種于PDA培養(yǎng)基平板中央,分別在相對濕度為50%、60%、70%、80%、90%、100%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d[5],測量方法同“1.5”節(jié)。

    1.11 藥敏性測定

    將58%甲霜靈·錳鋅、50%多菌靈、70%甲基硫菌靈、75%百菌清、50%撲海因、6%春雷霉素6種可濕性粉劑殺菌劑按照使用說明上的濃度配成PDA含藥營養(yǎng)液后倒平板,將石榴干腐病病菌菌塊接種于平板中央,設(shè)不加藥液的PDA平板為對照,培養(yǎng)7 d后,測量菌落直徑,并計算6種藥劑對菌落生長的抑制率[5],接種及測量方法同上。

    抑制率=[(dCK-dB)/dCK]×100%。

    式中:dCK表示對照病原菌菌落直徑,dB表示處理病原菌菌落直徑。

    1.12 數(shù)據(jù)分析

    所有試驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件Duncans多重比較法進(jìn)行統(tǒng)計分析,計算處理間的差異顯著性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同培養(yǎng)基對菌絲生長及其產(chǎn)孢的影響

    由表1可知,供試菌株SGF1均能在8種不同培養(yǎng)基上生長,具有較強(qiáng)的營養(yǎng)適應(yīng)性,說明供試菌株對營養(yǎng)條件的要求并不是很嚴(yán)格,但對8種培養(yǎng)基的利用效果有所差異。經(jīng)Duncans多重比較發(fā)現(xiàn),供試菌株在8種不同培養(yǎng)基上的菌落直徑差異極顯著,其中,在PDA培養(yǎng)基上生長最快,在CM培養(yǎng)基上生長最慢。在其余6種培養(yǎng)基上的生長強(qiáng)弱順序為PSA>WJA>WA>CA>BA>MA。另外,在8種培養(yǎng)基中,病菌SGF1產(chǎn)孢量差異極顯著,其中,在BA培養(yǎng)基中產(chǎn)孢最多,在CM上不產(chǎn)孢。因此,最適合該病菌菌絲生長的培養(yǎng)基為PDA,最適合產(chǎn)孢的培養(yǎng)基為BA。

    2.2 不同碳源對菌絲生長的影響

    由表2可知,除在D-甘露醇和無碳源對照中不能生長之外,供試菌株SGF1在其余6種不同碳源培養(yǎng)基上均能生長,經(jīng)Duncans多重比較發(fā)現(xiàn),麥芽糖和葡萄糖中菌落直徑差異不顯著,但與其余碳源差異極顯著。α-乳糖、鼠李糖和木糖醇3個處理間的菌落直徑差異極顯著,菌落直徑大小順序為α-乳糖>鼠李糖>木糖醇??扇苄缘矸壑芯渲睆脚c其余所有供試碳源差異極顯著,且菌落直徑最大。說明可溶性淀粉最有利于其菌絲生長。

    2.3 不同氮源對菌絲生長的影響

    由表3可知,供試菌株SGF1在8種氮源培養(yǎng)基上均能生長。但其對氮源的利用效果不同。經(jīng)Duncans多重比較發(fā)現(xiàn),蛋白胨中菌落直徑與其余氮源差異極顯著,且菌落直徑最大。其中,硫酸銨、硝酸銨、甘氨酸和尿素中菌落直徑小于對照,表明這4種氮源對其有抑制作用。其余4種氮源對供試菌株生長有促進(jìn)作用,蛋白胨最有利于其菌絲生長。

    2.4 不同溫度對菌絲生長及產(chǎn)孢的影響

    由表4可知,供試菌株SGF1在10~35 ℃范圍內(nèi)均能生長。經(jīng)Duncans多重比較發(fā)現(xiàn),各溫度處理間的菌落直徑差異極顯著。在10~28 ℃范圍內(nèi),溫度越高菌落直徑越大,28 ℃ 時菌落直徑達(dá)到最大值,30 ℃和35 ℃時菌落直徑小于28 ℃時,40 ℃時菌落直徑為0.00 mm。另外,28 ℃時產(chǎn)孢量與其余溫度差異極顯著,且產(chǎn)孢量最大。25 ℃和30 ℃時差異極顯著,產(chǎn)孢量均小于28 ℃時。其余溫度下產(chǎn)孢量均為0,說明28 ℃是供試菌株菌絲生長及產(chǎn)孢的最佳溫度。

    2.5 不同pH值對菌絲生長及產(chǎn)孢的影響

    由表5可知,供試菌株SGF1在pH值3~10范圍內(nèi)均能生長。經(jīng)Duncans多重比較發(fā)現(xiàn),pH值為7時與其余處理間菌落直徑差異極顯著,且菌落直徑最大,說明pH值7為菌絲生長最佳酸堿度值。pH值6、pH值8、pH值9,3個處理間菌落直徑差異均不顯著,pH值3和pH值4這2個處理間菌落直徑差異不顯著,其余處理間菌落直徑差異極顯著。pH值8產(chǎn)孢量與其余處理差異極顯著,且產(chǎn)孢量最大。因此,中性偏堿環(huán)境有利于供試菌株菌絲生長及產(chǎn)孢。

    2.6 不同光照對菌絲生長的影響

    由表6可知,供試菌株SGF1在3種不同光照條件下均能生長。經(jīng)Duncans多重比較發(fā)現(xiàn),3種處理間菌落直徑差異極顯著,且全光照菌落直徑最大,光暗交替菌落直徑最小,全黑暗居中。說明全光照最有利于其生長。

    2.7 不同濕度對菌絲生長的影響

    由表7可知,供試菌株SGF1在相對濕度50%~100%范圍內(nèi)均能生長。經(jīng)Duncans多重比較發(fā)現(xiàn),相對濕度60%與其余處理間菌落直徑差異極顯著,且菌落直徑最大。說明供試菌株最適合的濕度為60%。超出此范圍,病菌的生長受到抑制。

    2.8 石榴干腐病菌藥敏性試驗

    由表8、圖1可知,6種藥劑對供試菌株SGF1的抑制作用不同。經(jīng)Duncans多重比較發(fā)現(xiàn),在58%甲霜靈·錳鋅可濕性粉劑、75%百菌清可濕性粉劑和50%撲海因可濕性粉劑的培養(yǎng)基中菌落直徑差異不顯著,但與其余處理間差異極顯著,病菌均不能生長,抑制率達(dá)到100%。50%多菌靈可濕性粉劑、70%甲基硫菌靈可濕性粉劑和6%春雷霉素3種藥劑之間菌落直徑差異極顯著,抑制率在25%~55%之間。說明抑菌效果最好的藥劑為58%甲霜靈·錳鋅可濕性粉劑、75%百菌清可濕性粉劑和50%撲海因可濕性粉劑。

    3 結(jié)論與討論

    對石榴干腐病病菌SGF1菌株生物學(xué)特性的研究表明,最適培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基、最佳碳源為可溶性淀粉、氮源為蛋白胨、最適溫度為28 ℃、最佳酸堿度為pH值7、全光照、最適相對濕度為60%。其對溫度和pH值的要求與周又生等[2]、寧豫婷等[6]、孫德茂[7]的研究結(jié)果一致。濕度的研究結(jié)果與孫德茂的結(jié)論[7]不一致,原因是蒙自市和陜西省2地石榴干腐病病菌種屬分類地位不同。石榴干腐病屬于世界性病害,中國山西[8]、山東[9]、陜西[4]、河南[10]、安徽[11]、貴州[12]、云南[2]等省份均有報道。其中,河南[6,10,13]、貴州[11]、云南[2]的石榴干腐病病菌為石榴鮮殼孢,陜西省報道的石榴干腐病病菌為石榴墊殼孢菌[4]。希臘[14]和韓國[15]的石榴干腐病病菌與中國陜西省的一致。中國其他省份的石榴干腐病病菌尚未見系統(tǒng)鑒定,對其生物學(xué)特性也未見系統(tǒng)研究報道。筆者研究發(fā)現(xiàn),光照對病菌生長有影響,可溶性淀粉為最佳碳源,蛋白胨為最佳氮源,硫酸銨、硝酸銨、甘氨酸和尿素4種氮源對其病菌有抑制作用,磷酸二氫銨對其病菌生長有促進(jìn)作用。因此,在石榴上施用氮肥可選擇硫酸銨、硝酸銨、甘氨酸和尿素,避免施用磷酸二氫銨。

    另外,在室內(nèi)藥劑篩選方面,甲霜靈·錳鋅、百菌清和撲海因3種藥劑對SGF1菌株抑制效果最好,抑制率均達(dá)100%,其他3種藥劑抑菌效果不理想,抑制率均小于60%。這與孫德茂[7]、湯玉等[10]、周又生等[2]、孫國山[16]的研究結(jié)果不盡相同。百菌清防治效果好,這一結(jié)論與周又生等的研究結(jié)論[2]一致,多菌靈防效與左振琴等的研究結(jié)果[13]不一致。說明不同地區(qū)使用的有效藥劑不盡相同。有必要對當(dāng)?shù)匕l(fā)生的石榴干腐病進(jìn)行藥劑篩選。蒙自地區(qū)石榴干腐病可選用甲霜靈·錳鋅、百菌清和撲海因防治。

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